Способ получения из яичников животных вещества, восстанавливающего репродуктивную функцию

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при выделении биологически активных веществ из органического сырья. В основу изобретения положена задача повышения специфической активности целевого продукта. Способ получения из яичников животных вещества, восстанавливающего репродуктивную функцию, включает обработку измельченных яичников уксусной кислотой при pH 2,5 - 4,0 в течение 24 - 36 ч при температуре 0 - 4^oС с добавлением 0,3 - 0,7 г/л хлористого цинка, осаждение полипептидов ацетоном в количестве 8 - 12 об./об. экстракта при температуре (-2) ^oC (-8)^oС в течение 10 - 16 ч, отделение осадка фильтрованием, сушку, растворение осадка в дистиллированной воде, фильтрацию и лиофилизирование. 11 табл.

Изобретение относится к медицинской промышленности и медицине и касается выделения биологически активных веществ из органического сырья.

Известны способы получения биологически активных веществ из органического сырья (мочи беременных женщин, мочи женщин в постменопаузе, сыворотки крови жеребых кобыл) с целью восстановления репродуктивной функции у женщин.

Недостатком этих способов является то, что все эти вещества (хорионический гонадотропин, менопаузальный гонадотропин, гонадотропин сыворотки крови жеребой кобылы) обладают сильно выраженным гормональным действием, дают кратковременный эффект и имеют многочисленные осложнения (гиперстимуляция яичников вплоть до апоплексии, эндокринные нарушения, многоплодная беременность, самопроизвольные аборты и др.).

Наиболее близким по совокупности признаков является способ получения вещества, восстанавливающего репродуктивную функцию, из семенников половозрелого скота, включающий обработку сырья уксусной кислотой, осаждение ацетоном, растворение осадка в воде с последующими фильтрацией и высушиванием целевого продукта [1] Вещество, полученное этим способом, не обладает гормональной активностью и восстанавливает репродуктивную способность самцов.

В основу изобретения положена задача повышения специфической активности целевого продукта.

Сущность изобретения заключается в выделении вещества, не обладающего гормональной активностью, способного восстанавливать репродуктивную функцию самок и отличного от вещества, полученного по способу-прототипу. Для получения этого вещества проводят обработку измельченных яичников животных уксусной кислотой при рН 2,5-4,0 в течение 24-36 ч при температуре 0-4^оС с добавлением 0,3-0,7 г/л хлористого цинка. Осаждение полипептидов проводят ацетоном в количестве 8-12 об./ /об. экстракта при температуре (- 2)-(- 8)^оС в течение 10-16 ч. Осадок отделяют фильтрованием, сушат, после чего вновь растворяют в дистиллированной воде, фильтруют и лиофилизируют.

Способ позволяет получить комплекс полипептидов с мол.м. 1000-10000 Да, способных восстанавливать репродуктивную функцию самок и не обладающих гормональной активностью. Для исключения развития аллергических реакций на препарат его освобождают от фракций с мол.м. выше 15000 Да. С этой целью раствор продукта в дистиллированной воде фильтруют и подвергают ультрафильтрации через полые волокна или фильтры. Ультрафильтрат лиофилизируют. Были получены следующие данные, свидетельствующие о полипептидной природе целевого продукта: 1.Наличие цветной реакции с биуретовым реактивом.

2. Молекулярная масса компонентов, определенных с помощью гель-хроматографии, составила 1000-10000 дальтон.

3.Полученный комплекс веществ состоит из 9 пептидных фракций, выделенных с помощью электрофореза в тонком слое агарозы.

4. Аминокислотный анализ вещества показал, что в состав полученного продукта входят 20 видов аминокислот в определенном соотношении.

5. Изоэлектрические точки пептидных фракций полученного вещества находятся в пределах 3,2-9,4 единиц рН.

6. Основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете 250-380 нм (спектрофотометрически).

Обработка измельченного сырья в присутствии уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка позволяет полностью провести гидролиз крупных белков и выделить вещество с высокой степенью очестки. Разрыв клеточных стенок обеспечивает рН 2,5-4,0 и время обработки 24-36 ч, при этом температура 0-4^оС обеспечивает сохранение специфического начала. Повторное растворение в ацетоне и фильтрация позволяют избавиться от денатурированных белков и нерастворимых фосфолипидов. Этап ультрафильтрации позволяет получить полипептиды с мол.м. не выше 15000 Да, не обладающие аллергизирующим воздействием, что достигается очисткой раствора на разделительном аппарате АР-02 (Кириши, ОКБ тонкого биологического машиностроения) с поверхностью фильтрации 0,2 м², через полые волокна ВПУ-15ПА (ТУ 6-06-31-529-86). Процесс очистки проводят при комнатной температуре, давлении 0,55-0,6 кгс/см² и скорости движения раствора 0,22-0,25 см/с. Представленные параметры этапов экстракции определяют возможность максимального выхода полипептидов с мол.м. 1000-10000 Да, которые обладают наибольшей способностью восстанавливать репродуктивную функцию. Эти оптимальные параметры полученного вещества были определены при изучении различных режимов экстракции на выход полипептидов с мол.м. 1000-10000 Да. Результаты проведенных исследований представлены в табл.1-8.

Из табл.1 видно, что для получения вещества из яичников с мол.м. 1000-10000 Да и 9 пептидных фракций необходима концентрация хлористого цинка 0,3-0,7 г/л. Выбирают минимальные затраты 0,3 г/л для получения вещества.

Как следует из данных, представленных в табл.2, наилучшие результаты по экстракции полипептидов с мол.м. 1000-10000 Да имеют место при рН 2,5-4,0. Более высокие значения рН приводят к недостаточному выходу компонентов, а при более низких значениях происходит гидролиз полипептидов.

Из табл. 3 следует, что оптимальная экстракция вещества с мол.м. 1000-10000 Да происходит в течение 24-36 ч. Снижение затрат времени ведет к недостаточной экстракции, а увеличение к гидролизу полипептидов.

Из табл.4 видно, что экстракция, при которой имеет место выход вещества с мол. м. 1000-10000 Да, происходит при температурном режиме 0-4^оС. При осаждении биологически активных веществ из супернатанта ацетоном растворяются липиды, которые уходят с ацетоном при фильтрации. При этом, как следует из данных, приведенных в табл.5-7, наибольший выход вещества происходит при обработке экстракта ацетоном в количестве 8-12 об./об. экстракта при температуре (- 2)-(- 8)^оС в течение 10-16 ч.

Как следует из табл.8, получить 9 фракций полипептидов массой 1000-10000 дальтон можно при ультрафильтрации растворенного осадка при давлении 0,55-0,6 кгс/см² и скорости ультрафильтрации 0,22-0,25 см/с.

Способ получения вещества, восстанавливающего репродуктивную функцию, иллюстрируется следующими примерами: П р и м е р 1. Берут 4 кг замороженной ткани яичников крупного рогатого скота, измельчают на волчке. Сырье заливают 6-8 частями раствора уксусной кислоты до рН 2,5. Добавляют 0,3 г/л хлористого цинка и включают мешалку. Экстракцию проводят при 2^оС в течение 36 ч при постоянном перемешивании. По окончании экстракции субстрат сливают и центрифугируют 20 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют и к ней добавляют 10 частей ацетона на 1 часть субстрата при температуре 6^оС, перемешивают и формируют осадок 10 ч. Полученный осадок высушивают, измельчают и растворяют в дистиллированной воде из расчета 100 г осадка на 5 л воды. В течение 2 ч раствор перемешивают и удаляют балластные белки фильтрованием. Фильтрат лиофилизируют. Выход активного вещества 25 г на 1 кг сырья.

П р и м е р 2. Берут 2 кг замороженной ткани яичников овец, измельчают на волчке. Сырье заливают 6-8 частями раствора уксусной кислоты до рН 4,0. Добавляют 0,3 г/л хлористого цинка и включают мешалку. Экстракцию проводят при температуре 4^оС в течение 24 ч при постоянном перемешивании. По окончании экстракции жидкую часть сливают и центрифугируют со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 12 частей ацетона на 1 часть субстрата при температуре 2^оС и формируют осадок в течение 16 ч, после чего перемешивают и фильтруют. Полученный осадок высушивают, измельчают и растворяют в дистиллированной воде из расчета 100 г осадка на 5 л воды. В течение 2 ч раствор перемешивают и удаляют балластные белки фильтрованием. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через полые волокна ВПУ-15ПА (разделительный аппарат АР-02, Кириши) при комнатной температуре, давление 0,60 кгс/см² и скоростью фильтрации 0,22 см/с. Ультрафильтрат лиофилизируют. Выход активного вещества 19 г из 1 кг сырья.

П р и м е р 3. Берут 3 кг замороженной ткани яичников свиньи, измельчают на волчке и помещают в реактор. Сырье заливают раствором уксусной кислоты до рН 3,5, добавляют хлористый цинк из расчета 0,3 г/л экстракта, включают реактор. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании и температуре 0^оС в течение 36 ч. По окончании экстракции субстрат сливают, центрифугируют 20 мин при скорости 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к ней добавляют 8 частей ацетона на 1 часть субстрата при температуре 0^оС и в течение 30 ч формируют осадок, после чего перемешивают и фильтруют. Полученный на фильтре осадок высушивают, измельчают и растворяют в дистиллированной воде (100 г осадка на 5 л воды). Перемешивают в течение 2 ч и затем удаляют фильтрованием балластные белки. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через полые волокна при комнатной температуре, давлении 0,55 кгс/см² и скорости фильтрации 0,25 см/с. Ультрафильтрат стерильно фильтруют через пластины EKS, разливают во флаконы и лиофилизируют. Выход активного вещества 22 г из 1 кг сырья.

Биологическую активность вещества из яичников определяли при изучении его влияния на репродуктивную функцию самок в условиях ее подавления, вызванного недостатком питания. Исследования проводили на белых беспородных крысах самках весом 180-200 г и возрастом 3-4 месяца. Репродуктивную функцию угнетали хроническим недоеданием (сутки свободный режим, сутки голод). Были использованы 4 группы животных: 1-ая группа интактные крысы.

2-ая группа крысы с недостатком питания, которым ежедневно внутрибрюшинно вводили 0,2 мл физиологического раствора (контроль).

3-я группа крысы с недостатком питания, которым провели курс лечения гонадотропными гормонами по стандартной схеме [3] сначала ввели СЖК (сыворотка крови жеребой кобылы, Gestyl, фирма Organon) в дозе 12,5 МЕ на 100 г массы тела, а спустя 55 ч был введен ХГ (хорионический гонадотропин, фирма Serva) из расчета 10 МЕ на 100 г массы тела.

4-ая группа крысы с недостатком питания, которым внутрибрюшинно вводили вещество из семенников в течение 5 дней в дозе 500 мкг/100 г массы тела.

5-ая группа крысы с недостатком питания, которым внутрибрюшинно вводили вещество из яичников курсами по 5 инъекций в дозах 20, 200 и 500 мкг на 100 г массы тела.

После каждого курса лечения регистрировали продолжительность цикла. Данные представлены в табл. 9. Затем в стадии эструс животных выводили из опыта, взвешивали матку и яичники, подсчитывали число проовулировавших ооцитов. Результаты представлены в табл.10.

У голодающих самок крыс более чем в 2 раза удлинялась продолжительность цикла (с 4,2-4,4 дней при полноценном питании до 9,5-9,9 дней при 50% диете). Проведение курса лечения веществом из яичников в дозе 20 мкг на 100 г массы тела оказалось неэффективным, продолжительность цикла не уменьшалась. Увеличение дозы вещества до 200 и 500 мкг сократило продолжительность цикла до 8,1±1,3 и 5,2±0,3 дня соответственно. Положительный эффект оказало даже однократное введение вещества из яичников в дозе 500 мкг цикл сократился до 6,2±1,8 дней.

Изучение состояния внутренних органов репродуктивной функции и количества проовулировавших ооцитов показало, что у голодающих крыс снижается не только вес матки и яичников по сравнению с интактными, но и овулирует меньшее число ооцитов. У голодающих крыс, леченных веществом из яичников, вес матки и яичников и количество проовулировавших ооцитов не отличались достоверно от соответствующих показателей интактных животных.

Таким образом, введение вещества, полученного заявляемым способом, голодающим самцам восстанавливает у них продолжительность цикла, количество овулирующих ооцитов, вес матки и яичников до контрольного уровня.

Введение гонадотропных гормонов голодающим самкам вызвало сокращение цикла с 9,7 до 4,0±0,0 дня. При этом у леченных гондоатропинами крыс существенно возрастали по сравнению с интактными вес матки, яиников и количество проовулировавших ооцитов. Таким образом, при лечении голодающих крыс гонадотропными гормонами наблюдается тенденция к гиперстимуляции репродуктивной системы, что может повлечь за собой такие неблагоприятные побочные эффекты, как апоплексия яичников, многоплодная беременность, эндокринные нарушения и др.

Представленные данные свидетельствуют, что вещество из яичников, в отличие от прототипа, обладает способностью восстанавливать репродуктивную функцию самок в условиях подавления ее недостатком питания, не обладает гормональной активностью и не сопровождается неблагоприятными побочными эффектами.

Кроме того, нами проведены исследования по оценке токсичности и тератогенности вещества из яичников.

Известно, что у крыс период роста фолликулов от примордиальных до больших преантральных занимает около 14 дней и еще 4 дня под действием волны гонадотропинов до преовуляторных в течение цикла [4] Таким образом, хроническое введение различных доз вещества из яичников в течение 2-3 недель захватывает практически весь период фолликуло- и оогенеза. Анализ последующей беременности позволяет оценить возможный тератогенный эффект вещества из яичников на рост и созревание яйцеклеток у крыс.

Данные, представленные в табл.11, свидетельствуют о том, что у подопытных крыс овулирует такое же количество яйцеклеток, как и у контрольных (12,8±0,7 и 11,2± 0,6, p > 0,05). Подсчет живых плодов и мест резорбции позволяет сделать вывод о том, что вещество из яичников не оказывает эмбриотоксического действия на оогенез у крыс: как в опыте, так и в контроле в среднем на одну крысу приходилось 11 эмбрионов (11,4±0,8 и 11,2±0,6, p > 0,05). Изучение состояния эмбрионов не выявило достоверных различий ни в размере, ни в весе плодов крыс обех групп. Не изменилась также частота нарушений развития внутренних органов: у интактных крыс спонтанные нарушения, в основном в виде гидронефрозов почек, составляли 2,5% а в подопытной группе эти же нарушения составляли 3,1% и достоверно не различались. Таким образом, вещество из яичников, полученное заявляемым способом, не оказывает не только эмбриотоксического, но и тератогенного эффекта на эмбриогенез у крыс.

На дату подачи заявки по заявляемому объекту проведены промышленные испытания. Наработан препарат в количестве 0,5 кг, что соответствует 50000 флаконам по 10 мг.

Таким образом, предлагаемый способ получения вещества из яичников является новым, имеет изобретательский уровень и промышленно применим. Он может быть использован в сельском хозяйстве и здравоохранении.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ ЯИЧНИКОВ ЖИВОТНЫХ ВЕЩЕСТВА, ВОССТАНАВЛИВАЮЩЕГО РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ, включающий обработку сырья уксусной кислотой, осаждение ацетоном, отделение осадка фильтрацией и высушивание целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве животного сырья используют измельченные яичники животных, которые обрабатывают уксусной кислотой при рН 2,5 - 4,0 в течение 24 - 36 ч при 0 - 4^oС с добавлением 0,3 - 0,7 г/л хлористого цинка, а целевой продукт получают осаждением 8 - 12 объемов ацетона на 1 объем экстракта при температуре от -2^o до -8^oС в течение 10 - 16 ч, после отделения осадка фильтрованием и сушки осадок вновь растворяют в дистиллированной воде, фильтруют и лиофилизируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины заподдержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.04.2011

Дата публикации: 20.02.2012

---