Способ реактивации рекомбинантного белка

 

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: проводят растворение тел включения под действием сильного денатурирующего средства в присутствии восстанавливающего агента и последующую ренатурацию белка в условиях, обеспечивающих одновременно и его реактивацию, причем ренатурацию белка проводят в присутствии оксиметиламинометана (триса) или его соли в концентрации 400 мМ при значении рН, необходимом для проявления биологической активности белка, и при концентрации белка, который либо постоянно присутствует в инкубационной смеси, либо поступает в течение времени, от 1 до 4000 мкг/мл. 11 з.п. ф-лы, 8 табл.

Изобретение относится к способу реактивации рекомбинантного белка, а именно к усовершенствованному способу солюбилизации (повышения растворимости) и ренатурирования рекомбинантного белка, в процессе которого протеин обрабатывают буферным раствором оксиметиламинометан-основания (основание Триса) и/или его соли с концентрацией Трис-основания или соли Триса не менее 400 ммоль/л.

При получении белков в прокарионтных клетках часто образуются тяжело растворимые белковые агрегаты.

Чтобы перевести эти белки в активное состояние необходимы солюбилизация (повышение растворимости) и ренатурирование.

Солюбилизация белков достаточно известна (например, ЕР-А 0 361 475 ЕР-А 0 114 506, ЕР-А 0 093 619 и ЕР А 0253823).

Кроме того, известны как буферный раствор, так и способ ренатурирования денатурированных белков (например, W0 87/02673, ЕР А 0 364 926, ЕР 0 241 022).

Существенным фактором, ограничивающим выход ренатурированного белка (с или без образования дисульфидных мостиков) является своеобразная реакция конкуренции между переводом денатурированного белка в правильную складчатую промежуточную структуру и скоплением большого количества молекул белка. По этой причине концентрация денатурированного белка в буферном растворе является существенным параметром, определяющим объем продукта на выходе в процессе ренатурирования, то есть повышение концентрации денатурированного белка способствует скоплению молекул белка, а относительный выход ренатурированного белка с конформацией нативного белка уменьшается.

Во всех известных в настоящее время способах реактивации белков необходимо, чтобы количество денатурированного белка в исходной смеси не превышало критической концентрации. Часто незначительная растворимость белка в буферном растворе, используемом для реактивации, ведет поэтому к значительному убытку относительно небольшого выхода, увеличению времени и/или увеличению объема буферного раствора.

Задачей предлагаемого изобретения является создание таких условий реактивации (т. е. прежде всего солюбилизации и ренатурирования) и получение такого буферного раствора, которые позволили бы значительно повысить растворимость денатурированного и ренатурированного белка по сравнению с известными буферными растворами.

Эта задача решается согласно изобретению способом реактивации рекомбинантного белка, который отличается тем, что ренатурацию белка проводят в присутствии оксиметиламинометана (основание Триса) или его солей в концентрации не менее 400 ммоль/л при определенном значении рН, в результате чего обрабатываемый белок может принимать свою нативную конформацию.

При использовании буферного раствора, содержащего основание Триса или соль Триса с концентрацией Триса более 400 ммоль/л значительно повышается растворимость рекомбинантных белков при реактивации рекомбинантных белков. Это ведет к существенному увеличению выхода активного белка по сравнению с известными стандартными способами. Хотя известные до сих пор буферные растворы для реактивации часто содержали Трис в концентрации триса от 50 до 100 ммоль/л для сдерживания раствора реакции Но, как ни странно, до сих пор не было известно неожиданное свойство триса улучшать растворимость (а значит, и улучшенный выход ренатурирования) при его концентрации не менее 400 ммоль/л.

Под солью триса в данном изобретении следует понимать трис-соль любой органической или неорганической кислоты. Примерами трис-солей могут служить: трис-ацетат, трис-бензоат, трис-борат, трис-карбонат, трис-цитрат, трис-HCl, трис-малеит, трис-нитрат, трис-оксалат, трис-фосфат, трис-сукцинат, трис-сульфат и т.п.

Способ согласно изобретению подходит для универсального ренатурирования белков, причем причина денатурации (соль, тепло и т.д.) сама по себе критической не является. Хотя способ, предлагаемый в данном изобретении, подходит прежде всего для ренатурирования продуктов, полученных генно-технологическим путем, а также продуктов, полученных в виде отходов материала (Inсlusion Body) в неактивной форме, способ, однако, можно использовать и для других рекомбинантных белков. В частности, предлагаемый способ может использоваться в способах, представленных в W0 87/02673, ЕР-А 0 241 022 и ЕР-А 0 364 926. При этом в W0 87/02673 заявляется способ активации негликозилированного tPA после введения в прокарионты путем распределения клеток, солюбилизации при условии денатурирования и редуцирования и реактивации при условии окисления в присутствии GSH/GSSG. Причем стадия реактивации проводится при величине рН от 9 до 12, концентрации GSH от 0,1 до 20 ммоль/л, концентрации GSH от 0,01 до 3 ммоль/л и с неизменяющейся концентрацией средства денатурирования. В патенте ЕР-А 0 241 022 заявляется способ ренатурирования денатурированных белков в растворе в буфере денатурирования, при котором раствор ренатурируемого белка получают в выбранном буфере с критической концентрацией и после образования складчатого промежутка, далее к ренатурированному белку добавляют необходимое для достижения критической концентрации количество. Изобретение по патенту ЕП-А 0 364 926 относится к способу активации полученных генно-технологическим путем, обработанных в проарионтных элементах, биологически активных белков после распределения клеток путем солюбилизации при условии денатурирования и редуцирования, и последующей реактивации в условиях окисления и ренатурирования. При этом работают при концентрации белка 1-1000 мкг/мл, а между солюбилизацией и реактивацией проводят диализ буферного раствора со значением рН между 1-4, содержащего от 4 до 8 моль/л гидрохлорида гуанидина или 6-10 моль/л мочевины.

Способ согласно изобретению может осуществляться в двух вариантах. Первый вариант: процесс проводят в буфере триса заданной концентрации, так что трис и/или соль триса используется, кроме того, и для установления величины рН. Во втором варианте используют буферный раствор, описанный ранее для соответствующего способа, и дополнительно добавляют трис и/или соль триса. Это означает, что значение рН инкубационного раствора устанавливают с помощью буферного вещества с различным содержанием триса. В обоих случаях целесообразно позаботиться о том, чтобы добавление триса или повышение концентрации триса не вызвало бы изменения величины рН.

Инкубацию осуществляют при таком значении рН, при котором обрабатываемый протеин может существовать в своей нативной конформации. Это значит, что инкубацию в данном способе не проводят при таком значении рН, которое делает образование нативной конформации протеина невозможной. Под нативными конформациями протеина следует понимать такие вторичные, третичные и, в данном случае, четвертичные структуры, при которых протеин может иметь биологическую активность.

Способ согласно изобретению включает инкубацию денатурированного протеина с раствором триса, имеющим концентрацию не менее 400 ммоль/л. Преимущественно концентрация триса составляет от 0,4 до 2 моль/л, в частности, предпочтительно около 1 моль/л. Для некоторых протеинов (например, осколки антител) достигают оптимального выхода реактивирования уже при концентрации триса около 0,5 моль/л.

Выход продукта в процессе ренатурирования зависит, как уже описывалось выше, от концентрации протеина в растворе для ренатурирования. В предлагаемом способе согласно изобретению выбрана концентрация протеина предпочтительно в области до 4000 мкг/мл. В зависимости от вида протеина и способа ренатурирования концентрация протеина может, однако, быть и выше этого предела.

В способе согласно изобретению денатурированный протеин подается либо непрерывно, либо периодически в раствор для ренатурирования. Во многих случаях (например, при ренатурировании tPA и tPA-производных) возможно добавление в инкубационный раствор 0,2-1 моль/л аргинина.

Предпочтительными примерами для протеинов, которые могут подвергаться ренатурированию по предлагаемому в данном изобретении способу, представляют из себя рекомбинированные tPA или tPA-мутеины (в частности, негликозилированный tPA-мутеин с составом доме на К2Р), рекомбинантный стимулирующий колонии гранулоцитов фактор G CSE или антитела, или их фрагменты. Предлагаемый способ согласно изобретению не ограничивается, однако, этими примерами, а позволяет переносить его на любые протеины.

Преимущества предлагаемого способа реактивации согласно изобретению включают прежде всего повышение конечного выхода активного протеина на 30 - 300% по сравнению со способом, при котором работают с буферным раствором, имеющим незначительную концентрацию Триса. Кроме того, концентрация денатурированного протеина в буферном растворе для ренатурирования увеличивается без потерь конечного выхода. Это значит, что процесс ренатурирования осуществляется значительно быстрее и эффективнее.

Преимуществом предлагаемого способа является прежде всего пульсирующее ренатурирование в соответствующем растворе. Здесь выход ренатурированного протеина возрастает, кроме того, концентрация протеина на пульс может увеличиваться, в результате чего время реактивации уменьшается. Таким образом, можно достичь более высокой концентрации протеинов в исходной смеси ренатурирования, не уменьшая при этом конечного выхода. При этом существенно уменьшается объем буферного раствора. Особенно благоприятным оказался пульсирующий способ ренатурирования, причем ренатурирование проводят в буферном растворе, содержащем аргинин, с концентрацией Триса около 1 моль/л, а концентрация ренатурируемого протеина увеличивается примерно на 200 мкг/мл на пульс.

Далее изобретение должно быть пояснено следующими примерами.

Сокращения: GSH восстановленная форма глютатиона, GSSG окисленная форма глютатиона, t-PA:tissue плазминогенный активатор, Cprot концентрация протеина, Arg аргинин Gdn гуанидин Renat ренатурирование, СК креатинкиназа EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТУ,
G-CSF стимулирующий колонии гранулоцитов фактор.

П р и м е р 1
Выход продукта при ренатурировании в зависимости от инкубационного периода до момента подачи второго импульса (+/-1 моль/л Триса).

Исходные материалы:
Inclusions Bodies (IB'S) tPA-мутеина К2Р были получены согласно W0 90/09437 (пример 1), затем, согласно ЕР-А 0 361 475 А1 (пример 1), солюбилизированы и переведены в смешанный дисульфид. В примерах 2-5 получение исходного материала аналогично.

Ренатурирование: 0,6 моль/л арг./HCl, рН 8,5
1 ммоль/л EDTA
0,7 ммоль/л GSH
+/- 1 моль/л триса Сprot 140 мк г/мл на пульс
Подача второго пульса: 1-9 ч (см. табл.1)
Инкубация: 12 ч при комнатной температуре после подачи последнего пульса.

Определение активности ренатурированного tPA-мутеина К2Р и определение единицы измерения (U), описано в Lill (ZGIMAL 42 (1987), 478-486).

Из табл. 1 видно, что в аргинин-буфере без Триса, начиная со времени воздействия более 6 ч и до подачи второго пульса, достигают максимального выхода ренатурированного продукта. К исходной смеси добавляют 1 моль/л Триса, затем появляются следующие изменения: максимальный выход при ренатурировании возрастает на 30 40% уже после 1-3 ч воздействия может быть снова добавлен денатурированный протеин, не уменьшая при этом выхода ренатурированного продукта.

П р и м е р 2
Ренатурирование: зависимость от концентрации Триса и соотношения аргинин/гуанидин.

Исходные материалы:
Inclusions Bodies (IB'S) tPA-мутеина К2Р, полученный аналогично примеру 1.

Ренатурирование: Опыт А: Зависимость Триса.

0,6 моль/л аргинин НСl, рН 8,5
1 ммоль/л ЕDTA
0,7 ммоль/л GSH
Трис: 0,50,100,500,1000 и 2000 ммоль/л
Cprot 80 мкг/мл
Инкубация: 24 ч при комнатной температуре
Опыт В: буферная зависимость
1 ммоль/л ЕDTA, рН 8,5
0,7 ммоль/л GSH
Cprot 80 мкг/мл
Буфер: 1) 0,6 моль/л аргинин/НСl
2) 0,4 моль/л аргинин/НСl
плюс 0,2 моль/л гуанидин (Gdn) HCl
3) 0,2 моль/л аргинин/HCl
плюс 0,5 моль/л гуанидин (Gdn)/HCl
в зависимости от обстоятельств +/- 1 моль/л триса
Инкубация: 24 ч при комнатной температуре (табл.2).

Опыт А: С повышением концентрации Триса в буферном растворе для ренатурирования выход продукта возрастает. Оптимальная концентрация Триса для ренатурирования составляет около 1 моль/л. При концентрации Триса между 100 и 500 ммоль/л выход ренатурированного продукта неожиданно резко увеличивается.

Опыт В: При добавлении 1 моль/л Триса выход продукта во всех случаях резко повышался (фактор 2-3).

П р и м е р 3
Ренатурирование в зависимости от концентрации протеина (+/-1 моль/л триса)
Исходные материалы:
Inclusions Bodies (IB'S) tPA-мутеина К2-Р, полученный аналогично примеру 1.

Ренатурирование: Буфер А:
0,6 моль/л арг/HCl рН 8,5
1 ммоль/л ЕDTA
0,7 ммоль/л GSH
Cprot 112, 223 и 446 мкг/мл
Буфер B:
0,6 моль/л арг/HCl, рН 8,5
1 моль/л Триса
1 ммоль/л EDTA
0,7 ммоль/л GSH
Cprot 112, 223, 446, 893, 2230 и 4460 мкг/мл
Инкубация: 24 ч при комнатной температуре.

Результат этого эксперимента представлен в табл.3.

В аргининовом буферном растворе без Триса доля ренатурирования понижается с увеличением концентрации протеина. При добавлении к буферному раствору 1 моль/л Триса значительного уменьшения выхода продукта натурирования не наблюдается до концентрации протеина 400 мкг/мл. Только при более высоких концентрациях протеина выход продукта уменьшается с ростом концентрации.

П р и м е р 4
Пульснатурирование: +/- 1 моль/л Триса
Исходные материалы:
Inclusions Bodies (IB's) tPA мутеина К2Р, полученный аналогично примеру 1.

Ренатурирование: 0,6 моль/л арг/НСl рН 8,5
1 ммоль/л EDTA
0,7 ммоль/л GSH
Трис: +/- 1 моль/л
Cprot 150 мкг/мл за импульс
Время воздействия: 12 ч
Конечная концентрация: 1500 мкг/мл
Образец со смешанными дисульфидами при t 0^oC.

Результат этого эксперимента представлен в табл. 4.

Реакция при наличии азота.

Результат этого эксперимента (см. табл. 4.).

При пульсе без Триса значительное помутнение осуществляется при концентрации протеина, начиная с 700 мкг/мл. В то время как при добавлении 1 моль/л Триса при концентрации протеина 1,5 мг/мл помутнение полностью отсутствует. При добавлении 1 моль/л Триса конечный выход продукта увеличивается примерно на 30%
П р и м е р 5
Пульснатурирование: приближение к способу непрерывного действия (+/-1 моль/л Триса).

Исходные материалы:
Inclusions Bodies (IB's) tPA-мутеина К2Р, полученного аналогично примеру 1.

Ренатурирование: 0,6 моль/л арг/HCl рН 8,5
0,7 ммоль/л GSH
1 ммоль/л EDTA
+/-1 моль/л триса
Пульс: время воздействия: 30 мин
Cprot увеличение за пульс: (А) 9,3 мкг/мл,
(B) 31 мкг/мл
Длительность подкачки: 2 мин
Конечная концентрация: 3000 мкг/мл
Образец со смешанными дисульфидами при t 0^oC, реакция при наличии N₂.

Результат этого эксперимента представлен в табл. 5.

Приближение к непрерывному способу (повышение частоты подачи натурированных пульсов при соответствующих условиях) дает такую же норму натурирования по сравнению с пульсэкспериментом.

Добавление 1 моль/л Триса к буферному раствору для ренатурирования ведет к значительному увеличению выхода конечного продукта примерно на 20 100%
П р и м е р 6.

Ренатурирование восстановленной формы К2Р в зависимости от концентрации Триса.

Исходные материалы:
Inclusion Bodies (IB's) tPA-мутеина К2Р, полученного согласно примеру 1.

Солюбилизация: 6 моль/л Gdn/HCl, рН 8,3
0,1 моль/л Триса
1 ммоль/л EDTA
0,1 моль/л DTE
Cprot 7,5 мг/мл
2 мин. Ultraturrax
Инкубация: 1 ч при комнатной температуре
Прекращение: рН 3,0 с НСl
Диализ: 6 моль/л Gdn/HCl, рН 3,0
1 ммоль/л ЕDTA
Ренатурирование: 0,7 моль/л арг./HCl, pH 8,5
1 ммоль/л EDTA
3 ммоль/л GSH
0,3 ммоль/л GSSG (окисленная форма глютатиона)
Трис: 0; 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8 и 2,1 моль/л
Cprot 150 мкг/мл
Результат представлен в табл. 6.

При прямом ренатурировании восстановленной формы протеина выход ренатурирования увеличивается при добавлении ≥ 1 моль/л Триса на 30%
П р и м е р 7
Ренатурирование G CSF
Исходные материалы:
Inclusion Bodies (IB's) G CSF, полученный согласно РСТ/ ЕР 91/00192 (пример 3).

Солюбилизация: 6 моль/л Gdn/HCl, рН 8
0,1 моль/л Триса
1 ммоль/л EDTA
0,1 моль/л DTE
Cprot 10 мг/мл
2 мин. Ultraturrax
Инкубация: 2 ч при комнатной температуре при помешивании
Прекращение: рН 3 с HCl
Диализ: 6 моль/л Gdn/HCl, рН 2,5
3 ммоль/л EDTA
4^oС, до полного удаления восстановителя.

Концентрация протеина после диализа: 8,5 мг/мл
Ренатурирование: опыт 1:
0,6 моль/л арг./НСl, рН 8
1 ммоль/л ЕDTA
0,5 ммоль/л GSH
5 ммоль/л GSSG
A) 0,1 ммоль/л Триса
B) 1 моль/л Триса
Пульс: C 50 мкг/мл через 30 мин
время 1 ч.

Конечная концентрация протеина 1 мг/мл
опыт 2:
0,6 моль/л арг./НСl, рН 8
1 ммоль/л EDTA
0,5 ммоль/л GSH
5 ммоль/л GSSG
A) 0,1 моль/л Триса
B) 1 моль/л Триса
Пульс: C 50 мкг/мл через 30 мин
время 1 ч.

Концентрация протеина: 0,6 мг/мл
После ренатурирования осуществляется центрифугация в течение 30 минут при 16000 грm. Затем осуществляют диализ 20 ммоль/л Триса, рН 8,1 ммоль/л EDTA.

Результат представлен в табл. 7.

Определение активности G CSF осуществлялось с помощью теста пролиферации (³H-тимидиновая вставка) с помощью лейкемия Zellinie (NFS 60), как описано в Mossmann, T. (1985) J.Immunol. Methods 65, 66 73 и Holmes, K.L. Plaszynski, E. Frederickson, T. T. Morse, H.C.III $ Ihle, J. (1985) PNAS USA 82, 6687 6691.

Аналогичные результаты получают при использовании G CSF и G CSF мутеинов, полученных согласно ЕР 91 107 429.2.

П р и м е р 8
Ренатурирование антител Fab фрагментов
Денатурирование: 5 моль/л Gdn/HCl, рН 8,5
0,1 моль/л Триса
2 ммоль/л EDTA
0,3 моль/л DTE
Cprot 5 мг/мл
Инкубация: 2-3 ч при комнатной температуре
Ренатурирование: трис буфер, рН 7,5
(Трис: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75 и 1 моль/л)
2 ммоль/л ЕDTA
6 ммоль/л GSSG
Cprot 50 мкг/мл
Инкубация: 80 ч при t^o 10^oC
Тест на активность: ELISA с биотинилированной СК, согласно DE A 38 35 350.4 (пример 8.2).

Результат представлен в табл. 8.

Выход продукта при ренатурировании Fab-антител линейно возрастает до значения концентрации Триса 0,5 моль/л; при дальнейшем повышении концентрации Триса выход продукта улучшается незначительно.

Формула изобретения

1. Способ реактивации рекомбинантного белка, включающий растворение тел включения под действием сильного денатурирующего средства в присутствии восстанавливающего агента и последующую ренатурацию белка в условиях, обеспечивающих и его реактивацию, отличающийся тем, что ренатурацию белка проводят в присутствии триса или его соли в концентрации не менее 0,4 моль/л при значении pH, необходимом для проявления биологической активности белка, и при концентрации белка, который либо постоянно присутствует в инкубационной смеси, либо поступает в ходе инкубации, 1 4000 мкг/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для поддержания pH используют буферные свойства триса.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для поддержания pH используют в том числе и буферные свойства триса.

4. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что концентрация триса составляет 0,4 2,0 моль/л.

5. Способ по пп.1 4, отличающийся тем, что в инкубационной смеси присутствует аргинин в концентрации 0,2 1,0 моль/л.

6. Способ по пп.1 5, отличающийся тем, что реактивируют рекомбинантный tpA или tpA-мутеин.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что реактивируют негликозилированный tpA-мутеин К2Р.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок непрерывно или периодически добавляют к раствору для ренатурации.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что реакцию проводят в специальном реакторе.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что ренатурацию с периодической подачей белка проводят в буферном растворе, содержащем трис в концентрации 1 моль/л и аргинин, а концентрацию белка увеличивают примерно на 200 мкг при каждой добавке.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что реактивируют рекомбинантный g CSF.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что реактивируют Fab фрагменты антител.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4