Способ гидролиза аминокислотной последовательности предшественника инсулина человека

 

Использование: биотехнология, фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: предшественник инсулина человека, имеющий общую формулу I, приведенную в описании, где R - либо Н, либо химически или ферментативно отщепляемый аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 30 аминокислотных остатков, X - аргинин или С - цепь проинсулина человека, А1 - А20 - аминокислотная последовательность А - цепи инсулина человека, В1 - В29 - аминокислотная последовательность В - цепи инсулина человека, обрабатывают при pН 6-9, температуре от 20 до 40^oС и соотношении фермент/субстрат от 0,1: 1 до 50: 1 (ед/мг) клострипаином из Clostridium histoluticum , а затем при необходимости карбоксипептидазой В. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к получению инсулина из предшественника.

Инсулины состоят из двух полипептидных цепей цепи А, которая содержит 21 аминокислотную группу, и цепи В, с 30 аминокислотными остатками. А- и В-цепи связаны друг с другом через два дисульфидных мостика, причем цистеиновые остатки (группы) в позициях А7 и В7, а также А20 и В19 соединены друг с другом. Третий дисульфидный мостик находится между А и All. Животный и человеческие инсулины образуются в поджелудочной железе в форме препроинсулинов. Человеческий препроинсулин состоит, например, из препептида с 24 аминокислотными остатками, к которому присоединяется проинсулин с 86 аминокислотными остатками со следующей конфигурацией: Prapeptid- B Агg Arg С Lуs Arg A причем С означает аминокислотную цепь с 81 группами (остатками). Во время выделений из панкреатических островков (островков Лангергенса) препептид отщепляется и образуется проинсулин. В заключение С-цепь протеолитически расщепляется и образуется эффективный человеческий инсулин.

Генно-технические методы позволяют во всевозрастающем масштабе производить препроинсулины в микроорганизмах (1-2). Расщепление препропоследовательности осуществляется как правило химически и/или энзиматически (3-4). Известные энзиматические методы основываются на расщеплении посредством трипсина и карбоксипептидазы В (5-7). Недостатком этих методов является образование больших количеств побочных продуктов, которые лишь с большим трудом отделяются из реакционного раствора. Особенно при превращении человеческого препроинсулина в человеческий инсулин (Humaninsulin) возникают большие количества Des Thr (ВЗО) человеческого инсулина (Des-Thr (ВЗО)-HI) Этот побочный продукт отличается от Н1 только отсутствием располагающейся на конце аминокислоты и с большим трудом выделяется из реакционных растворов.

Для уменьшения образования этого побочного продукта могут добавляться определенные тяжелые металлы в качестве добавки для расщепления, в частности никель (14). Однако такого рода реакционный процесс с точки зрения крупнотоннажного производства является нежелательным вследствие высокого загрязнения сточных вод тяжелыми металлами. Поэтому имеется необходимость в возможно специфическом и совместимо с окружающей средой превращении препроинсулина.

Клострипан (клостриопентидаза В, ЕС 3.4.22.8.) это энзим из культуральной жидкости Closteidium histoluticum с молекулярным весок, приблизительно от 30 000 до 80 000, который обладает как протеолитической, так и амидазо-эстораза-активностью (8).

Он отличается высокой специфичностью в отношении Агg-е-связей. Так, в изолированной В-цепи инсулина Arg- Gly- связь расщепляется при помощи клострипана в 500 раз быстрее, чем Lys- Аlа-связь, и в глюкагоне расщепляются только Arg-Arg Arg-Ala и Lуs- Туг. Скорость гидролиза для этих связей находятся в соотношении 1/7 и 1/300 друг к другу (9).

Однако неожиданно было обнаружено, что клострипан расщепляет препроинсулин специфически с С-конца сзади аргинина, а расщепление аминокислотной цепи, расположенной за аргинином (Е22), имеющимся в В-цепи, не происходит.

Изобретение касается, таким образом, способа гидролиза аминокислотной цепи препроинсулина формулы I в которой R¹ означает n-аминокислот, причем n означает целое число О или 1; R² означает водород, химически или ферментативно (энзиматически) отщепляемую (расщепляемую) аминокислоту или пептид с 2-30 аминокислотными группами (остатками); R³ означает окси-группу, аминокислоту или пептид с 2-10 аминокислотами; X означает L-аргинин или пептид с 2-45 аминокислотами на С-конце и N-конце которого имеется L -аргинин-группа (радикал); Y означает генетически кодируемую аминокислоту; Z означает генетически кодируемую аминокислоту; А1-А20 или В2-В29 означают природную или измененную посредством замены (обмена) одной или нескольких аминокислотных групп аминокислотную последовательность человеческого или животного инсулина.

Заявленный способ отличается тем, что препроинсулин гидролизуется в присутствии клострипина и при данных условиях превращается в инсулин при помощи карбоксипептидазы B.

Аминокислотная последовательность пептидов и протеинов указывается (обозначается) с N-конца аминокислотной цепи. Протеазы гидролизуют пептидную связь между аминокислотами пептидов протеинов. Клострипан гидролизует пептиды или протеины, содержащие L-аргинин специфически позади аргинина. В качестве реакционного продукта гидролиза препроинсулина образуются производные инсулина или полипептиды, которые на С-конце имеют аргининовую группу, или аминокислоты.

Под понятием природные аминокислоты понижаются, например, GlУ, Аlа, Ser, Тhr, Vа1, Leu IIe, Asp, Аsn, Glu Gln, Cys Met, Туr, Рhе, Prо, Нуp, Тrp, Аrg, Lуs Ну1, Orn Сit или His.

Под понятием генетически кодируемые амнокислоты имеются в виду, например, Glу, А1а, Ser, Тhr, Vа1, Leu IIe, Asp, Asn, Glu-GIu, Суs Met, Аrg, Lуs, Нis, Туr, Рhе, Тrp, Рrо или селеноцистеин.

Предпочтительными является препроинсулины формулы I,
в которой R¹ означает фенил (Рhе);
R² означает водород, природную аминокислоту или пептид с 2-30 природными аминокислотами, С-конец оканчивается L- аргинином;
R³ означает окси-группу, природную аминокислоту или пептид с 2-10 природными аминокислотами;
X означает L- аргинин или С-цепь человеческого или животного проинсулина;
Y означает аминокислоту из группы Тhг, А1а или Sег;
Z означает аминокислоту из группы Аsn, GIu Аsp, Glu, Gly, Ser, Тhг, А1а или Met;
А1-А20 или В2-В29 означают аминокислотную последовательность человеческого или животного инсулина.

Особенно предпочтительными является препроинсулин формулы I,
в которой R¹ означает Рhе;
R² означает водород или пептид с 2-30 природными аминокислотами, С-конец оканчивается L-аргинином;
R³ означает окси-группу природную аминокислоту или пептид с 2-10 природными аминокислотами;
X означает L- аргинин или С-цепь человеческого проинсулина, проинсулина свиньи или проинсулина рогатого скота;
Y означает Тhг;
Z означает Аsh;
А1-А20 или B2-B29 означают аминокислотную последовательность инсулина человека, свиньи или рогатого скота.

Предпочтительными являются инсулины со следующей аминокислотой: NH₂ Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly IIe Val Glu Glu CysCys Thr Ser IIe Cys Ser Leu Tyr Glu Leu Glu Asn Tyr Cys Asn СОOH
Клострипан (ЕС 3.4.22.8) это экстрацеллюлярная тиолпротеаза из клостридий (Clostridieu ). Энзим является гетеродимером и не обладает никакой гомологией с другими известными тиолпротеазами. Энзим обладает чрезвычайно высокой специфичностью в отношении Агg-ХХХ связей, в частности Агg-Рго. Он может характеризоваться молекулярные весом от 30 000 до 80000 и изоэлектрической точкой, рН от 4,8 до 4,9. В качестве активаторов действуют, например, цистеин, меркаптоэтанол, дитиотрептол или ионы кальция.

В присутствии, например, тозил-L-лизин-хлорметилкетона, перекиси водорода, ЭДТА, ионов Со⁺², Сu⁺², Cd⁺² или цитрата клострипан тормозится.

Приготовление клострипана осуществляется с помощью микроорганизмов посредством ферментации. При этом способе клостиридии (Clostiridieu) культивируются до тех пор, пока в питательной среде не скапливается клострипан. Пригодными являются, к примеру, Clostridium histolyficum, в частности и Clostridium histolyficum ДSM 627. Также пригодными являются мутанты и варианты названных микроорганизмов, поскольку они синтезируют клострипан.

Выращивание осуществляется анаэробно индивидуально или в смешанной культуре, например погружено в неподвижной культуре в отсутствии кислорода, или в ферментаторах, в данном случае при подводе азота, благородных газов или других газов, за исключением кислорода, ферментация осуществляется в температурной области, приблизительно от 10 до 45^oС, преимущественно приблизительно от 25 до 40^oС, в частности от З0 до 38^oС. Ферментация происходит в pН-области от 5 до 8,5, преимущественно от 5,5 до 8. При этих условиях культуральный бульон, в общем, через 1-3 дня показывает достойную упоминания аккумуляцию энзима. Синтез клострипана начинается в поздней Log-фазе и достигает максимума в стандартной фазе роста. Производство энзима может контролироваться с помощью теста активности.

Используемый для производства клострипана питательный раствор содержит от 0,2 до 6% предпочтительно от 0,5 до 3% органических соединений азота, а также неорганические соли. В качестве органических соединений азота принимаются во внимание: аминокислоты, пептоны, далее мясные экстракты, размолотые семена, например, маиса, пшеницы, бобов, сои или хлопчатника, дистилляционные остатки спиртового производствa, мясная мука или дрожжевые экстракты. В качестве неорганических солей питательный раствор может содержать, например, хлориды, карбонаты, сульфаты или фосфаты щелочных или щелочно-земельных металлов железа, цинка и марганца, а также может содержать соли аммония и нитраты.

Оптимальные условия ферментации для каждых микроорганизмов хотя и отличаются, однако либо уже известны исследователю, либо устанавливаются в простых предварительных опытах. Очистка клострипана может осуществляться классическими методами, например осаждением сульфата аммония, ионнообменной или гельпроникающей хроматографией. Соединение энзимов возможно согласно известным методам (11).

Для энзиматического превращения могут использоваться как целые клетки в свободной или иммобилизированной форме, так и изолированный энзимный продукт, который также может быть "связан" с носителем (подложкой).

Расщепление препроинсулина формулы I клострипаном осуществляется в водной среде, к которой могут быть также добавлены смешивающиеся с водой органические компоненты, например спирты, кетоны, мочевина, N,N-диметилформамид. В частности, для лучшего pН-контроля к исходной реакционной смеси могут добавляться соответствующие неорганические или органические буферы, как фосфат Трис(Tris) глицин, НЕРES и другие. Концентрация препроинсулина во время расщепления лежит, к примеру, в интервале от 0,01 мг/мл до 100 мг/мл, предпочтительно от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл. Отношение препроинсулина к клострипану составляет (мг к единице (u )) от 1:0,01 до 1:1000 предпочтительно от 1:0,1 до 1:50.

Температура при реакции также может варьироваться от pН 4 до pН 12, особенно предпочтительной является область от pН 6 до pН 9.

Время, которое необходимо для превращения препроинсулина в соответствующий интермедиат, может варьироваться в соответствии с реакционными условиями в широких рамках, например оно может составлять от 15 минут до 48 часов, предпочтительной является продолжительность реакции от 1 часа до 6 часов.

Энзим перед использованием активируется подходящим образом в присутствии меркаптана. В качестве меркаптанов в принципе имеются в виду все соединения которые содержат SH-группы, предпочтительно используются ДТТ ДТЕ меркаптоэтанол, тиогликолевая кислота или цистеин. Концентрация меркаптанов может варьироваться в широком диапазоне, предпочтительными являются концентрации от 0,1 мM до 100 мМ. Далее активирующий буфер содержит Са²⁺ ионы, преимущественно СaСl₂. Активация происходит при значениях pН от 4 до 12, преимущественно от pН 6 до 8, особенно предпочтительно в диапазоне от pН 7 до 8. Для сохранения pН-значения могут добавляться подходящие буферные вещества например Tris НЕРES, глицин и другие. Температура активации может лежать от 0 до 60^oС, предпочтительным является диапазон от О до I0^oC, особенно предпочтительно от 0 до 5^oС. Активированный таким образом энзим может либо использоваться непосредственно, либо при данных условиях освобождаться от активирующего буфера при помощи хроматографии на Ультрогеле АсА 202 (® Ultrogel AcA 202).

Расщепление препроинсулина формулы I приводит к производным инсулина с аргининовыми группами (остатками) из С-конце инсулина и соответствующим отщеплением аминокислотами и/или пептидам. Производные инсулина могут при желании преобразовываться в соответствующие инсулины при помощи карбоксипептидазы В. Карбоксипептидаза В может добавляться в ту же исходную реакционную смесь одновременно с клостриданом, а также при тех же реакционных условиях, названных выше, они могут вводиться друг за другом, причем производное инсулина, при данных условиях перед обработкой карбоксипептидазой В может изолироваться известными методами, такими как, например, хроматография или кристаллизация. Карбоксипептидаза В может использоваться в растворенной или в иммобилизированной форме. Отношение карбоксипептидазы В к производному инсулина составляет (вес к весу) приблизительно от 1:10 до 1:5000, предпочтительно около от 1:500 до 1:3500 и особенно предпочтительно приблизительно от 1:1000 до 1:3000.

Отношение карбоксипептидазы В к клострипану составляет (вес к весу) приблизительно от 1:1 до 10:1 и предпочтительно от 2:1 до 5:1.

Реакционные продукты (клострипан и/или карбоксипептидаза В-расщепления) могут например, осаждаться посредством снижения pН-значения и/или с помощью известных методов колоночной хроматографии могут очищаться. Полученный инсулин может приготавливаться в обычных формах употребления и в качестве лекарства использоваться для лечения диабета.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Культивирование Clostridium histolyticum ДSM 627 осуществляют в питательном растворе следующего состава,
казеинпептон 3
мясной экстракт 3
дрожжевой экстракт 0,5
цистеин 0,05
КН₂РО₄ 0,15
pН 7,2.

Культивирование осуществляют в закрытой посуде в анаэробных условиях при температуре 87^oС в течение 2 дней. Выдерживание штаммов микроорганизмов осуществляют в вышеназванном питательном растворе с 50% глицерина при температуре 20^oС. Ферментер прививают 1% предкультурой. Ферментор с содержимым 10л и 8л питательного раствора засевают. Культивирование осуществляют при насыщении азотом при ЗЗ^oС в течение 24 часов и при постоянном рН 7,0. Изморенная ферментативная активность при этом составляет 20000 U/л в культоральной жидкости (10).

Обработку приблизительно 6000 г осуществляют посредством центрифугирования клеток стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм и добавления 60% ледяного (-20^oС) метанола к фильтрату. Затем раствор выдерживают в течение 24 часов при -20^oС и после этого центрифугируют 8000 г. Окатыш растворяют в стерильной среде и центрифугируют 12000г. Ферментативная активность, измеренная в окатыше, составляет 300 U/мл 200 U/мг протеина. Выход составляет 75% измеренной активности в ферментере.

ПРИМЕР 2. Разведение клеток осуществляют как это описано в примере 1. Рабочая среда в ферментере состояла из,
протеаза пептон (Дифко-Difko) 5
цистеин 0,05
КН₂ РО₄ 0,15
pН 7,2. и засевают 2% из предкультуры. Активность клострипана в культуральной жидкости составляет 45000 U/мл.

Переработку осуществляют посредством фильтрации на 0,3 мкм мембранах (Фильтром Омега Мембран) для отделения клеток и посредством Tangential-Flow- -фильтрации на 10 КД мембранах (Фильтром, Омега Мембран) для концентрирования растворенного клострипана. Коэффициент концентрирования составляет 20. Затем концентрат обессoливают (удалялись соли) и хроматографируют через ДЕАЕ-целлюлозу. Активность клострипана составляет 1000 мл, выход 85% Хранение до использования ферментативного препарата осуществляют при -20^oС.

ПРИМЕР 3.

А. Активирование клострипана.

50 мкл ферментативного препарата (200 U/мл, 286 U/мг из примера 1) 1 мкл активирующий буфер (250 мМ ДТТ, 125 мМ CaCl₂).

Содержание в исходной смеси: ДТТ 5 мМ; CaCl₂ 2,5 мМ. Инкубируют 2 часа на льду. Для реакции расщепления энзим разбавляют 1:40 25 мМ НС1 - буфером рН 7,8.

В. Клострипан-исходная смесь для расщепления для выделения (В31)Arg-инсулина. 1OO мкл Insu-Arg (1 мг/мл) 20 мкл КС1 (1М), 5 мкл Tris/HCl (1М, рН 7,8), 55 мкм Н₂О, 20 мкл клострипан (разведение 1:40).

Содержание в исходной смеси:
Insu-Arg 0,5 мг/мл
клострипан 2,5 U/мл
ДТТ 12,5 мкМ
Tris/HCI 25 Мм
КС1 100 мМ
CaCl₂ 6 мкМ
Инкубируют 1-2 часа при температуре 28^oС, реакция может легко контролироваться посредством хроматографии (HPLC). Затем прекращают реакции при помощи тозил 1 лизни-хлорметилкетона (TLCK). Прекращают реакцию посредством добавления 1 мкмл TLCК (15 мМ). Хранят при 4^oС.

Результат: человеческий инсулин-Агg. С помощью HPLC не обнаруживают никакого образования соединения человеческий инсулин (ДesВЗО).

С. Карбоксипептидаза В-исходная смесь для расщепления для выделения человеческого инсулина. 200 мкл клострипан-исходная смесь, для расщепления 10 мкл карбоксипептидазы B3 (разбавление 1:100). Содержание карбоксипептидазы В в исходной смеси: 2,5 мг/мл. Инкубируют 2-4 часа при температуре 28^oC, реакцию контролируют посредством хроматографии (HPLC). Для реакции карбоксипептидазу В (759 U/мл 150 U/мг из поджелудочной железы свиньи) разбавляют 1:1000 буфером 25 мМ Tris/HCl, рН 7,8.

Результат: человеческий инсулин. Никакого образования вещества инсулин (ДesВЗО), которое измерялось бы посредством HPLC.

D. HPLC аналитики.

Расщепление контролируют при помощи использования колонки RP 18 (0,125 М NH₄(SО₄)₂, с H₂SO₄ устанавливают рН 4, 25-50% ацетонитрил-градиент ) или же колонки С 8 (0,1% ТFА, 20-50% ацетонитрил-градиент).

ПРИМЕР 4. Клострипан: 200 U/мл (из примера 1).

Активирующий буфер: 500 мМ Tris/HCI, рН 7,8; 100 мM ДТТ; 2 Мм CaCl₂.

Активация: 100 мкл раствора клострипана; 10 мкл активирующего буфера.

Исходная смесь: 35,7 мг человеческий Пре- В-цепь А -цепной инсулин-сульфонат; 315 мкл 1 M меркаптоэтанол; 105 мкл 1 М аскорбиновая кислота; 100 мл 20 мМ глицин-буфер рН 10,7.

Хранение исходной смеси осуществляют в течение ночи, в холодильнике, при температуры 4^oС, выход составлял 0,152 мг/мл. После отделения загрязнений при помощи снижения рН, при рН 5,0 добавляют Тris в конечной концентрации 50 мМ, и значение рН устанавливают на 7,8 при помощи НС1. Добавляют 30 мкл ферментного(энзимного) раствора. Расщепление осуществляют при температуре ЗО^oС и контролируют хроматографически (HPLC).

Результат: названный выше прапроинсулин расщепляют в человеческий инсулин Аrg. Образование инсулина (ДesBЗ0) минимально.

Л И Т Е Р А Т У Р А
I. ЕР А 347 781.

2. ЕР А 367 163.

3. ДЕ Р 344 0988.

4. ЕР А 026 4250.

5. Kemmber W.et al. J-Biol. Chem. 246, 1971, 6786 67-91.

6. EP A 195 691.

7. EP В 89 007.

8. Mitchell et al. J. of Biol. Chem. 243 (18), 4683 4692, 1968.

9. Lebouesse В. Bull. Sac. Chim. Biol. 42, 1293, 1960.

10. Mitchell W. Meth. of Enzym. Bd. 47 (1977), scite 165 170.

11. Colowick und Kaplan, Meth. Enzymol.V. XLIX.

Формула изобретения

1. Способ гидролиза аминокислотной последовательности предшественника инсулина человека, включающий обработку протеазой соединения формулы

где R водород, либо химически или ферментативно отщепляемый аминокислотный остаток, или пептид, содержащий от 2 до 30 аминокислотных остатков;
X аргинин или С-цепь проинсулина человека;
А1-А20 аминокислотная последовательность А-цепи инсулина человека;
В1-В29 аминокислотная последовательность B-цепи инсулина человека,
отличающийся тем, что в качестве протеазы используют клострипаин из Clostridium histolyticum, активированный в присутствии ионов кальция и SH - реагента, гидролиз проводят при рН 6 9, температуре 20 40^oС и соотношении фермента и субстрата (ед/мг) от 0,1:1 до 50:1, а полученное Arg - производное инсулина при необходимости обрабатывают карбоксипептидазой В.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация предшественника инсулина составляет от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл.