Способ получения препарата инсулина для перорального применения

 

Использование: для лечения сахарного диабета, а также при других видах патологии, сопровождающихся гипергликемией или характеризующихся повышенным распадом белка и сниженным его синтезом. Сущность изобретения: проводят одноэтапную инкубацию инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1 - 4: 100, в присутствии связующего агента в конечной концентрации 0,15 - 0,25 %. В качестве связующего агента используют n-бензохинон, водорастворимые карбодиамиды, 2,4 - диизоцианататтолуол, 4,4-дифтор-2,2ʹ-динитродифенилсульфон, N,Nʹ-бисдиазобензидин-2,2ʹ-дисульфокислоту, бромистый циан, хлористый цианур или глутаровый диальдегид. Положительный эффект: изобретение обеспечивает получение препарата с содержанием в нем инсулина 1000 ед/1 г сухой массы, т. е. в 1 г сухого препарата содержится 40 мг инсулина с активностью 25 ед/мг. Препарат полностью сохраняет свою активность при пероральном введении. В лиофилизованном виде препарат может храниться в течение нескольких лет. 4 з. п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к способам получения перорального препарата инсулина, используемым в медицине, в частности в фармакологии и эндокринологии.

До настоящего времени лечение больных сахарным диабетом (инсулинозависимых) осуществляется путем регулярных подкожных инъекций (у наиболее тяжелых больных до 4 раз в сутки). На протяжении многих лет предпринимались неоднократные попытки по созданию перорального инсулина.

Преимущества перорального инсулина по сравнению с инъекционными коммерческими формами очевидны, поскольку длительные ежедневные инъекции могут вызывать различные серьезные осложнения: сопровождаются болевыми синдромами; приводят к развитию липодистрофии, представляющих не только косметический дефект, но и вызывающий потребность в увеличении доз гормона; травмируют психику, особенно у детей; вызывают стрессовые состояния, приводящие к еще более выраженной гипергликемии, что, в свою очередь, увеличивает потребность в гормоне и т.д.

Кроме того, проблема создания препарата инсулина для перорального применения заключается в необходимости защиты его от разрушающего действия протеолитическими ферментами желудочно-кишечного тракта таким образом, чтобы инсулин в конечном итоге поступал в системную циркуляцию в биоактивной форме.

Известен препарат инсулина перорального назначения, представляющий собой водно-масляную микроэмульсию, состоящую из инсулина, липидов и протеазного ингибитора. Микроэмульсия покрывается затем карбоксиметилцеллюлозой.

Существенным недостатком этого препарата, наряду с трудоемкой и дорогостоящей технологией изготовления, является использование носителя карбоксиметилцеллюлозы, которая подвержена воздействию микробов, особенно в условиях промышленного производства. Кроме того, целлюлоза способна сорбировать значительные количества белка, который необходимо отмывать буфером с высокой ионной силой. Проведение такой процедуры в больших масштабах является дорогостоящим и может приводить к значительной инактивации инсулина.

Задача изобретения получение препарата инсулина, устойчивого к действию протеолитических ферментов в желудочно-кишеч- ном тракте и обладающего выраженным гипогликемическим эффектом при пероральном применении.

Согласно изобретению способ осуществляют путем инкубации инсулина с эритроцитами, взятых в соотношении 1-4:100 в присутствии используемого для иммобилизации ферментов многофункционального связующего агента, в конечной концентрации 0,15-0,25% При этом обычно в качестве носителя используются эритроциты, выделенные из крови крупного рогатого скота, свиней или крови человека.

Преимущество эритроцитов по сравнению с другими носителями заключается в том, что они, являясь составной частью организма, не могут вызвать никаких нежелательных побочных явлений у пациентов.

Наряду с этим можно было предположить, что инсулин, связанный с эритроцитами, будет в меньшей степени подвержен протеолитической деградации, подобно тому как инсулин, связанный с белками крови, более устойчив к протеолитическому распаду. Однако эритроциты, связавшиеся с инсулином, не могут полностью защитить его от разрушения в желудочно-кишечном тракте без дополнительной защиты от протеолитического распада в желудочно-кишечном тракте. Для этих целей необходим подбор подходящего покрытия инсулинового препарата.

Для связывания эритроцита с инсулином применяются известные многофункциональные реагенты, обычно используемые для иммобилизации ферментов (Michael D.TREVAN "Immobilized Enzymes", М. Мир, 1983, с. 16-20), например n-бензохинон, водорастворимые карбодиамиды, 2,4-диизоцианаттолуол, 4,4-дифтор-2,2'-динитродифенилсульфон, N, N'-бисдиазобензи- дин-2,2'-дисульфокислота, бромистый циан, хлористый цианур или глутаровый диальдегид.

Наиболее предпочтительными являются бромистый циан, хлористый цианур и глутаровый диальдегид, так как они обеспечивают высокую биологическую эффективность готового препарата за счет обеспечения прочной связи инсулина с эритроцитами. В результате такого связывания инсулина с носителем препарат делается более устойчивым к действию протеолитических ферментов. Однако наиболее приемлемым из вышеуказанных трех связующих агентов является глутаровый диальдегид, как наименее токсичное соединение, хотя активность препарата инсулина, полученного с помощью глутарового диальдегида, была аналогична таковой препарата, содержащего в качестве связующего агента хлористый цианур.

Способ осуществляют следующим образом.

Эритроциты, выделенные из свежей крови кролика или крупного рогатого скота или людей путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 мин при 4^оС и отмытые дважды 4-кратными объемами 0,15 М раствора хлористого натрия, инкубируют с 1%-ным раствором кристаллического инсулина в фосфатном буфере (рН 6,8) в присутствии одного из многофункциональных связующих агентов, например глутарового диальдегида в конечной концентрации 0,15-0,25% при комнатной температуре в течение 2 ч при медленном качании инкубационной смеси. Затем суспензию отмывают от несвязавшегося инсулина и глутарового диальдегида 10 раз 10-кратными объемами 0,15 М раствора хлористого натрия центрифугированием при 2000 об/мин в течение 2 мин. После удаления последней порции хлористого натрия к осадку добавляют 1%-ный раствор желатина, тщательно размешивают, инкубируют при комнатной температуре 10 мин и лиофильно высушивают. Перед использованием препарат эмульгируют в воде.

П р и м е р 1. Получение препарата иммобилизованного инсулина и определение его активности. Используют кристаллический инсулин с активностью 25 ед/мг. Эритроциты выделяют из свежей крови кролика (с использованием в качестве антикоагулянта 1/10 объема 3,8% цитрата натрия) путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 мин при 4^оС. Эритроциты затем отмывают 2 раза четырехкратными объемами 0,15 М раствора хлористого натрия. К 10 мл взвеси эритроцитов добавляют 10 мл 0,1 М раствора фосфатного буфера (рН 6,8), содержащего 0,15 М раствор хлористого натрия, 10 мл 1%-ного раствора кристаллического инсулина и 10 мл 1%-ного раствора глутарового диальдегида или хлористого цианура и инкубируют при комнатной температуре 2 ч при медленном качании инкубационной смеси. Затем суспензию отмывают от несвязавшегося инсулина и глутарового диальдегида 10 раз 10-кратным объемами 0,15 М раствора хлористого натрия центрифугированием при 2000 об/мин в течение 2 мин. После удаления последней порции хлористого натрия к осадку добавляют 1%-ный раствор желатина, тщательно размешивают, инкубируют 10 мин при комнатной температуре и лиофильно высушивают. Препарат представляет собой порошок бурого цвета. Перед использованием препарат эмульгируют в воде. В полученном препарате содержание активного начала инсулина составляет 40 мг на 1 г.

П р и м е р 2. Получение препарата иммобилизованного инсулина как в примере 1, за исключением того, что к инкубационной смеси добавляли 5,3 мл 1%-ного глутарового диальдегида (конечная концентрация 0,15%), или 3,3 мл 1% -ного глутарового диальдегида (конечная концентрация 0,1%) или 13,1 мл 1%-ного глутарового диальдегида (конечная концентрация 0,3%). Эритроциты выделяли из свежей крови рогатого скота. Сопоставление активности препарата, полученного с использованием глутарового диальдегида в конечной концентрации 0,15% (Препарат-0,15) и 0,25 (Препарат-0,25) показало, что оба препарата не отличаются по активности (табл.1). В то же время более низкие концентрации глутарового диальдегида (Препарат-0,10) приводили к снижению активности препарата, а использование более высоких концентраций (Препарат-0,30) не повышали активности препарата (табл.1).

Активность препарата (содержание в нем инсулина) определяют методом биологического тестирования по судорожному эффекту на мышах. Судорожный эффект и снижение глюкозы в крови ниже 1,65 мМ/л (что соответствует 0,05 ед. стандартного раствора инсулина) наблюдали при подкожном введении мышам минимальной дозы 0,05 мг препарата, что соответствует содержанию в ней инсулина 1000 ед/1 г сухой массы. Таким образом, в 1 г сухого препарата содержится 40 мг инсулина с активностью 25 ед./мг, т.е. соотношение инсулина и эритроцитов в препарате равно 1:25.

Испытание препарата, хранимого в виде водной эмульсии при 4^оС в течение 4 недель показало, что он полностью сохраняет свою активность при пероральном введении. В лиофилизованном виде препарат может храниться в течение нескольких лет.

П р и м е р 3. Испытание препарата (согласно изобретению) на крысах с экспериментальным диабетом, вызванным стрептозотоцином. Крысам-самцам вводили внутрибрюшинно стрептозотоцин из расчета 120 мг/мг массы животного. Стрептозотоцин растворяли в цитратном буфере, рН 4,5 непосредственно перед введением. Через 48 ч животным через зонд вводили препараты инсулина, иммобилизован- ного с помощью глутарового диальдегида (ИНСглут) и помощью хлористого цианура (ИНСциан) из расчета по 15-20 ед. инсулина в препарате (на одно животное), приготовленном по примеру 1, и через 3 ч у животных определяли в крови содержание глюкозы. Контролем служили животные с стрептозотоциновым диабетом, не получавшие препаратов. Данные приведены в табл.2.

Как видно из данных табл.2, у животных со стрептозотоциновым диабетом через 3 ч после введения препаратов инсулина ИНСглут и ИНСциан уровень глюкозы в крови снижался в среднем на 62% и 57% соответственно по сравнению в диабетическими животными, не получавшими препаратов.

П р и м е р 4. Испытание препарата иммобилизованного инсулина для достижения гипогликемического эффекта на диабетических мышах при пероральном введении. Препарат, полученный по примеру 1, вводят животным (взрослым самцам массой 20 г) через зонд в объеме 0,2 мл. Животные получают 2,0-2,5 ед. инсулина в препарате. Содержание глюкозы в крови определяют глюкозооксидазным методом. Результаты приведены в табл.3.

Из приведенных данных видно, что препарат согласно изобретению при введении мышам снижает уровень глюкозы в крови в среднем на 52% по сравнению с животными не получавшими препарата.

П р и м е р 5. Испытание препарата инсулина (ИНСглут) на диабетических крысах через 3 и 6 ч после введения препарата инсулина. Крысам-самцам массой 150-180 г вводили через зонд в пищевод препарат инсулина из расчета 10-15 ед. и через 3-6 ч после введения препарата определяли уровень глюкозы. Контролем служили крысы, не получавшие препарата. Данные приведены в табл.4.

Как видно из данных табл.4, у крыс, получавших препарат инсулина через 3 и 6 ч, происходит значительное снижение уровня глюкозы в крови, составляющее 48% и 47% соответственно к исходному уровню, в то время как у животных, не получавших препарат инсулина, уровень глюкозы в крови в исследуемом интервале времени не меняется.

Согласно изобретению препарат инсулина может быть успешно использован не только при лечении сахарного диабета, но также при других видах патологии, сопровождающихся гипергликемией (обширные хирургические раны, термические повреждения, септические состояния, геморрагический шок, анестезия и др.), а также при патологических состояниях, характеризующихся повышенным распадом белка и сниженным его синтезом (различные стадии ожоговой болезни, нефропатии и т.д.).

Препарат в ходе изготовления или в готовом виде может быть обработан желатином, кератином или каким-либо другим инертным соединением, а перед употреблением суспендироваться в воде. Препарат может быть также изготовлен в виде таблеток, защищенных каким-либо инертным по отношению к препарату соединением, а также применяться в виде суспензии, сохраняющейся при +4^оС не менее одного месяца.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИНСУЛИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ, отличающийся тем, что одномоментно проводят инкубацию инсулина с эритроцитами в соотношении 1 4 10 в присутствии связующего агента в конечной концентрации 0,15 0,25 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве связующего агента используют п-бензохинон, водорастворимый карбодиамид, 2,4-диизоцианататтолуол, 4,4-дифтор-2,2'-динитродифенилсульфон, N, N'-бисдиазобензидин-2,2'-дисульфокислоту, бромистый циан, хлористый цианур или глутаровый диальдегид.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве связующего агента используют бромистый циан, хлористый цианур или глутаровый диальдегид.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве связующего агента используют глутаровый диальдегид.

5. Способ по пп. 1 4, отличающийся тем, что в качестве эритроцитов используют эритроциты крови крупного рогатого скота, свиней или человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2