Способ получения циклоспорина а, штаммы гриба sesquicilliopsis rosariensis g.arnold - продуценты циклоспорина а, штамм гриба tolypocladium inflatum - продуцент циклоспорина а

 

Использование: в микробиологической промышленности, для получения антибиотиков. Сущность изобретения: способ получения циклоспарина А ферментацией колонки грибка от красного до черно-коричневого цвета штамма Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD IMET 43888 или Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD IMET 43887, или Tolypocladium infatum IMET 43899 в аэробных условиях в питательной среде, содержащей соли аммония. В качестве источника углерода она дополнительно содержит цитрат, а в качестве микроэлементов - катионы цинка, железа и/или кальция. Суспензия культуры смешивается со вспомогательным фильтрующим средством - перекристаллизованным гипсом, прекозитом или кальцитовой мукой, фильтруется, высушивается, замачивается метанолом или водным раствором аммиака, экстрагируется простым эфиром карбоновой кислоты или сверхкритическим газом, преимущественно двуокисью углерода. Экстракт обезжиривается, и выделяется целевой продукт хроматографией на силикагеле и/или гидроокиси алюминия или HPLC-хроматографией. 2 с. и 8 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение касается способа получения циклоспорина А, а именно относится к микробиологическому способу его получения с использованием штаммов-продуцентов.

Циклоспорин А относится к группе циклических ундекапептидов с противовоспалительными, иммуноподавляющими, антигрибковыми и антипаразитическими свойствами. Особенный интерес представляют иммуномодуляционные свойства, которые используются в трансплантационной хирургии и при лечении аутоиммунных заболеваний.

Известны многочисленные виды грибков, обладающих способностью образования циклоспорина. Наибольшая продуктивность действующего вещества может быть достигнута со штаммом грибка Beanveria nivea. Поэтому в промышленном получении циклоспорина А этот штамм приобретает особенное значение (1). Однако выход циклоспорина недостаточно велик.

Известен способ получения циклоспорина путем ферментации в полусинтетической среде с выходом 530 мг циклоспорина А на литр после 16 дней культивирования, причем в качестве источника углерода используют мальтозу (2). Этот способ также характеризуется невысоким выходом за счет потерь действующего вещества, связанных с выделением и очисткой различных циклоспоринов, в частности циклоспорина А. Эти способы выделения циклоспорина А из суспензии культур различных штаммов удовлетворяют во всех случаях ожидаемой чувствительности пептидных связей в молекуле циклоспорина А и при исключении повышенных температур осуществляются посредством экстракции "жидкость-жидкость" культурной суспензии или экстракции отделенного влажного мицелия (3). Экстракционные осадки в большинстве случаев распределяются между 30%-ным метанолом и петролейным эфиром, и обезжиренный таким образом материал многократно хроматографируют на силикагеле, оксиде алюминия и/или сефадексе 1 Н 20, при этом используют значительные количества адсорбента, которые до 1000 раз могут превышать количество субстрата. Высокие затраты на очистку, а также необходимость немедленной обработки маточного культурного бульона при обработке влажной грибницы представляют существенные недостатки известного способа. Недостатком известных в настоящее время способов являются также высокие затраты на растворители, в особенности на такие, которые обладают низкой совместимостью с окружающей средой.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ получения циклоспорина А путем ферментации штамм-продуцирующего штамма в аэробных условиях в питательной среде с источниками углерода, азота, минеральных солей и микроэлементов, последующей фильтрации культуральной жидкости, экстракции фильтрата простым эфиром карбоновой кислоты, обезжиривания петролейным эфиром и содержащим воду метанолом, выделения циклоспорина колоночной хроматографией на силикагеле или гидроокиси алюминия (4). Однако указанный способ обладает недостаточно высокой продуктивностью.

Целью настоящего изобретения являются расширение ассортимента высокопродуктивных производителей циклоспорина и создание такого экономически эффективного микробиологического способа, который основывается на использовании этих новых микроорганизмов и обеспечивает получение циклоспорина А в синтетической среде без использования комплексных азотных субстратов, а также создание технологически предпочтительного, совместимого с окружающей средой и экономически выгодного процесса выделения и очистки циклоспорина А с хорошим выходом продукта. При этом расход вспомогательных веществ должен быть минимальным и ограничиваться веществами, совместимыми с окружающей средой.

Поставленная цель достигается новыми штаммами грибов Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD F60S IMET 43887, Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD IMET 43888, Tolypocladium inflatum IMET 43899 продуцентами циклоспорина А, а также способом получения циклоспорина А, заключающимся в ферментации продуцента в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, с последующей экстракцией фильтрата, обезжириванием и выделением целевого продукта колоночной хроматографией, причем в качестве продуцента используют штамм гриба Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD IMET 43888 или Sesquicilliopsis rosarensis F 605 IMET 43887, или Tolypocladium inflatum IMET 43899, а в качестве источника азота питательная среда содержит соли аммония, в качестве источника углерода дополнительно содержит цитрат, в качестве микроэлементов дополнительно содержит двухвалентные катионы, суспензию культуры смешивают с фильтрующим средством, смесь фильтруют и сушат.

Предпочтительно для ферментации используют колонии грибка от красного до черно-коричневого цвета.

В качестве двухвалентных катионов вводят ионы Zn, Fe и/или Ca.

В качестве фильтрующего средства используют перекристаллизованный гипс, преимущественно прекозит или кальцитовую муку.

Предпочтительно также перед экстракцией высушенную смесь замачивают метанолом или водным раствором аммиака.

Для экстракции в качестве простого эфира карбоновой кислоты используют этиловый эфир уксусной кислоты или сверхкритический газ, преимущественно СО₂.

Выделение целевого продукта проводят хроматографией на силикагеле или гидроокиси аммония или HPLC-хроматографией.

У оригинального микроорганизма речь идет о представителе имперфектных грибковых гиф, который выделен из пробы почвы, взятой в Сьерра дель Розарио (Куба) и которому таксономически, как новому роду и виду, Г.Арнольд присвоил обозначение Sesquicilliopsis rosariensis G.ARNOLD.

Организм растет на различных питательных средах, которые содержат традиционные питательные вещества для грибков. При разведении на солодовом агаре в естественном "день-ночь" ритме в течение около 10 дней возникают колонии размером до 8 см со слабо сформированным, слегка волокнистым, белым воздушным мицелием, который простирается до краев колонии. Образование кольца слабо наблюдается только на наружной части колонии. Можно установить слабый запах суповой приправы. Воздушный мицелий состоит из разветвленных гиф, которые в массе кажутся белыми. Поднимающиеся до вертикального положения конидиеносцы, как правило, в большей или меньшей степени веретенообразны или разветвлены неравномерно и несут на концах своих ветвей многие, возникшие при переходе через вершины фиалиды, бесцветные, шилообразные и гибкие. Конидии образуются на вершинах фиалид, они продолговаты, одноклеточные, гиалиновые, с ровными и тонкими стенками, приклеены к маленьким головкам. Хламидоспоры не наблюдались.

От всех подобных семейств (родов) с фиалидными конидиогенными клетками (например, образующие микроконидии Fusarien, Gliodadium, Verticillium, Sesquicillium, Sympodiophora) Г. Арнольд отличает штамм Sesquicilliopsis rosariensis вследствие указанных особенностей, прежде всего на основе вида и образа расположения конидиогенных клеток.

Новые микроорганизмы, которые используют в настоящем способе для получения циклоспорина, в соответствии с Будапештским договором зарегистрированы в отделении IMET (Германия, 0-6900 Иена, Бойтенбергштрассе 11) под номером IMET 43888. Точно так же проведена регистрация и высокопродуктивной линии штамма F 605, которой присвоен номер IMET 43887.

При этом изобретение охватывает также все другие разведенные варианты штаммов посредством мутации и/или селекции исходного штамма или вышеуказанных мутантов.

Вариант штамма Wb 6-5 из Tolypocladium inflatum выделяют посредством селекции высокопроизводительных моноспорных линий на химически определенной питательной среде, в особенности в присутствии в среде ионов кальция и цинка. Особенно поразительно выделение этого варианта штамма, если в литературе известно, что образование циклоспорина может осуществляться только в присутствии комплексных питательных веществ, таких как пептоны, или определенных аминокислот в больших количествах, которые обеспечат экономичное производство. Селектант Wb 6-5 штамма Tolypocladium inflatum зарегистрирован в отделе IMET в Иене согласно Будапештскому договору под номером IMET 43899.

Процесс в целом охарактеризован следующим образом.

Участки мицеллярного налета надводных культур штамма Wb 6-5 или же его споры суспендируют в 0,9%-ном растворе NaCl и методом агаровых слоев наносят на питательный агар, который в качестве источника углерода содержит моно- или дисахариды, а также сульфат аммония в качестве источника азота, и в течение от 14 до 21 дней культивируют при температуре от 24 до 28^oC, предпочтительно при 24^oC.

Выращивание штамма F 605 осуществляют аналогичным образом, но без сульфата аммония в питательном агаре. Из возникших отдельных колоний выбирают бедные воздушным мицелием экземпляры, окрашенные в красный до черно-коричневого цвета, и после переноса на углерод минерально-солевой агар применяют для получения ареалов мицеллярного налета размерами от 2 до 4 см. Эти ареалы в виде участков агара переносят на первый погруженный пассаж предварительного разведения, который культивируют в колбе Эpленмейера емкостью 100 мл или 500 мл, у которой 20% объема составляет среда для разведения.

Питательный раствор содержит глюкозу, мальтозу или сахарозу в качестве источника углерода, кроме того, органические или неорганические субстраты азота, а также минеральные соли и после инфицирования в течение от 48 до 96 часов культивируется при температуре от 24 до 28^oC при встряхивании на ротационном вибраторе с числом оборотов от 100 до 240 об/мин. После вызревания первой культуры в культуре на жидкой среде (соответствует первой предварительной культуре) осуществляют в данном случае инфицирование второй культуры (соответствует второй предварительной культуре) с инокулятом от 5 до 10% объема питательного раствора вторичной культуры. Эта ступень состоит либо из 500 мл колбы Эрленмейера, которая содержит 100 мл вышеуказанной среды, или из малогабаритного ферментатора с устройством для перемешивания и продувки и нетто-объемом от 5 до 25 л с обычным техническим оснащением для поддержания температуры и проветривания. После 48- до 96-часового культивирования среда с главной культурой, которая в качестве единственного источника азота содержит соли аммония, инфицируется в количестве от 5 до 10% объема предварительной культурой и культивируется в течение от 5 до 20 дней при перемешивании и продувке или же с помощью ротационного встряхивания. При этих условиях достигается производительность ферментационных композиций до 3000 мг циклоспорина на литр, который аналитически обрабатывается известным образом посредством HPLC. Культурные суспензии ко времени созревания и сбора имеют красную до черно-коричневой окраску.

Циклоспорин А выделяют из культурных суспензий следующим образом: культуральные суспензии смешивают с вспомогательным фильтрующим материалом и затем фильтруют, влажную биомассу сушат; полученную таким образом смесь сырой биомассы и вспомогательного фильтрующего материала экстрагируют простым эфиром карбоновой кислоты или альтернативно сверхкритическим газом, предпочтительно CO₂; экстракт обезжиривают посредством распределения между содержащим воду метанолом и петролейным эфиром, и предварительно очищенный таким образом экстракт хроматографируют на силикагеле и/или оксиде алюминия.

Преимущества данного способа выделения заключаются, прежде всего, в следующем: отделение без потерь биомассы благодаря незначительному размеру частиц, образование способного к высыханию материала, который является стабильным, стойким при хранении и способным к экстрагированию; экстракционный способ с незначительной долей балластных веществ и пониженными затратами на очистку; приспособление дальнейших этапов очистки к специальным свойствам применяемых продуцентов; уменьшение использования экстракционных средств.

Однако биомасса применяемого продуцента выпадает не как обычно и предпочтительно в форме гиф, а в корпускулярной форме с размерами частиц 10-30 мкм и образует плохо фильтрующийся и тяжело отделяющийся осадок на фильтре. В соответствии с изобретением эту сложность преодолевают благодаря тому, что культурную суспензию непосредственно или же после предварительного концентрирования с помощью центрифугирования смешивают с вспомогательным фильтрующим средством, обладающим хорошим разделительным эффектом (например, перекристаллизованный гипс-прекозит, кальцитовая мука), и непосредственно вслед за этим фильтруют. Весовое отношение вспомогательное фильтрующее средство/сухая биомасса (1.4):1 обеспечивает хорошую фильтрующую способность, быстрое высушивание и эффективное отделение осадка после экстракции.

Полученная таким образом сырая биомасса, которая еще содержит от 35 до 60 вес. культурального фильтрата, несмотря на ее пептидную натуру дает поразительным образом возможность практически без потери вещества посредством конвекционной сушки (например, в вакуумном сушильном шкафу, сушильном шкафу с циркуляцией воздуха, в сушилке с кипящим слоем или ленточной сушилке) при температуре до 80^oC, предпочтительно при 40-60^oC, перевести ее в препарат сухого мицелия, у которого целесообразно оставить соотношение влажной массы и твердого вещества (0,02.0,15):1. Альтернатива заключается в лиофилизации, которая точно также обеспечивает стабильный и экстрагируемый сухой продукт.

Для последующей двойной и тройной экстракции рекомендуется предпочтительно этиловый эфир уксусной кислоты, который увлекает с собой значительно меньше балластных веществ, чем, например, этанол или ацетон. Это особенно важно, если количество процессов экстракции ограничивается двумя.

Остаток, остающийся после выпаривания, частично обезжиривают известным способом посредством распределения между метанолом, содержащим воду, или этанолом и петролейным эфиром, и содержит уже до 40 вес. вещества. Целесообразно осуществить увлажнение мицелия перед экстракцией аммиачной водой. При обработке тяжело экстрагируемых типов мицелия рекомендуют мицелий с 20 до 40 вес. предпочтительно с 25 вес. оставить для предварительного набухания свыше 8 до 72 часов и первую экстракцию провести с ультратурраксом (Ultra-Turrax).

Альтернативно к "твердо-жидкой" экстракции с органическими растворителями действующее вещество может экстрагироваться также из сухого мицелия сверхкритическими газами, предпочтительно CO₂. Давление и температура при этом являются специфическими для газа. Для CO₂ оказывается наиболее целесообразной область приблизительно от 100 до 300 бар и температуры от 35 до 60^oC. Целесообразно поддерживать экстракцию посредством добавления средства для вытяжки, например от 0,5 до 1,5 вес. этанола по отношению к СО₂. Загрязнения, прежде всего жиры, отделяют с помощью многоступенчатой экстракции или же фракционированного отделения.

Первую очистку на хроматографической колонке осуществляют по выбору на нейтральном оксиде алюминия (50-100-кратное количество) или силикагеле (30-60-кратное количество) с этиловым эфиром уксусной кислоты в качестве подвижной фазы, вторую очистку проводят всегда на силикагеле (преимущественно 40-кратное количество) в этилацетате.

Как логическое продолжение сверхкритической экстракции в порядке альтернативы жидкостной хроматографии при нормальном давлении возможно проведение последующей селекции действующего вещества с помощью HPLC-хроматографии.

Пример 1. Кусочки мицелиального налета культуры с поверхности штамма Tolypocladium inflatum Wb 6-5 переносят прежде всего на глюкозоминеральносолевой агар, который имеет следующий состав (г/л): глюкоза 20; (NH₄)₂SO₄ 5; KH₂PO₄ 2; MgSO₄ x 7H₂O 0,5; CaCO₃ 3,4; агар 20; значение pН от 5,3 до 5,7; стерилизация в течение 30 минут при 120^oC. После инкубации чашек Петри при 24^oC в течение 14-21 дня из возникающих ареалов выбирают окрашенные в красный и черно-коричневый цвета. Засевание (прививка) первой погруженной культуры осуществляют посредством переноса кусочка налета размером около 1 см² на 100 мл культуральной среды следующего состава (г/л): глюкоза 50; казеинпептон 10; KH₂PO₄ 1; KCl 2,5; дистиллированная вода до 1 л; значение pН от 5,3 до 5,6; стерилизация в течение 30 минут при 120^oC. Колбы с культурой емкостью 500 мл культивируют в течение 72 часов при температуре от 24 до 25^oC на ротационном "встряхивателе" с числом оборотов от 180 до 220 об/мин, в качестве критерия зрелости (созревания) культура показывает коричнево-черное окрашивание и в количестве 5% служит как затравочный материал главной культуральной среды, которая помещается в 500 мл колбы Эрленмейера, в каждую по 100 мл, и имеет следующий состав (г/л): глюкоза 80; (NH₄)2SO₄ 5; (NH₄)₂HPO₄ 2; MgSO₄ x 7H₂O 0,5; ZnSO₄ x 7H₂O 0,008; CaCO₃ 5,1; дистиллированная вода до 1 л; значение pН от 5,3 до 5,9; стерилизация в течение 30 минут при 120^oC. Культивирование осуществляется в течение 11 дней при температуре от 24 до 25^oC на ротационном вибраторе со скоростью 180 об/мин.

После окончания ферментации бульон культуры смешивается с метанолом в соотношении 5: 1 (v/v), и для определения ценности применяется экстракция. Она осуществляется известным образом посредством наполнения HPLC-колонок. Производительность такого типа ферментационной установки составляет 1100 мг циклоспорина А на литр.

Пример 2. Из надводной культуры штамма Sesquicilliopsis rosariensis F605 на агаре солодового экстракта (20 г солодового экстракта/л) после по крайней мере 14-дневного культивирования (инкубации) при 24^oC получается суспензия спор, которая служит для засевания первичной культуры (предкультуры). Среда первичной культуры имеет следующий состав (г/л): мальтоза или глюкоза 75; казеинпептон 25; KH₂PO₄ 1; KCl 2,5; деионизированная вода до 1 л; значение pН 5,5; стерилизация в течение 30 минут при 120^oC. 100 мл среды первичной культуры засеиваются 2 х 10⁷ спор и в 500 мл колбе Эрленмейера инкубируются (термостатируются) при 24^oC в течение 72 часов на роторном вибраторе с частотой 190 об/мин. Непосредственно после этого осуществляется перенос культуры в среду главной культуры в отношении 1:10, которая имеет следующий состав (г/л): глюкоза 100; гидроцитрат диаммония 15; KH₂PO₄ 1; MgSO₄ x 7H₂O 2,5; FeSO₄ x 7H₂O 0,1; ZnSO₄ x 7H₂O 0,003; деионизированная вода до 1 л; значение pН 5,5; стерилизация в течение 60 минут при 110^oC. Все условия культуры выбираются в соответствии с первичной культурой. Установленное на 11-й день культивирования содержание циклоспорина А составляет максимально 1150 мг/л культуральной суспензии. Определение действующего вещества осуществляется, как описано в примере 1.

Пример 3. Выращивание и культивирование штамма Sesquicillopsis A84/195/-3/ проводят по аналогии с примером 2. При указанных условиях на 11-й день культивирования в суспензии культуры определяют содержание циклоспорина А, составляющее 150 мг/л. Анализ содержания активного вещества в суспензии культуры проводят аналогично примеру 1.

Пример 4. Из культуры Эмере Sesquicillopsis rosariensis варианта штамма F 605, культура которого"индуцировалась на глюкозоминеральном агаре следующего состава (г/л): глюкоза 20; кислый цитрат диаммония 5, (NH₄)₃PO₄ 1; MgSO₄ · 7H₂O 2,5; FeSO₄ · 7H₂O 0,1 · ZnSO₄ · 7H₂O 0,003; CaCO₃ 0,5, через по меньшей мере 21 день культивирования при 24^oC получают суспензию спор, которую используют для прививки форкультуры. Дальнейшее культивирование проводят по аналогии с примером 2.

Пример 5. Разведение и культивирование штамма F605 осуществляют в первичной культуре, как описано в примере 2, однако в противоположность тому штамм-продуцент после первичной культуры переводят в 5 л лабораторный ферментер, который содержит уже представленную в примере 2 среду главной культуры и вращается (перемешивается) со скоростью от 200 до 500 мин^-1, а также продувается (вентилируется) с объемным током от 0,25 до 1,0 л х мин^-1 x л^-1. Продолжающаяся вплоть до 14 дней ферментация дает выход циклоспорина А максимально 3150 мг/л.

Пример 6. После выполненного согласно примеру 2 разведения затравочного материала для штамма F605 ферментер-мешалка, содержащий жидкую питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза 50; соевый шрот 2,5; (NH₄)₂SO₄ 4,1; KH₂PO₄ 5,0; значение pН 5,5; стерилизация в течение 60 минут при 110^oC, засеивают средой с 2 х 10⁸ спор/л среды. Температура, перемешивание и вентиляция соответствуют характеристикам, приведенным в примере 3 для главной культуры. Полученная таким образом через 4 дня культура служит в качестве 10%-ного инокулята для производственной ступени в 450 л ферментере из легированной стали, который содержит указанную в примере 2 жидкую питательную среду главной культуры, и культивируется при поддержании условий, названных выше для первичной культуры.

В результате ферментации, проведенной по указанному типу, после 14 дней культивирования образуется в среднем 2 г циклоспорина А на литр культуральной суспензии.

Пример 7. 6 л культуральной суспензии штамма F605 вида Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD (IMET 43887) пропускают через ручную фильтровальную пластину, на которую нанесен слой прекозита (PRECOSIT), и полученный таким образом сырой продукт высушивают в камерной сушилке с циркуляцией воздуха в течение 6 часов при температуре 50^oC.

Получают 246 г смеси высушенный мицелий-прекозит, которая содержит приблизительно 50 вес. прекозита.

Смесь предварительно замачивают с 60 мл 10%-ного водного раствора аммиака в течение 15 минут и трижды перемешивают с (в совокупности) 4,2 л этилового эфира уксусной кислоты, в трех порциях, каждое перемешивание 30 минут. Отфильтрованный от твердого вещества экстракт после отгонки растворителя дает 21 г осадка, количество которого сокращается до 14 г после того, как его вносят в 100 мл этанола, содержащего 5% воды, трижды встряхивают с 300 мл (каждый раз) петролейного эфира, и выпаривают метанол.

Очистка методом колоночной хроматографии на 1000 г оксида алюминия нейтрального, степень активности I, в этиловом эфире уксусной кислоты дает после приблизительно 500 мл первой (головной) фракции 1450 мл главной фракции, после повторной хроматографии остатка на силикагеле 60 Мерк (0,063-0,2 мм) в том же растворителе и перемешивания с 7-кратным количеством н-гексана получают 5,2 г почти белого продукта с 99 вес. циклоспорина А по HPLC.

Пример 8. 327,5 л культуральной суспензии названного в примере 5 мутанта с содержанием биосухого вещества 21,1% смешивают с 13,1 кг прекозита и фильтруют в 2 порциях на напорном фильтре с поверхностью фильтра 0,5 м² (центробежный дисковый фильтр, модель EIT). Поверхность фильтра предварительно покрывают прекозитом (намывание) в количестве 250 г на порцию. Сырой осадок на фильтре (вес 28,5 кг) высушивают в сушилке с вихревым (кипящим) слоем при температуре приточного воздуха от 35 до 55^oC, так что образуется смесь сухой мицелий-прекозит весом 15,4 кг. Полученную сухую массу прежде всего перемешивают в нутче-мешалке со 100 л, а затем с 70 л этилового эфира уксусной кислоты, каждое перемешивание по 30 минут. Осветленный и первично очищенный экстракт концентрируют вначале в вакуумном циркуляционном выпарном аппарате, затем в вакуумном ротационном испарителе до маслянистого осадка, который вносят в 8 л метанола. После добавления 0,4 л воды смесь трижды взбалтывают с 16 л (каждый раз) петролейного эфира. Отделенная метанольная фаза после упаривания в вакуумном ротационном испарителе дает 600 г осадка.

Первая очистка методом колоночной хроматографии на 24 кг силикагеля 60 Мерк в этиловом эфире уксусной кислоты дает 275 г 79%-ного (вес.) сырого циклоспорина. Повторную хроматографию проводят на 14 кг силикагеля 60 Мерк в метиленхлориде с долей метанола 2,5 вес.

Пример 9. Вакуумный ячеистый фильтр с поверхностью фильтра 0,3 м² покрывают 10 кг прекозита в качестве первичного намывания. Затем фильтруют 290 л культурной суспензии описанного в примере 5 мутанта. К культурной суспензии перед этим добавляют еще 60 г/л прекозита. Получают 62,5 кг сырого остатка на фильтре, содержащего 55,4 вес. воды.

50 кг этой сырой массы высушивают в вихревом (кипящем) слое и дают 22,5 кг смеси сухой мицелий-прекозит с содержанием действующего вещества 6,3 г/кг.

Пример 10. 20 кг полученной согласно примеру 7 смеси сухой мицелий-прекозит замачивают с 5 л метанола и выдерживают в течение 24 часов при комнатной температуре в закрытом сосуде.

После этого материал вносят в 50 л этилацетата и экстрагируют (взбалтывают) 40 минут с ультратурраксом. После отделения остаток с фильтра в течение 10 минут перемешивают со следующими 50 л этилацетата и отсасывают. Остаток объединенных экстрактов обрабатывают аналогично тому, как это описано в примере 6, и получают 61,5 г чистого циклоспорина А.

Пример 11. 0,52 кг полученной согласно примеру 7 смеси сухой мицелий-прекозит (ТМР) экстрагируют с 5,2-6,5 кг/ч сверхкритического СО₂ при давлении 300 бар и температуре 40^oC при добавлении от 50 до 80 мл этанола в течение 6 часов. При этом экстрагируют около 60% содержащегося в смеси (ТМР) циклоспорина А. Полученный таким образом экстракт подвергают дальнейшей обработке до чистого вещества аналогично тому, как это описано в примере 6.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. J. Antibiotics, v 42, 1989, p. 591-597.

2. Ann. N.J. Acad. Sci. 506, 1987, p. 657-662.

3. Патент ФРГ N 2455859.

4. EP N 0379708, C 12 N 1/14, C 12 P 21/04, 1989 прототип.

Формула изобретения

1. Способ получения циклоспорина А, включающий ферментацию продуцента в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, экстракцию фильтрата, обезжиривание и выделение целевого продукта колоночной хроматографией, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм гриба Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD IMET 43888, или Sesquicilliopsis rosariensis F 605 IMET 43887, или Tolypocladium inflatum IMET 43899, в качестве источника азота питательная среда содержит соли аммония, в качестве источника углерода дополнительно содержит цитрат, в качестве микроэлементов дополнительно содержит двухвалентные катионы, суспензию культуры смешивают с фильтрующим средством, смесь фильтруют, высушивают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для ферментации используют колонии грибка от красного до черно-коричневого цвета.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве двухвалентных катионов вводят ионы цинка, железа и/или кальция.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фильтрующего средства используют перекристаллизованный гипс, преимущественно Прекозит или кальцитовую муку.

5. Способ по пп.1 и 4, отличающийся тем, что перед экстракцией высушенную смесь замачивают метанолом или водным раствором аммиака.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для экстракции в качестве простого эфира карбоновой кислоты используют этиловый эфир уксусной кислоты или сверхкритический газ, преимущественно двуокись углерода.

7. Способ по пп.1 6, отличающийся тем, что выделение целевого продукта проводят хроматографией на силикагеле или гидроокиси алюминия или HPLC-хроматографией.

8. Штамм гриба Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD F 605 IMET 43887 - продуцент циклоспорина А.

9. Штамм гриба Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD IMET 43888 - продуцент циклоспорина А.

10. Штамм гриба Tolypocladium inflatum IMET 43899 продуцент циклоспорина А.