Питательная среда гк для культивирования бактерий видов campylobacter jejuni / coli

 

Использование: среда для культивирования кампилобактерий. Сущность изобретения: питательная среда содержит, об.%: питательный агар 67,6 - 88,9; кровь дефибринированная баранья 5,5 - 7,5; гидролизат казеина 3,3 - 22,6. Из смеси антибиотиков она содержит низорал в количестве 1-10 мг/л, рифампицин 4-16 мг/л; цефазолина натриевую соль 9-21 мг/л и колимицин 7000-12000 ЕД/л. Среда позволяет сократить сроки появления роста кампилобактерий, проста в изготовлении и подлежит длительному хранению. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к средам для культивирования кампилобактерий.

Известны среды для культивирования термофильных кампилобактерий как железо-эритрит кровяной агар (ЖЭКА), селективный эритрит агар. Недостатком указанных сред является сложность в их изготовлении, а также короткие сроки хранения (14 дней), длительные сроки появления роста (72 часа) самих кампилобактерий.

Известны также среды для выделения кампилобактерий из фекалий людей, такие как Skirrows, Preston, Modified OCDA, Butzler Medium Virion. Недостатком указанных сред является использование в качестве основ для них ряда весьма дорогих и практически недоступных для практических бактериологических лабораторий таких зарубежных коммерческих препаратов как основа N 2 кровяного агара (Oxoid CM 271), питательный бульон N 2 (Oxoid CM 67), основу селективного агара (Oxoid CM 739), кровяной агар Колумбия (Соlumbia Agar-Oxoid CM 331) и др.

Наиболее близким прототипом является питательная среда для культивирования Campylobacter jejuni, состоящая из питательного агара, дефибринированной крови барана, смеси аминокислот, витаминов и факторов роста с добавлением или без добавления антибиотиков. Готовая среда разлитая в чашках Петри сохраняется до использования в холодильнике в закрытых полиэтиленовых пакетах в течение 10 дней. Культивирование на данной среде осуществляется путем посева искомых бактерий или биоматериалов их содержащих, инкубирования в термостатных условиях при 42-43^оС в присутствии повышенных концентраций углекислоты с последующим учетом результатов через 24 и 48 ч. Недостатком указанной среды является сложность в изготовлении, вследствие необходимости предварительного изготовления смеси из 17 аминокислот и 10 витаминов и факторов роста (взвешивание всех 27 ингредиентов, их растворение в специальных растворителях, стерилизация смеси методом фильтрования и др.), а также короткий срок хранения готовой среды в условиях холодильника (10 дней) и длительные сроки выдерживания в термостате до появления роста кампилобактерий (до 48 ч).

Целью изобретения является упрощение технологии изготовления среды, удлинение сроков хранения готовой питательной среды и сокращение сроков появления роста кампилобактерий на ней в условиях термостата и капнофилии.

Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду, содержащую питательный агар, дефибринированную кровь и колимицин, дополнительно введены гидролизат казеина, низорал, рифампицин, цефазолина натриевая соль, при следующем соотношении ингредиентов (об.): питательный агар 67,6-88,9;дефибринированная кровь 5,6-7,5; гидролизат казеина 3,3-22,6; смесь антибиотиков 2,2-2,3; при этом антибиотики введены в селективную смесь в следующих концентрациях, мг/л: Низорал 1-10 Рифампицин 4-16 Цефазолина натри- евая соль 9-21 Колимицин 7000-12000 ЕД/л.

Питательную среду готовят следующим образом. Взвешивают 46 г питательного агара сухого и растворяют медленно на огне в 1000 мл дистиллированной воды до получения жидкой однородной массы. Разливают в колбы, флаконы и стерилизуют в автоклаве, при 1,5 атм, температуре 134^оС в течение 30 мин.

К питательному агару после стерилизации и охлаждения до 50^оС добавляют в стерильных условиях дефибринированную кровь. Смесь подогревают на водяной бане до получения препарата агар с гретой кровью. К ней затем последовательно добавляют гидролизат казеина и смесь антибиотиков. Готовую среду разливают сразу в стерильные чашки Петри, которые во время застывания среды подвергаются облучению УФЛ в течение 20-30 мин, затем хранят в холодильнике и используют по мере необходимости для культивирования.

Гидролизат казеина или казеиновый перевар вводится в состав питательной среды в качестве натурального источника аминокислот, витаминов и факторов роста взамен смеси синтетических аминокислот, витаминов и факторов роста в прототипе. Казеин фосфорсодержащая белковая фракция молока. Изготавливается молочной и медицинской промышленностью для различных нужд народного хозяйства из обезжиренного молока. Обладает рядом свойств, которые позволяют назвать его одним из наиболее полноценных видов сырья для изготовления питательных сред. Характеризуется относительным постоянством состава и высоким содержанием белка. Содержит все основные аминокислоты (аминограмма: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аргинин, лизин, цистин, фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан, метионин, треонин, пролин), некоторые витамины (тиамин, пиридоксин, рибофлавин и др.) и другие факторы роста (холин, биотин, аденин, гуанин, урацил). Благодаря однородности его среды, приготовленные на его основе, могут быть легко освобождены от белковых балластных веществ при осаждении нерасщепленного казеина в изоэлектрической точке. Содержит мало примесей и сопутствующих веществ (жира, солей, лактозы и др.). Гидролизат казеина представляет собой раствор, полученный путем ферментативного гидролиза белка казеина с сохранением в нем всех аминокислот, в том, числе всех незаменимых, а также витаминов и факторов роста. Более сбалансированное соотношение всех ингредиентов в натуральном гидролизате казеина как источнике аминокислот, витаминов и факторов роста, а также присутствие в нем дополнительно аденина, гуанина и урацила, т.е. пуриновых и пиримидиновых оснований способствуют более быстрому росту и размножению кампилобактерий и следовательно появлению хорошо видимого роста в виде изолированных колоний уже через 24 ч инкубации. Таким образом достигается сокращение сроков появления роста кампилобактерий в условиях термостата и капнофилии.

Кроме того, введение в состав среды лишь одного препарата в виде гидролизата казеина позволяет значительно упрощать технологию изготовления самой среды, так как отпадает необходимость предварительного изготовления смеси аминокислот, витаминов и факторов роста, включающей взвешивание на торсионных весах 17 синтетических аминокислот, 8 витаминов и 2 факторов роста, их растворение в разных растворителях или при разных значениях рН дистиллированнрой воды, стерилизация методом фильтрования, который сам по себе является весьма трудоемким процессом и т.д.

Сравнение технологий приготовления предложенной питательной среды и питательной среды по прототипу приводится в табл. 1. Как видно из табл. 1 предлагаемая питательная среда более технологична в изготовлении по сравнению с существующей по прототипу и ее приготовление доступно в любой лаборатории.

Низорал (венгерский препарат, международное название кетоконазол) противогрибковый антибиотик широкого спектра действия (активен в отношении возбудителей кокцидиоидомикоза и паракокцидиоидомиккоза, гистоплазмоза, криптококкоза, аспергиллеза, всех форм кандидоза и других поверхностных и висцеральных форм грибковых заболеваний. В отношении бактерий не активен, поэтому в состав смеси введены следующие три антибиотика.

Рифампицин антибиотик широкого спектра действия: активен с основном в отношении грамположительных бактерий и микобактерий туберкулеза. В отношении некоторых грамотрицательных микроорганизмов действует лишь в больших концентрациях. Поэтому возникла необходимость введения в состав селективной смеси и цефазолина натриевой соли. Следует подчеркнуть, что кроме указанного спектра, рифампицин подавляет практически все штаммы анаэробов представителей ассоциативной микрофлоры биосубстратов.

Цефазолина натриевая соль антибиотик широкого спектра действия: активен в отношении некоторых грамположительных микробов, таких как стафилококки, стрептококки, коринебактерии, но в основном его действие направлено на грамотрицательные бактерии, такие как шигеллы, сальмонеллы, некоторые протеи, клебсиеллы, гонококки и др. Однако антибиотик слабо активен в отношении кишечных палочек, в связи с чем возникла необходимость введения в состав селективной смеси и килимицина.

Колимицин или неомицина сульфат антибиотик также широкого спектра действия: активен в отношении лишь некоторых грамположительных микроорганизмов, как стафилококки и стрептококки пневмонии (и малоактивен даже в отношении остальных стрептококков) и активен в отношении ряда грамотрицательных бактерий, в первую очередь в отношении кишечной палочки, а также в отношении шигелл, представителей всех родов группы протеев и др. (10).

Указанный состав селективной смеси подобран исходя из следующих соображений: антибиотики не должны подавлять жизнедеятельность или каким-либо другим образом влиять на рост и размножение кампилобактерий; антибиотики должны ингибировать, т.е. полностью подавлять рост и размножение всех представителей ассоциативной микрофлоры после посева биосубстратов: грибов, грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов с тем, чтобы на предлагаемой среде могли расти в виде изолированных колоний лишь кампилобактерии; постоянное присутствие в состав предложенной среды именно антибиотиков в данной компановке позволяет задержать рост любого микроорганизма, случайно попавшего в среде во время ее изготовления или хранения и таким образом продлить сроки хранения среды.

Основные свойства заявляемой питательной среды, а именно сроки годности и появления роста в виде колоний, в сравнении с другими питательными средами представлены в табл. 2.

Следует добавить, что удлинению сроков годности питательной среды способствуют еще два момента, выше еще неперечисленных: смесь агара с дефибринированной кровью подогревается при 80^оС не 3 мин как обычно, а значительно дольше (см. пример); после добавления гидролизата казеина и смеси антибиотиков питательная среда подвергается воздействию УФ-лучей.

П р и м е р. Взвешивают 35-46 г порошка сухого питательного агара и размешивают в колбе с 1000 мл холодной дистиллированной воды, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания. Фильтруют и разливают во флаконы или колбы меньшего объема, стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 120^о и 1,0 атм. Простой питательный агар готов.

В колбу с 80-85 мл готового, простерилизованного питательного агара, остуженного до 45-50^оС добавляют в стерильных условиях 5-7 мл дефибринированной бараньей крови. Смесь подогревают на водяной бане при температуре до 80^оС в течении 15-20 мин при постоянном перемешивании.

Содержимое колбы повторно охлаждают до 50^оС и последовательно добавляют 10-20 мл гидролизата казеина и 1,5-3,0 мл селективной смеси, содержащей антибиотики в следующих концентрациях, мг/л: Низорал (кетоконазол) 3 Рифампицин 8 Цефазолина натриевая соль 10 Колимицина (нео- мицина сульфат) 10000 ЕД/л.

Готовую питательную среду сразу разливают в стерильные чашки Петри, облучают в течение 20-30 мин УФ-лучами, оставляют на 3-4 ч при комнатной температуре, после чего, чашки хранят в закрытых полиэтиленовых пакетах в холодильнике и используют по мере необходимости для культивирования кампилобактерий. Первоначальные свойства среды сохраняются без изменений в течение 30-45 дней и более.

Для культивирования кампилобактерий на предлагаемой питательной среде посевы осуществляют петлей, шпателем или тампоном; чашки с посевами выдерживают в условиях капнофилии при температуре 42-43^оС. Результаты посевов учитывают через 24 ч. Как правило появляются типичные колонии кампилобактерий: гладкие, выпуклые, мелкие, полупрозрачные, диаметром 0,2-(1,5-2,0) мм. Принадлежность их к роду Campylobacter определяют дополнительно по морфологии микробов (мазок, окрашенный фуксином), оксидазе и каталазе.

Аналогично приведенному примеру были изготовлены питательные среды, содержащие граничные значения всех ингредиентов по отдельности. Результаты данных исследований приведены в табл. 3. Как видно из табл. 3 значения всех ингредиентов лишь в указанных интервалах позволяют получать питательные среды высоконутритивные, пригодные для выполнения посевов, позволяющие получать рост кампилобактерий в минимальные сроки, задерживающие и ингибирующие полностью рост всей ассоциативной микрофлоры и с максимальными сроками годности.

Исходя из вышеизложенного следует отметить: заявляемая питательная среда более технологична в изготовлении по сравнению с прототипом и другими существующими средами и ее приготовление доступно в бактериологических лабораториях больниц и санэпидстанций всех категорий; сроки сохранения заявляемой питательной среды в готовом виде без изменения первоначальных свойств значительно превышают сроки годности других аналогичных питательных сред;
сроки появления роста кампилобактерий в виде колоний на предлагаемой питательной среде короче, чем на среде прототипе и других аналогичных средах.

Использование изобретения позволит значительно быстрее (так как технология изготовления более простая) приготовить нужное количество питательных сред, реже изготовлять питательную среду (сроки годности длиннее и можно изготовлять впрок) и освобождать сотрудника по ее изготовлению на другие работы в лаборатории, ускорять выдачу результатов анализов, что очень существенно для больных, так как скорость роста и размножения кампилобактерий на предлагаемой среде выше, чем на аналогичных средах.

Кроме вышеизложенного необходимо отметить, что казеиновый перевар (или гидролизат) выпускается биопромышленностью в готовом виде и следовательно отпадает необходимость поиска и покупки весьма дорогих и дефицитных аминокислот, витаминов, азотистых оснований и других факторов роста. Тем самым экономический эффект представляется весьма значительным.

Формула изобретения

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ГК ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ ВИДОВ CAMPYLOBACTER JEJUNI / COLI, содержащая питательный агар, кровь дефибринированную баранью, источник аминокислот, витаминов и факторов роста и смесь антибиотиков, отличающаяся тем, что из источников аминокислот, витаминов и факторов роста она содержит гидролизат казеина, а из антибиотиков низорал, рафампицин, цефазолин натриевая соль, колимицин в количестве 1 10 мг/л, 4 16 мг/л, 9 - 21 мг/л и 7000 12000 ЕД/л соответственно при следующем соотношении компонентов, об.

Питательный агар 67,6 88,9
Кровь дефибринированная баранья 5,5 7,5
Гидролизат казеина 3,3 22,6
Смесь антибиотиков 2,2 2,3

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2