Штамм культивируемых клеток почки oryctolagus cuniculus l для культивирования вирусов животных

 

Использование: вирусология, ветеринария, биотехнология. Сущность изобретения: монослойно-суспензионный штамм К-13/91 получен методами адаптации, отбора и селекции клеток почки кролика на полусинтетических питательных средах, обладает стабильными морфо-физиологическими характеристиками и чувствительностью к заражению вирусами ящура типов А₂₂-663, O₁-194, C₁-154, Азия-1-48, БГ, ССЯ-76, ВБС и АЧЛ, репродуцирует их при культивировании в монослое или суспензии в титрах 5,0-6,5 lg ТЦД₅₀/мл, хранится в музее клеток ВНИИЗЖ и депонирован на 45 пассаже в суспензии в ВСКК (СХЖ) РАСХН под N 46. 11 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, биотехнологии и касается получения нового штамма перевиваемой линии клеток почки кролика, которая может быть использована для репродукции вирусов болезней животных при осуществлении вирусологических исследований и изготовлении антигенов для диагностики и профилактики заболеваний животных указанной этиологии.

Перевиваемые культуры клеток млекопитающих широко используются в вирусологии для проведения научных исследований и в производстве биопрепаратов (Новхатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. М. 1979, 156 с; Голубов Д.Б. Соминина А.А. Медведева М.И. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. М. 1976, 316 с; Сюрин В. Н. Белоусова Р.В. Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. М. Агропроиздат, 1991, 528 с). Их получают из различных органов и тканей животных с помощью разнообразных методических приемов и питательных сред для культивирования (Дьяконов Л. П. Глухов В.Д. и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие. Ставрополь, 1988, ч. 2, 96 с).

Несмотря на их общее свойство способность к неограниченному росту все они значительно различаются по ряду других признаков: способности размножаться в определенной питательной среде, пролиферативной активности, чувствительности к вирусам, цитогенетике и др. которые меняются в зависимости от условий культивирования и требуют постоянного кариологического контроля (Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных М. Колос, 1976, 304 с. Вирусология, Методы. Под редакцией Б.Мейхи. Пер. с англ. М. Мир, 1988, 344 с. Зуев В.В. Смыслова Е.Ю. Кушнир С.Д. Влияние адаптации к новым средам на кариологическую изменчивость клеток СПЭВ. Вопросы вет. вирусолог. микроибол. и эпизоотолог. Тезисы докл. научн. конф. Покров, 1985, 102-104; Мамаева С. Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. Л. Наука, 1987, 78). Даже клоны одной перевиваемой линии клеток значительно отличаются друг от друга. Castro M. R. и Рysany R.S. получили различные по чувствительности к вирусу ящура клоны клеточной линии IB-RS-2 (Castro M.R. Рysany R.S. Variation of cell clones derived from the IB-RS-2 suhue cell line to the foot-and mouth disease virus. Arg,Inst.Biol. 1967, 34, 4, 295-299).

Монослойные культуры клеток широко используются в лабораторной практике. Известно использование монослойных культур клеток ВНК-21, IB-RS-2, щитовидной железы телят, СПЭВ, тестикулов поросят, ПСГК-30 и т.д. для культивирования вируса ящура, чумы свиней и т.п. (пат. Великобритании N 1436323, С 6 F, А5В, 19.05.76 г. пат. Франции N 2088038, С 12 К 5/00, 07.01.72 г. пат. Франции N 1526357; С 12 К, 16.04.68; Дегтяренко Н.Л. Савельева Л.Г. и др. Определение видовой принадлежности постоянной линии клеток ПСГК-30. Матер. межд. конф. "К новой стратегии борьбы с ящуром". Тез. докл. Владимир, 1991, 121-1227.

Однако технология монослойного культивирования клеток и вируса трудоемка, связана со значительным риском бактериального загрязнения и с большими материальными затратами.

Кроме того, большая часть монослойных перевиваемых клеточных линий состоит из неоднородных в морфологическом и физиологическом отношении клеток, что обусловливает необходимость получения новых клеточных клонов, которые отличаются от материнской линии рядом положительных свойств и могут быть использованы для получения стабильных суспензионных клеточных линий.

Известен штамм 13 перевиваемой линии клеток ВНК-21, который отличается от материнской линии набором хромосом и, кроме того, способностью размножаться в суспензии (Mepherson J. Stoker M. Polyoma transformation of hamster cell clones om investigation of genetic faktors affecting cell competence. Virology, 1961, 16, 147-151).

Длительное пассирование этой культуры клеток в условиях разных лабораторий изменило некоторые характеристики клеток в отрицательную сторону: низкая митотическая активность, нестабильный рост при длительном пассировании в суспензии, микоплазменная контаминация. Кроме того, вакцины, полученные из вируса, выращенного в гетерологичных культурах клеток, вызывают у привитых животных аллергические заболевания при повторных вакцинациях или даже при первичной прививке (пат. ФРГ N 2206779, С 12 К 7/00, 16.08.73 г).

Известен также штамм культивируемых клеток почки свиней IB-RS-2, адаптированный к суспензионному культивированию (Charman W.C. Ramshow I.A. Crowth of the IB-RS-2 рig kigney cell line in suspension culture and its susceptibility to foot-and month disease virus. Appl. Microbiol. 1971, 22, 1, 1-5).

Однако последнее упоминание об этой культуре клеток относится к 1976 году. Эта культура, по-видимому, была потеряна.

Известен также штамм культивируемых в суспензии клеток ПСГК-60с. Установлено, что эта культура высокочувствительна к вирусам различных таксономических групп: вирусу катаральной лихорадки овец, везикулярного стаматита, ящура, везикулярной болезни свиней (ВБС) и др. Размножение вирусов в этой культуре клеток происходит в высоких титрах без предварительной адаптации (Балышева В.И. Жестерев В.И. и др. Перспективы использования культуры клеток ПСГК в вирусологической практике. Мат. научн. конф. ВНИИВВиМ "Вопросы вет. вирусолог. микробиолог, и эпизоот". Покров, 1992, ч.II, 290-291).

Наиболее близким предлагаемому решению по совокупности признаков является штамм культивируемых клеток почки кролика RK-13-продуцент вирусов человека и животных (Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. М. 1979, сер. Вирусология, т.8, Тканевые и клеточные культуры, с.24). Указанная линия поступила из Венгрии во ВНИИ защиты животных 17.10.83 г. без паспортных данных. К 15 пассажу в монослое культура была адаптирована к среде Игла с 10% сыворотки КРС, рН 7,0-7,1 и имела следующие характеристики: 1. Способ поддержания. Выращивают в пристеночных культурах при 37^oС. Для диспергирования клеточного пласта при очередном пересеве используют смесь из 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 1:3 с добавлением 0,5% декстрозы.

2. Ростовые свойства. При пересеве с кратностью 1:3 монослой формируется на 3 сутки и сохраняется в течение 5 суток.

3. Морфология. Клетки эпителио- и фибробластоподобного типа.

4. Кариология. Кариотип стабильный. Модальный класс составляют клетки с 62 хромосомами, свойственные кролику.

5. Среда замораживания. Питательная среда Игла 80% сыворотка КРС 10 и диметилсульфоксид 10% 6. Ревитализация. После хранения в жидком азоте при -196^oС жизнеспособность 80% исходные свойства восстанавливаются через 4-5 пассажей в монослое.

Данная линия клеток имеет ряд недостатков, из которых существенными являются: 1. Низкая профилеративная активность (1:2), обусловливающая необходимость большого расхода диспергирующего раствора и времени получения необходимого количества клеточной массы.

2. Высокая опасность контаминирования клеток при диспергировании.

3. Длительность процесса ревитацилизации после хранения в жидком азоте при -196^oС.

4. Строго опорозависимый характер роста клеток исключает возможность их крупномасштабного культивирования в суспензии.

5. Активность получаемого вируса ящура в культуральном материале не превышала 4,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Сущность изобретения.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового штамма клеток почки кролика, растущего в монослое и в суспензии, обладающего более высокой пролиферативной активностью, более длительной сохраняемостью клеточного пласта, что позволяет получать большое количество клеточной массы и вируссодержащего культурального материала с высокой инфекционной активностью.

Поставленная задача решается тем, что с использованием методов адаптации, отбора и селекции клеток на питательных средах в монослое и суспензии получен новый штамм культивируемых клеток почки кролика (Oryctolagus cuniculus L) RК-13/91 продуцент вирусов животных. Полученный штамм хранится в музее клеток ВНИИЗЖ и депонирован на уровне 45 пассажа в суспензии в ВСКК (СХ-Ж) РАСХН под N 46.

Полученный штамм клеток RК-13/91 отличается от штамма-прототипа следующими признаками: 1. Штамм RК-13/91 способен размножаться как в монослое, так и в суспензии на полусинтетических питательных средах.

2. В монослое и в суспензии клетки растут на среде Игла с 2-5% сыворотки крови КРС.

3. Штамм RК-13/91 формирует монослой при рассеве 1:6-1:8 через 72 часа. Монослой сохраняется в течение 10 суток без смены питательной среды.

4. Штамм RК-13/91 хорошо сохраняется при 4^oС в течение 2 недель и при -196^oС в течение 18 месяцев (срок наблюдения) с сохранением 80-90% жизнеспособных клеток. Исходные свойства восстанавливаются на 1-2 пассажах.

5. Штамм RК-13/91 стабилен и сохраняет свои генетические свойства в течение 108 пассажей, что дает возможность стандартизировать результаты выращивания клеток и вирусов.

6. Штамм RК-13/91 обладает более высокой чувствительностью и репродукционной способностью в отношении вирусов болезни Гамборо (БГ), энтерита норок (ЭН), синдрома снижения яйценоскости штамм 76 (CCЯ-76), африканской чумы лошадей (АЧЛ) и болезни Ауески (БА).

Характеристика полученного штамма.

1. Родословная штамма.

Перевиваемая культура клеток RК-13 поступила из Венгрии 17.10.83 г. Во ВНИИЗЖ штамм получен методами адаптации, отбора и селекции клеток на питательных средах в монослое и суспензии.

2. Число пассажей к моменту паспортизации. Штамм клеток имеет 45 пассажей в суспензии.

Стандартные условия выращивания.

Штамм клеток выращивается при температуре 37-38^oС в пристеночных условиях в сосудах различной емкости в среде Игла с 5-10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина; в суспензии в модифицированной среде Игла без солей кальция с пируватом натрия, 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина. Возможно культивирование на средах с гидролизатом белков животного происхождения.

4. Культуральные свойства.

Клетки формируют полный, плотный монослой, обладающий ориентированным ростом и поэтому образуют характерный рисунок на субстрате. Дезагрегацию клеток осуществляют с помощью смеси трипсин версен (1:3) с добавлением 0,5% декстрозы. В зависимости от кратности рассева (1:3-1:8), от посевной дозы (50-150 тыс/мл), количества сыворотки (2-5-10%) субкультирование составляет 2-4 суток.

5. Ростовые (кинетические) характеристики (в монослое).

При посевной концентрации 50-100 тыс/мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды.

6. Ростовые (кинетические) характеристики (в суспензии).

При посевной концентрации 500 тыс/мл индекс пролиферации на 48 ч составлял 3 в сосудах без подачи воздуха.

7. Цитоморфологические характеристики.

Монослой ровный, рост ориентированный. Клетки полигонального и фибробластоподобного типа. Ядра округлые, встречаются единичные гигантские клетки, содержащие от 1 до 3 ядер. Ядрышки крупные, полиморфные. Цитоплазма зернистая, слегка вакуолизирована.

Суспензия клеток однородна. Клетки располагаются дискретно, иногда образуют группы по 2-5 клеток.

8. Кариологическая характеристика штамма.

Кариотип соответствует видовому признаку кролика.

Модальный класс 62 хромосомы 18% Диплоидных хромосом 0% Гипоплоидных хромосом 0% Гиперплоидных хромосом 100% 9. Маркерные признаки и методы их оценки.

Маркерные признаки не выявлены. Штамм по цитокариологии и спектру изоферментов (лактатдегидрогеназа ЛДГ, глюкоза 6 фосфатдегидрогеназа - Г6ФДГ) относится к виду кроликов.

10. Данные о видовой принадлежности.

Кариотип и изоферменты ЛДГ и Г6ФДГ соответствуют виду кролика. Штамм обладает высокой устойчивостью и сохраняет видовую принадлежность в процессе 108 последовательных пассажах в монослое и в суспензии, при замораживании, хранении при -196^oС и ревитализации.

11. Характеристики контакминированности.

Контаминанты не выявлены (высевы на МПА, МПБ, ТГС, среду Сабуро, 0,3% РРL O-агар).

12. Биотехнологические характеристики.

В монослое клетки выращивают при 37-38^oС в среде Игла, рН 7,0-7,2 с 2-5-10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина, кратность пересева 1:3, посевная концентрация 100-150 тыс/мл, образование монослоя к 48-72 часам инкубирования без смены среды. Клетки снимают со стекла подогретой до 37^oС смесью трипсин-версен (1:3) с 0,5% декстрозы.

В суспензии клетки выращивают в среде Игла без солей кальция с пируватом натрия, 10% сыворотки КРС при посевной концентрации 500 тыс/мл, индекс пролиферации 3 к 48 ч культивирования в сосудах без подачи воздуха.

При отсутствии среды Игла клетки RК-13/91 могут быть успешно адаптированы в течение последовательных пассажей к питательным средам, основанным на гидролизатах белков крови, мышц и молока КРС, с внесением 5% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина.

Штамм обладает высокой устойчивостью и сохраняет видовую принадлежность в процессе 108 последовательных пассажах в монослое и в суспензии, при замораживании, хранении при -196^oС и ревитализации. Жизнеспособность штамма определяют суправитальной окраской трипоновым синим и посевом в культуральные сосуды.

Штамм обладает чувствительностью к заражению вирусами различных таксономических групп, в том числе вирусами ящура типов А₂₂ 663, O₁ 194, C₁ 154, Азия-1-48, БГ "Ухтинский", ЭН шт. "Родники", ССЯ-76, ВБС и АЧЛ и репродуцирует указанные вирусы при культивировании в монослое или суспензии в титрах 5,0-6,5 lg ТЦД₅₀/мл. Накопление вирусов определяют титрованием в культурах клеток RК-13/91, СП, ПСГК-30 и т.п.

Результаты исследований по накоплению вирусов в монослое клеток RК-13/91 приведены в табл.1.

Накопление инфекционной активности этих вирусов в суспензии полученного штамма была на 0,5-0,75 lg ТЦД₅₀/мл выше, чем в монослое.

Штамм может быть использован для репродукции вирусов животных при осуществлении вирусологических исследований и изготовлении антигенов для диагностики и профилактики вирусных заболеваний животных.

13. Криоконсервационные характеристики.

Штамм клеток сохраняют в жидком азоте при -196^oС под защитой криофилактика с 5% этиленгликоля в ростовой среде Игла с 10% сыворотки КРС в стеклянных ампулах до 50 мл, концентрации клеток 8-10 млн/мл. Замораживание проводят со скоростью 1-2^oС в минуту до -70^oС, до -130^oС со скоростью -3-4^oС, затем в парах жидкого азота и в азоте при -196^oС.

Розмораживание клеток проводят путем оттаивания ампул с суспензией клеток в водяной базе при 37-38^oС. Жизнеспособность клеток определяют визуально под световым микроскопом, предварительно окрашивая их 0,01% трипановым синим. Жизнеспособность после размораживания 85-92% Свою исходную скорость роста клетки восстанавливают после 1 пассажа в монослое.

Предложенный штамм культивируемых клеток почки кролика получили следующим образом.

Перевиваемая культура клеток почки кролика RК-13 поступила из Венгрии. Предложенный штамм получен методами адаптации, отбора и селекции клеток RК-13 на различных питательных средах в монослое и суспензии. Трофическую переадаптацию клеток к среде Игла проводили в течение 5 последовательных пассажей в монослое с рассевом 1:2. Сначала клетки выращивали в смеси с питательной средой, привезенной из Венгрии, и средой Игла в соотношении 4:2, 6: 4, 5:5, 4:6, 2:8 и затем в среде Игла. При этом морфология клеток и кариотип остались стабильными. В среде Игла клетки культивировали в течение 10 пассажей при рассеве 1:3, при этом клетки хорошо прикреплялись к стеклу и формировали монослой на 3-4 сутки. Однако сформированный монослой плохо сохранялся из-за быстрого старения клеток.

На следующем этапе в течение 10 пассажей клетки RК-13 культивировали в среде Игла при рН 7,8-8,0 и отбирали сосуды с клетками, которые быстро формировали монослой. Методом избирательного селективного отбора получить клеточную популяцию, состоящую в основном из клеток эпителиального типа полигональной формы, плотно прилегающих друг к другу. При пересеве 1:3 такие клетки формировали монослой на 3 сутки культивирования с приростом клеток в 4 раза. Монослой сохранялся на стенке без смены среды до 10 суток.

Дальнейшее культивирование клеток в течение 10 пассажей проводили с кратностью пересева 1:6 при рН среды 7,2-7,4. Клетки к 8 пассажу стали способны формировать монослой на 4 сутки, давая 6-кратный прирост клеточной массы. В популяции клеток получили распространение как клетки эпителиального, так и фибробластоподобного типа. Для закрепления способности клеток быстро формировать монослой провели 15 последовательных пассажей при кратности рассева 1: 8. Клетки формировали монослой на 4 сутки. Эту популяцию клеток под авторским названием RК-13/91 заложили на хранение в жидкий азот при -196^oС в музей культур клеток ВНИИЗЖ. Кроме того, клетки культивировали в среде Игла с 5 и 2% сыворотки крови КРС. При рассеве 1:3 после 5 пассажа клетки формировали монослой на 2-3 сутки, давая соответственно 3-4-кратный прирост клеточной массы.

Для получения клеток К-13/91, растущих в суспензии, штамм клеток в течение 10 пассажей выращивали в культуральных сосудах емкостью 1,5 л в модифицированной среде Игла без солей кальция с пируватом натрия и 10% сыворотки крови КРС. Клетки снимали со стекла диспергирующим раствором бесцентрифужным методом. Для этого из матрасов удаляли ростовую среду, монослой дважды отмывали диспергирующим раствором, содержащим 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 3:1 с добавлением 0,5% декстрозы. Затем этот же раствор в количестве 30 мл вносили в матрас с монослоем клеток и оставляли на 5 минут при комнатной температуре. По истечении указанного времени диспергирующий раствор сливали. Полученную однородную взвесь, состоящую в основном из одиночных клеток, ресуспензировали в среде Игла без солей кальция с пируватом натрия при рН 7,2 с 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина до концентрации 150-200 тыс.кл/мл. Через 48 ч культивирования при достижении культурой плотного монослоя клетки отделяли от стекла покачиванием культуральной среды. Полученную суспензию центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Урожай клеток из нескольких матрасов объединяли для получения инокулянта в 2·10⁵ кл/мл для посева новой культуры. Процедуру повторяли 15 раз. Таким образом получили 50% клеток, которые могли оседать на поверхность стекла, но не прикpепляться и не распластываться. Такие клетки собирали и в концентрации не менее 5·10⁵ кл/мл помещали во вращающиеся культуральные сосуды и культивировали при 37^oС в среде Игла без кальция с пируватом натрия с 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина. Через каждые 24 ч отбирали пробы и подсчитывали жизнеспособные клетки.

Через 48 ч клетки осаждали и суспендировали в новой (свежей) среде до 5·10⁵ кл/мл. В течение первых 6 пассажей прирост клеток составлял 0,8-1,0 млн/мл при 80-85% жизнеспособных клеток. По мере адаптации клеток и глубинному методу выращивания количество жизнеспособных клеток увеличивалось до 94-97% при этом их плотность на пассаже достигала 1,8-2 млн/мл, а с 20 пассажа до 9,6 млн/мл через 48 ч культивирования. Полученный штамм клеток заложен на 45 пассаже на хранение в жидком азоте в музей культур клеток ВНИИЗЖ под авторским наименованием RК-13/91 и депонирован на дублированное хранение в ВСКК (СХЖ) РАСХН под N 46.

В целях расширения использования культуры клеток RК-13/91 в биотехнологии вакцин и диагностикумов проводили адаптацию путем последовательного пассирования штамма клеток к выращиванию в гидролизатных питательных средах в монослое и в суспензии для культивирования вирусов.

Для этого использовали среды, изготовленные на основе 0,5% гидролизата лактальбумина, 0,25% ферментативного гидролизата белков мышц КРС (ФГМ-С), 0,25% ферментативного гидролизата белков крови КРС (ФГБК-С), 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина, разработанные во ВНИЯИ для выращивания клеток ВНК-21/2-17 и вируса ящура в монослое и в суспензии (Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21), утверждена ГУВ МСХ СССР 24.01.91 г.

Результаты адаптации клеток RК-13/91 к гидролизатным питательным средам в монослое приведены в табл.2.

Результаты, приведенные в табл.2, свидетельствуют о том, что штамм клеток RК-13/91 можно выращивать на полусинтетических питательных средах также успешно, как и на среде Игла.

Результаты адаптации клеток RК-13/91 и гидролизатным питательным средам в суспензии приведены в табл.3.

Данные табл.3 свидетельствуют о возможности культивирования штамма клеток RК-13/91 в суспензии на гидролизатных средах.

Клетки, выращенные на полусинтетических средах, оказались высокочувствительным к вирусам ящура, БГ, ЭН, ССЯ-76 и не уступали по чувствительности известным перевиваемым линиям клеток. Свойства суспензионного штамма клеток RК-13/91 подтверждены комиссионно (акт прилагается).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами выращивания вирусов различных таксономических групп, что не ограничивает объем изобретения.

Пример 1. Выращивание вируса БГ в монослое культуры клеток RК-13/91.

Для культивирования вируса используют клетки RК-13/91, выращенные в монослое в необходимом количестве. Клетки масштабируют в 1,5-литровых матрасах на средах по прописи Игла с добавлением гидролизатов белков крови или мышц, или молока КРС, 5% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина при рН 7,0-7,2. Посевная концентрация 100-120 тыс. кл/мл. Через 48 ч после образования сплошного плотного монослоя питательную среду удаляют, монослой дважды промывают ростовой средой, но без сыворотки и глутамина. После этого в матрасы вносят вирус БГ, адаптированный к культуре клеток RК-13/91 с высокой инфекционной активностью. Множественность заражения составляет 0,01-0,1 ТЦД 50/клетки или 1:20-1:30 к объему питательной среды. Контакт вируса с клетками осуществляют в течение 60 мин при 37^oС и периодическом покачивании матрасов для орошения клеточного пласта вируссодержащим материалом. Вирус удаляют и в матрасы заливают поддерживающую среду с объеме 1:10 от объема сосуда при рН 7,4-7,5. Культивирование ведут в течение 48-72 часов до максимального проявления цитопатического эффекта, свойственного данному вирусу (дегенерация 60-80% клеток монослоя). Вируссодержащий материал титруют в монослое культуры клеток RК-13/91. Статистическую обработку результатов проводят по методике Ашмарина-Воробьева. Активность вируса составляет 5,5-6,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 2. Выращивание вируса БГ в суспензии культуры клеток RК-13/91.

Для культивирования вируса используют монослойно-суспензионную культуру клеток, выращенную в монослое или в суспензии в необходимом количестве при концентрации клеток для инфицирования 2,0-2,2 млн кл/мл при 94-97% жизнеспособных. Множественность инфицирования составляет 0,01-1,0 ТЦД₅₀/клетка или 1:30-1:50 к объему суспензии. Для репродукции используют вирус, адаптированный к штамму клеток RК-13/91 и имеющий высокую, биологическую активность (не ниже 6,0 lg ТЦД₅₀/мл).

Для выращивания вируса в суспензии используют питательную среду Игла, применяемую для культивирования клеток RК-13/91 в суспензии без сыворотки рН 7,4-7,5. Культивирование вируса ведут на оборудовании, обеспечивающим стабильную температуру суспензии (+37^oС), перемешивание, препятствующее седиментации клеток и способствующее равномерному перемещению слоев суспензии внутри сосуда, рН и газовый режим на протяжении 72 ч культивирования. Культивирование ведут до максимального лизиса клеток (60-80%) в течение 72 ч. Инфекционную активность вируса определяют титрованием в монослое культуры клеток RК-13/91 и выражают в lg ТЦД₅₀/мл. Титр вируса БГ, выращенный в таких условиях, обычно составляет 5,5 6,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 3. Культивирование вируса ящура штамм А₂₂-663 в монослое культуры клеток RК-13/91.

Для выращивания вируса культуру клеток масштабируют в культуральных сосудах емкостью 1,5 л на средах по прописи Игла или на основе гидролизатов белков крови или мышц, или молока КРС с 5% сыворотки крови КРС и 0,03% глутамина, рН 7,0-7,2. Посевная концентрация 100-150 тыс. клеток/мл. После образования плотного монослоя (через 48 ч от посева клеток) ростовую среду удаляют, монослой промывают средой, аналогичной среде выращивания клеток без сыворотки и глутамина.

В матрасы с клетками вносят вирус ящура А₂₂-663, адаптированный к штамму клеток RК-13/91, с множественностью заражения 0,01-01 ТЦД₅₀/клетка или 1: 20-1:30 к объему поддерживающей среды.

Далее осуществляют контакт вируса с клетками в течение 60 минут при 37^oC при периодическом покачивании матрасов для орошения клеточного пласта вируссодержащим материалом. Вирус удаляют и в матрасы добавляют поддерживающую среду в объеме 1:10 к объему сосуда, состоящую из аналогичной среды без сыворотки, рН 7,4-7,5. Культивирование вируса ведут до полного лизиса монослоя (около 48 ч от внесения вируса), затем его собирают в отдельную емкость, отбирают пробы для определения инфекционной и антигенной активности вируса. Результаты выращивания вируса ящура А₂₂-663 помещены в табл.4.

Пример 4. Культивирование вируса ящура O₁-194 в монослое штамма клеток RК-13/91.

Культуру клеток готовят так, как описано в примере 3. Для выращивания используют вирус ящура O₁-194, адаптированный к клеточной культуре RК-13/91. Культивирование вируса ведут согласно примеру 4. Результаты опытов приведены в табл.5.

Пример 5. Культивирование вируса ящура С₁-564 в монослое штамма клеток RК-13/91.

Клеточную культуру готовят так как описано в примере 3. Для выращивания используют вирус ящура С₁-564, адаптированный к клеткам RК-13/91. Культивирование вируса ведут по схеме, описанной в примере 3.

Результаты опытов обобщены в табл.6.

Пример 6. Культивирование вируса ящура Азия-1 шт.48 в монослое клеток RК-13/91.

Клеточную культуру готовят так, как описано в примере 3. Для выращивания используют вирус ящура Азия-1 шт. 48, адаптированный к клеткам RК-13/91. Культивирование вируса проводят по схеме, описанной в примере 3. Результаты опытов представлены в табл.7.

Пример 7. Выращивание вируса ЭН шт. "Родники" в монослое клеток RК-13/91.

Клеточную культуру готовят аналогично примеру 1. Для выращивания используют вирус ЭН шт. "Родники", адаптированный к культуре клеток RК-13/91. Культивирование вируса ведут в последовательности, описанной в примере 1. Результаты опытов помещены в табл.8.

Пример 8.

Выращивание вируса ССЯ-76 в монослое клеток RК-13/91.

Штамм клеточной культуры RК-13/91 масштабируют так, как описано в примере 1. Для выращивания используют вирус ССЯ-76, адаптированный в клетках RК-13/91. Культивирование проводят в последовательности, описанной в примере 1. Результаты исследований представлены в табл.9.

Проведена сравнительная оценка чувствительности предложенного штамма клеток RК-13/91 и штамма-прототипа к вирусу ящура А₂₂-663. Результаты исследований приведены в табл.10.

Результаты исследований, обобщенные в табл.10 показали, что накопление инфекционной активности вируса ящура А₂₂-663 в клетках RК-13/91 на 1 lg ТЦД₅₀/мл выше, чем в исходных клетках.

Результаты сравнительного изучения чувствительности к вирусам полученного штамма клеток RК-13/91 и существующих линий клеток, хранящихся в коллекции института, показаны в табл.11. Вирусы выращивали в суспензии клеток по известным методикам.

Данные таблицы 11 свидетельствуют о том, что по чувствительности к вирусам различных токсономических групп культура клеток RК-13/91 не уступает известным клеточным линиям.

Предложенный штамм клеток RК-13/91 найдет применение для репродукции вирусов животных при проведении вирусологических исследований и изготовлении антигенов для диагностики и профилактики вирусных заболеваний животных.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки 1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М. Мир, 1983, 264 с.

Беляев Н. Е. Прохоров В.В. Бондаренко А.Ф. Черняева Т.Ю. Лебедева Н.Н. Филиппова Н.П. Герасимов В.Н. Подготовка посевного вируса ящура для промышленного культивирования в суспензионных клетках ВНК-21. К новой стратегии борьбы с ящуром. Международная конф. Владимир, 1991, 109-110.

3. Бурдов А.Н. Дудников А.И. Малярец П.В. Иванющенков В.Н. Рахманов А.М. Шажко Ж.А. Ящур. М. Агропромиздат. 1990, 320 с.

4. Вирусология. Методы. Под редакцией Б.Мейхи Пер. с анг. М. Мир, 1988, 344 с.

5. Витин В.Г. Чермашенцев В.И. Рудобельский Э.В. Леонтьева Н.А. Шевченко Л.В. Чермашенцева Н.А. Влияние различных условий культивирования на накопление вакцинного вируса классической чумы свиней в культуре клеток. Вопросы ветеринар. вирусол. микробиол. и эпизоотол. Материалы научн. конф. ВНИИВВиМ, г. Покров, 1992, ч.1, с.121-122.

6. Герасимов В.Н. Совершенствование промышленной технологии культивирования клеток и вируса для производства противоящурных вакцин. К новой стратегии борьбы с ящуром. Международная конференция. Владимир, 1991, 96-97.

7. Герасимов В.Н. Костюченко В.Г. Литенкова И.Ю. Карачевцева В.И. Федорова Е. Е. Герасимова Н.И. Бурдов А.Н. Соколова В.В. Худяков Г.А. Подбор и селекция чувствительных к вирусам культур клеток для изготовления биологических препаратов. К новой стратегии борьбы с ящуром. Международная конференция. Владимир, 1991, 118-119.

8. Голубев Д.Б. Соминина А.А. Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. М. 1976, 314 с.

9. Дьяконов Л.П. Глухов В.Д. Поздняков А.А. Денисенко Г.Ф. Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие книга I. Ставрополь, 1986, 96 с, ч. II, 1988, 96 с.

10. Зуев В.В. Смыслова Н.Ю. Кушнир С.Д. Влияние адаптации к новым средам на кариологическую изменчивость клеток СПЭВ. Вопросы ветеринар. вирусол. микробиологии и эпизоотологии. Тезисы докл. научн.конф. Покров, 1985, 102-104.

11. Иванющенкова И.В. Худяков Г.А. Сюсюкина А.А. Федорова Е.Е. Манин Б. Л. Коропова Н.В. Получение и первичная паспортизация клонированных клеток ВНК 21/13 с высокой чувствительностью к вирусу ящура. Актуальные проблемы ветеринар. вирусол. Тезисы докл.научн.конф. ВНИЯИ, Владимир, 1986, 12-14.

12. Иванющенкова И.В. Худяков Г.А. Федорова Е.Е. Адаптация перевиваемых клеток к новым условиям культивирования. Актуальные проблемы ветеринар. вирусол. Тезисы докл. научн.конф. ВНИЯИ, г. Владимир, 1986, 14-16.

13. Культура животных клеток. Методы. Перевод с анг. под ред. Р.Фрешни, М. Мир, 1989, 333 с.

14. Мамаева С. Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. Л. Наука, 1987, с.78.

15. Методы культивирования клеток. Сб. научных трудов. Отв. редактор Г. П. Пинаев. Л. Наука, 1988, 313 с.

16. Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. М. 1979, 156 с. (прототип).

17. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных. М. Колос, 1976, 304 с.

18. Сокова В.В. Рожнова О.В. Николаев А.К. Алеева Л.А. Прохоров В.В. Бондаренко А. Ф. Худяков Г.А. Герасимов В.Н. Получение и использование клонов клеток ВНК-21 для промышленного выращивания вируса ящура. К новой стратегии борьбы с ящуром. Международная конференция. Владимир, 1991, 107-108.

19. Сюрин В.Н. Белоусова Р.В. Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. Справочник. М. Агропроиздат, 1991, 528 с.

20. Чермашенцев В.И. Зуев В.В. Поиск новых культур клеток высоко чувствительных к вирусу классической чумы свиней. Вопросы ветеринар. вирусол. микробиологии, эпизоотологии. Материалы научн.конф. ВНИИВВиМ г.Покров, 1992, ч.1, с.121.

21. Чермашенцева Н.А. Курносов А.Н. Изучение способности клеток клонов ППК-Д 114 и ППК-Д 191 к безопорному способу выращивания. Вопросы ветеринар. вирусол. микробиол. и эпизоотол. Материалы научн. конф. ВНИИИВВиМ г. Покров, 1992, ч.II, с.286.

22. Castro M. R. Рysany R.S. Variation of cell clones derived from the IB-RS-2 suhue cell line to the foot-and mouth disease virus. Arg. Inst. Biol. 1967, 34, 4, 295-299.

23. Felling R.C. Рassingham R.I. Cell and virus culture systems. Рat. GB N 1436323; C 6 F, А 5 В; C 12 К 5/00; 19.05.76.

24. Рrunet Р. Рrocede de рreрaration d'nn vaccin antiaphteux destine a l'espece porcine. Pat. FR N 2088038; А 61 К 27/00; 07.01.72.

25. Crawford I.G. Procede de culture etd'inactivation de virus du cholera du porc. Pat. FR N 1526357, С 12 К, 16.04.68.

26. Mcpherson J. Stoker M. Polyoma transformation of hamster cell clones an investigation of genetic faktors affecting cell competence Virology, 1961, 16, 147-151.

27. Rahneberg H.U. Verfahren zur Massenzuchtung von MKS-viren. Pat. DS N 2206779; 30h, 6; С 12 К 7/00; 16.08.73.

28. Charmam W.G. Ramshow I.А. Growth of the IB-RS-2 pig kigney cell line in suspension culture and its susceptibility to foot-and mouth disease virus. Appl. Microbial. 1971, 22, 1, 1-5.

29. Дегтяренко Н. Л. Савельева Л.Г. и др. Определение видовой принадлежности постоянной линии клеток ПСГК-30. Матер.межд.конф. "К новой стратегии борьбы с ящуром". Тез. докл. Владимир, 1991, 121-122.

30. Балышева В.И. Жестерев В.И. и др. Перспективы использования культуры клеток ПСГК в вирусологической практике. Мат. научн. конф ВНИИВВиМ, "Вопросы вет. вирусолог. микробиолог и эпизоотолог." Покров, 1992, ч.2, 290-291.

31. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа АЗия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ МСХ СССР 24.01.91 г. ТТТ1

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток почки Oryctolagus cuniculus L ВСКК (СХЖ) РАСХН 46 для культивирования вирусов животных.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3