Способ идентификации пневмококков

 

Использование: микробиология, способ индентификации пневмококков. Сущность применения: путем постановки теста чувствительности на плотной питательной среде и использованием стандартных дисков. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии и касается способов идентификации пневмококков.

В современной научной литературе широко бытует мнение о ведущей роли пневмококка в возникновении и распространении острых и хронических заболеваний легких у детей и взрослых. Установлена роль пневмококка в возникновении тяжелых форм менингитов и менингоэнцефалитов, отитов, конъюнктивитов, сентицелий. Широко распространено носительство (до 50% у детей) (Л.К.Катосова и соавт. Педиатрия. 1987, N 1; Handrich R. et al//Padiatr. Grenzgeb. 1988, In. 27, -N 4).

Вместе с тем проблема пневмококковой инфекции не представляется решенной. Выделение, а в особенности идентификация этого микроорганизма, сопряжены со значительными трудностями, связанными с отсутствием тест-систем и препаратов для идентификации и дифференциальной диагностики.

Известны способы идентификации пневмококков на основании феномена лизиса этого микроорганизма под действием желчи или желчных солей (Н.Н.Костюков, Ж. микр. N 12, 1981; Austrian R. et al.//In: Manual of Chemical Microbiology. Washington. 1974).

Сущность этого феномена исходит из следующего. Желчь по химическому составу представляет комплекс желчных кислот и желчных солей. Последние по физико-химическим свойствам расцениваются как поверхностно-активные вещества или детергенты, а поэтому и обладают способностью концентрироваться на поверхностях клеточных мембран. Существует мнение, что адсорбция поверхностно-активных веществ на бактериальной мембране пневмококка инактивирует гидрофобную зону мембран и таким образом приводит к активации белков (ферментов) с аутолитической функцией.

Однако этот метод отличается нестандартностью: желчь не может обеспечить стандартные условия проведения исследований, а визуальный учет аутолиза клеток достоверности их лизиса.

Практическому здравоохранению предложен способ идентификации пневмококков с помощью теста на продукцию β-гемолиза пневмококка вокруг диска с метициллином, в отличие от других α-стрептококков, не образующих β-гемолиз. В этих условиях т.е. метод, основанный на учете характера гемолиза. Этот метод несмотря на простоту выполнения характеризуется низкой чувствительностью, так как только 60% пневмококков обладают этим феноменом.

Известен метод дифференцировки пневмококков от других α-стрептококков на основе изучения микроколоний этих микроорганизмов (С.Хаджиев, Н.Хаджиева //Ж. микробиол. N 11, 1987). Микроколонии пневмококков имеют вид зернистого неупорядоченного компактного образования, состоящего из плотно уложенных ланцетовидных диплококков, реже коротких цепочек, состоящих не более чем из 8 кокков. В отличие от них, α-стрептококки других видов растут на фильтре, создавая четко обозначенные длинные цепочки. Однако следует отметить, что эти исследования затруднены трудоемкостью микробиологических исследований с большой затратой рабочего времени.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ идентификации пневмококков с помощью оптохинового теста, сущность которого заключается в определении чувствительности испытуемых культур к оптохину (Н.Н.Костюкова //Ж.Микробиол. N 12, 1981).

Постановка данного теста осуществляется на плотной питательной среде для выращивания пневмококков с помощью дисков, пропитанных оптохином. Установлено, что только пневмококки чувствительны к концентрации 1:4000 водного раствора оптохина, тогда как другие α-стрептококки к данной концентрации резистентны. При этом зона ингибиции для пневмококка 16 мм. Метод отличается простотой и доступностью. Однако его применение весьма ограничено по следующим причинам. Во-первых, не налажен промышленный выпуск данного препарата, во-вторых, срок годности коммерческих зарубежных дисков с оптохином ограничен, и следовательно, производить закупки его весьма не экономично.

Для идентификации пневмококков авторы предлагают использовать отечественный препарат хинин, алкалоид, содержащийся в коре различных видов хинного дерева. Хинин белый кристаллический порошок без запаха, хорошо растворим в воде (1: 30), легко в кипящей (1:1), в спирте (1:3). Содержит 82% хинина (основания). Водные растворы стерилизуют при 100^оС в течение 30 мин. В отличие от оптохина хинин более стойкий препарат, отличается стандартностью, хорошей растворимостью и доступен для широкого применения в нашей стране. Формы выпуска отечественной промышленностью: порошок, таблетки по 0,25 и 0,5 г (М.Д.Машковский, Лекарственные формы, т.2, 1985).

Идентификация пневмококков осуществляется путем определения на 5% кровяном агаре чувствительности его к хинину с помощью стандартных дисков, нагруженных 0,6-0,8 мкг данного препарата на один диск.

Способ осуществляется следующим образом.

П р и м е р. Испытуемую культуру, подозрительную на пневмококк, т.е. грамположительные диплококки с капсулой, образующие на 5% кровяном агаре β-гемолиз, высевают бактериальным газоном на 5% кровяной агар. Чашки подсушивают 30-40 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность засеянной среды накладывают диск с хинином (0,6-0,8 мкг на диск). Чашки с дисками выдерживаются еще при комнатной температуре, а затем 16-18 ч при 36-37^оС. Оценка результатов проводится по диаметру зон задержки роста вокруг диска с хинином, включая диаметр самого диска. Отсутствие зон задержки роста пневмококка вокруг диска указывает на то, что испытуемая культуpа не чувствительна к данной концентрации оптохина.

Зона диаметром до 16 мм и выше указывает на чувствительность культуры к данному препарату. Как показали многочисленные исследования (см. таблицу) 0,6-0,8 мкг в одном диске оптимальная концентрация для пневмококков. В отличие от пневмококков другие β-гемолитические стрептококки к данной концентрации не чувствительны. Зона ингибиции для пневмококков была до 15 мм и выше.

Приведенные данные таблицы свидетельствуют о том, что только пневмококки в отличие от других α-стрептококков обладают чувствительностью к 0,6-0,8 мкг хинина. Имеет место полная корреляция показателей чувствительности пневмококков к хинину и оптохину.

Формула изобретения

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПНЕВМОКОККОВ путем определения чувствительности к тесту на плотной питательной среде с использованием стандартных дисков, отличающийся тем, что в качестве теста используют хинин в количестве 0,6 0,8 мкг/диск.

РИСУНКИ

Рисунок 1