Способ получения комплекса липидов и комплекса аминокислот и пептидов

 

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, в частности к производству биологически активных веществ (БАВ) из сырья животного происхождения, а именно из плаценты сельскохозяйственных животных и человека. Способ заключается в том, что плаценту измельчают, экстракцию проводят (10-18)-кратным объемом хлороформа и этанола в соотношении 2 : 1, вводят (0,1-0,2)-кратный объем хлорида натрия до разделения на две фракции: хлороформную, из которой после упаривания выделяют комплекс БАВ липидной природы, и водно-спиртовую, из которой после упаривания и сушки, получают концентрат аминокислот и пептидов. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству биологически активных веществ (БАВ) из сырья животного происхождения, а именно из плаценты сельскохозяйтсвенных животных и человека.

Плацента содержит очень важные ферменты, активирующие синтез белков, интенсифицирующие углеводный и липидный обмен, окислительно-восстановительные процессы. Планцента продуцирует целый ряд гормонов, в том числе экстрогены, оказывает существенное влияние на процессы роста. Плацента содержит жиро- и водорастворимые витамины, гистамин и ацетилхолин, фибрино- и фибриногенолитические ферменты. Является организм, обеспечивающим обмен мать и плод.

Известны способы получения различных белковых веществ (белковой природы) из плаценты, например: способ получения кислоторастворимого коллагена (1. Авторское свидетельство СССР N 1417454, C 07 K 3/02, 1998 г.). антикоагулянта (2. Патент США N 4873222, A 61 K 37/02, публ. 1991 г.), белков PP₄, PP₁₁, PP₂₀, PP₂₁), 3. Патент США N 4507229, A 61 K 35/50, публ. 1985 г. прототип: 4. Патент США N 4325866 (приоритет ФРГ, заявка N 2946438, 1979 г. A 61 K 39/395, публ. 1982 г. 5. Патент США N 4594328, A 61 K C 07 K 15/14, публ. 1985 г. 6. Заявка ЕПВ N 0141326, C 07 K 15/00, публ. 1984 г.), которые используются преимущественно как диагностикумы.

Преимущественное сходство этих способов заключается в осуществлении следующих операций: измельчение плаценты и выделение белковых препаратов путем экстракции, например раствором хлорида натрия и различными детергентами.

Общим недостатком известных аналогов является сложное, трудоемкое выделение из сырья, богатого на БАВ, только одного белкового препарата.

Белок PP₄ имеет электрофоретическую подвижность в пределах между α₁ и α₂-глобулинами, изоэлектрическая точка 4,85 ± 0,15, коэффициент седиментации 3,3 ± 0,25; молекулярная масса в ПАГ с DS-Na - 35,000 ± 5,000, коэффициент экстинкции E_1см 1% (280 нм) 5,9 ± 0,6, содержание углеводов 2,4 ± 0,94 (г/100 г): манноза 0,3 ± 0,2%) галактоза 0,4 ± 0,2% ксилоза 0,1 ± 0,4% глюкоза 0,2 ± 0,1% глюкозамин 1,0 ± 0,2% и нейраминовая кислота 0,4 ± 0,2% Получаемый белок со специфическим аминокислотным составом может быть использован для приготовления антисыворотки.

В основу изобретения поставлена задача получения комплексов БАВ из плаценты путем совершенствования схемы способа и подбора условий и режимов его отдельных операций.

Технический результат достигается за счет осуществления способа получения БАВ, в котором после измельчения плаценты экстракцию проводят (10-18)-кратным объемом хлороформа и этанола в соотношении 2:1, вводят (0,1-0,2)-кратным объемом хлорида натрия до разделения на две фракции: хлороформную, из которой выделяют после упаривания комплекс БАВ липидной природы, и водно-спиртовую, из которой после упаривания и сушки, получают концентрат аминокислот и пептидов.

Получаемые БАВ обладают широким диапазоном действия. Например: липидный комплекс, в составе которого (таблица 1) входят эфиры холестерина, этерифицированные и неэтерифицированные (свободные) жирные кислоты, C₂₇ (холестерин и др.), С₃₀ (ланомтерин) стерины. фосфолипиды с преимущественным содержанием фосфатидилхолина (лецитина), обладает регенериpующими и эмульгирующими свойствами, улучшает транспорт жиров в организме и может найти широкое применение в косметической и фармакологической промышленности.

Концентрат аминокислот (50%) в свободной виде и пептидов (50%) является уникальным, так как в известной информации подобного соотношения (1:1) пептидов и аминокислот не обнаружено.

Кроме того, этот концентрат содержит в свободном виде глютаминовую кислоту, тогда как в состав пептидов входят цистеин и метионин. Такой состав белкового концентрата обеспечивает регулирование азотистого обмена и окислительно-восстановительных реакций.

Сравнение нового способа и способа-прототипа (4. Патент США N 4325866) приоритет ФРГ, заявка N 2946433, 1979 г.) A 61 K 39/395, публ. 1982 г.) показывает, что сходство их заключается в использовании одного источника сырья плаценты, и использования при экстракции и получения фракций, содержащий БАВ, раствора хлорида натрия и реагентов.

Cведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения, представлены в примерах 1-3.

Пример 1. 1 кг плаценты сельскохозяйственных животных измельчают на мясорубке до получения частиц размером не более 1 мм и экстрагируют хлороформно-этанольной смесью (2: 1) в объемном соотношении 1:10 (cырье: смесь растворителей) при комнатной температуре и перемешивания в течение 1,5 час. Затем массу фильтруют через бязевый мешок на нутч-фильтре и промывают небольшими порциями той же смесью растворителей (0,2 объема в 3 раза по отношению к полученному объему).

К фильтрату прибавляют 0,2 объема 0,1% раствора хлорида натрия, перемешивают и отстаивают до полного просветления двух слоев жидкостей. Нижний хлороформенный слой сливают в выпарной аппарат через бязевый мешок, содержащий безводный Na₂SO₄ (1:10) и хлороформ удаляют в вакууме полностью. Полученный продукт коричневого цвета представляет собой комплекс липидов, легкоплавкий (t плавления 50^o C.

Выход 10,0% от сухого веса сырья (таблица 1).

Водно-спиртовой слой помещают в выпарной аппарат и удаляют основную часть спирта в вакууме. Полученный раствор сушат, остаток порошок белковый комплекс кремового цвета, представляет собой концентрат аминокислот и пептидов (таблица 2). Кроме того, этот продукт содержит небольшое количество углеводов, фосфолипидов. Выход 9,0% от сухого веса сырья.

Пример 2. Способ осуществляют согласно схемы, описанной в примере 1, однако экстракцию проводят при объемном соотношении сырья к хлороформно-этанольной смеси 1:14, и в экстракт после фильтрации вводят 0,1 объема 0,15% раствора хлорида натрия.

Выход липидного комплекса составляет 11,3% от сухого веса сырья, выход концентрата аминокислот и пептидов 9,5% от сухого веса.

Пример 3. Способ осуществляют согласно схемы, описанной в примере, однако в качестве сырья используют плаценту человека, экстракцию проводят при объемном соотношении сырья к хлороформно-этанольной смеси 1:18, и в экстракт после фильтрации вводят 0,2 объема 0,12% раствора хлорида натрия.

Выход липидного комплекса составляет 12,0% от сухого веса сырья, выход концентрата аминокислот и пептидов 10,0% Составы получаемых комплексов БАВ представлены в таблицах 1,2.

Выход липидного комплекса от исходного сырья (на сухой вес) составляет 10% Основными фосфолиапидами являются: фосфоэтаноламин, составляющий 29,5% от общих фосфолипидов; фосфатилилхолин 56,9% остальные фосфолипиды являются минорными компонентами.

Фосфатилилхолин (лецитин), максимальное количество которого содержится в получаемом фосфолипидном комплексе, имеет широкое применение как поверхностно активное вещество. Поэтому можно считать, что роль биологически активных компонентов в основном принадлежит фракциям C₂₇-стеринов, жирных кислот (свободных и связанных), а также фосфолипидов.

Исходя из приведенных данных, в препарате содержится пептидов и свободных аминокислот в соотношении 1:1. Глютаминовая кислота большей частью находится в свободном виде. В небольшом количестве содержатся гамма-аминомасляная кислота и орнитин. В состав пептидов входят цистеин и метионин. Такой набор аминокислот как в свободном виде, так и в составе пептидов наделяют препарат свойствами определенной биологической активности: поддержание азотистого баланса в организме, стимулирование роста и окислительно-восстановительных процессов, снижения процессов ожирения печени.

Выбор заявляемых условий объясняется следующими результатами экспериментов: уменьшение объемного соотношения хлороформ-этанольной смеси к сырью, например (9:1), приводит к неполному извлечению БАВ из сырья 8,1% выход концентрата аминокислот и пептидов 8,0% а увеличение объема хлороформ-этанольной смеси практически не отражается на выходе получаемых БАВ, поэтому нерентабельно; уменьшение вводимого в отфильтрованный экстракт объема (0,1-кратный) раствора хлорида натрия не обеспечивает достаточного разделения двух фракций: хлороформной и водно-этанольной, а увеличение объема (0,2-кратный) приводит к излишнему содержанию хлоридов водно-спиртовой фракции; при экстракции указанное конкретное соотношение хлороформа и этанола в смеси необходимо для проведения исчерпывающей экстракции и извлечения целевых продуктов.

Биологическую активность получаемых препаратов изучали при исследовании объема жиров на крысах весом 100 г, у которых вызывали ожирение печени ("жировую печень") кормлением их пищей, богатой жирами и бедной белками. Препараты вводили орально в соотношении 1:1 в количестве 0,1% к основному рациону. Установлено, что введение в организм животных получаемых препаратов как совместно, так и раздельно предохраняет их от накопления жира в печени. Таким образом, можно сделать вывод о липотропном действии этих препаратов.

Сопоставление нового способа и аналогов, а также исследование биологической активности конечных продуктов доказывает преимущество нового решения, которые заключаются в получении по предложенной несложной схеме биологически активных препаратов липидной и белковой природы широкого спектра с высоким выходом в отличие от аналогичных способов, где выделяют монопродукт в небольших количествах при осуществлении ряда узконаправленной специфичности трудоемких операций (имуносорбция).

Формула изобретения

Способ получения комплекса липидов и комплекса аминокислот и пептидов из плаценты, заключающийся в том, что плаценту измельчают, экстрагируют хлороформ-этанольной смесью (2:1) при объемном соотношении к сырью 1: ( 10-18), фильтруют, к фильтрату добавляют 0,1-0,2 объема раствора хлорида натрия, отстаивают до расслоения, нижний хлороформный слой, содержащий липидный комплекс, вакуумируют, верхний водно-спиртовой слой, содержащий комплекс аминокислот и пептидов, вакуумируют и сушат.

РИСУНКИ

Рисунок 1