Способ получения свободных аминокислот из биологической ткани

 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к медицинской химии. Цель изобретения - повышение точности способа. Новизна заключается в том, что ткань предварительно высушивают при температуре +60-70^oC, затем измельчают и экстрагируют буферным раствором при физиологических значениях pH при температуре 70^oC в течение 2 часов с последующим количественным определением свободных аминокислот в полученном экстракте. 1 ил.

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно, к медицинской химии, к методам анализа свободных аминокислот различных биосубстратов, и может быть использовано в диагностических и исследовательских целях, а также в областях народного хозяйства, где исследуют аминокислоты тканей.

В настоящее время существенно возрос интерес к изучению аминокислот различных биосубстратов, поскольку они являются одними из важнейших показателей азотистого обмена при различных патологических состояниях. Поэтому разработка методов их анализа является актуальной задачей.

Известны способы выделения свободных аминокислот из тканей. (S.Macaione, P.Reygeri, F.De Luca, G.Tucci, Free amino acids in developing rat Retina//F. Neurochem, 1974, v. 22, p. 887). Ткань гомогенизируют в 2 2,5 мл холодной дистиллированной воды при температуре 0^oC. Далее депротеинизируют 1 объемом 5% сульфосалициловой кислоты и центрифугируют 20 мин. при +4^oC. Супернатант используют для количественного определения аминокислот.

Наиболее близким к предлагаемому способу [1] при котором измельченные навески тканей заливают физиологическим раствором и гомогенизируют в гомогенаторе Поттера-Эльгевейма. В полученный гомогенат по каплям приливают 12% раствор сульфосалициловой кислоты, смесь тщательно перемешивают и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Отдельный супернатант выпаривают досуха в роторном вакуум испарителе при -40^oC и сохраняют до анализа при температуре не выше -18^oC. непосредственно перед анализом исследуемый образец разводят натрий-цитратным буфером pH 2,2 до необходимой концентрации и проводят количественное определение аминокислот известным методом, например, ионообменной хроматографии.

Однако, указанный способ, также как и аналог, имеет ряд существенных недостатков.

1. Способ не учитывает влияние влажности тканей на уровень свободных аминокислот. Известно, что влажность различных тканей вариабельна, поэтому невозможность ее контроля понижает точность анализа.

2. Существующий в тканях пул свободных аминокислот состоит из аминокислот внеклеточной жидкости и внутриклеточного запаса свободных аминокислот, который в 5 6 раз выше их уровня во внеклеточной жидкости. В способе-прототипе предусмотрена гомогенизация тканей, что приводит к определению общего пула свободных аминокислот. Таким образом, способ -прототип не позволяет оценивать уровень свободных аминокислот межклеточного пространства, который как раз и является истинно свободным.

3. Способ предусматривает быструю обработку извлеченных тканей, в связи с чем исключена возможность их хранения.

4. Способ технически сложен и потребует использования гомогенизатора Поттера-Эльгевейма, роторного вакуумного испарителя.

Целью изобретения является повышение точности и упрощение анализа свободных аминокислот тканей.

Указанная цель достигается путем хроматографического исследования тканевых экстрактов свободного пула аминокислотного фонда межклеточного пространства из предварительно высушенного объекта исследования.

Способ основан на явлении высокой термоустойчивости аминокислот, что связано с их химической устойчивостью. Так, крайние параметры температур разложения аминокислот составляют: для цистеина 173^o и для тирозина - 344^oC. (Дроздова Т.В. Геохимия аминокислот. М.Наука, 1977. с.19).

Способ осуществляют следующим образом. Извлеченную анализируемую ткань высушивают при мягких температурных условиях 60 70^oC до постоянного веса, что приводит к инактивации ферментов, разрушающих аминокислоты, а также удалению влаги. Высушенные ткани можно хранить длительное время. Непосредственно перед анализом высушенную ткань измельчают на небольшие кусочки (3·3 мм), взвешивают, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера pH 7,2 7,5 и экстрагируют при температуре 70^oC в течение 2 часов (рис.1). Затем аликвоту экстракта смешивают с равным объемом 8% сульфосалициловой кислоты для депротеинизации, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант смешивают с цитратным буфером pH 2,2 и проводят хроматографическое определение свободных аминокислот тканей.

Проведенные нами исследования показали, что в коже, например, средний уровень свободных аминокислот составляет 0,013±0,0005 мкг/г (n 88).

Пример конкретного выполнения способа. Во время острого опыта был изъят участок кожных покровов морской свинки, который освободили от жировой клетчатки и высушили в термостате при 60^oC. Затем навеску измельченной скальпелем кожи 0,084 г проэкстрагировали фосфатным буфером pH 7,4 при разработанных условиях провели осаждение белка равным объемом 8% раствора сульфосалициловой кислоты, аликвоту пробы смешали с цитратным буфером pH 2,2 и на аминокислотном анализаторе "Биотроник 1С-5001" провели ионообменно хроматографическое определение свободных аминокислот ткани кожных покровов.

Проведенное исследование показало, что в кожных покровах содержится, мкг/г: аспарагиновой аминокислоты (АК) 316,93 треонина 538,88 серина 1055,90 глутаминовой АК 1099,97 пролина 3433,11 глицина 1429,90 аланина 1226,05 цистина валина 675,01
метионина 101,59
изолейцина 243,60
лейцина 599,63
тирозина 267,47
фенилаланина 440,51
гистидина 724,08
лизина 808,92
аргинина 1308,63
аммиака 308,57
сумма аминокислот 14270,18
Таким образом, разработанный нами способ имеет следующие преимущества:
1. Проводить анализ истинно свободного пула аминокислот, содержащегося в межклеточном пространстве.

2. Анализ аминокислот из высушенных тканей значительно объективизирует данные об уровне свободных аминокислот.

3. Объекты исследования можно хранить в высушенном состоянии.

Указанные преимущества повышают точность анализа свободных аминокислот.

Формула изобретения

Способ получения свободных аминокислот из биологической ткани путем измельчения ткани, обрабатывают сульфосалициловой кислотой, центрифугирования с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что ткань перед измельчением высушивают при температуре 60-70^oС, а после измельчения взвешивают и экстрагируют в буферном растворе при физиологическом значении рН и температуре 70^oС в течение 2 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1