Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклонального антитела к гликопротеинам iiв- iiiа тромбоцитов человека и моноклональное антитело framon к гликопротеинам iiв-iiiа тромбоцитов человека

 

Использование: разработка биотехнологических препаратов для клинической практики, в частности лечения тромбозов, инфаркта миокарда и проведения операций по протезированию сосудов. Сущность: получение высокопродуктивного штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к гликопротеинам IIb - IIIa тромбоцитов человека. Штамм FRaMon получают в результате ступенчатого реклонирования и отбора из первичной популяции гибридных клеток СR С64. Он обладает повышенной стабильностью и высокой скоростью роста. Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости составляет 60-80 мкг/мл. Антитела FRaMon полностью ингибируют агрегацию тромбоцитов человека в концентрации 1-3 мкг/мл. 2 с.п.ф-лы, 1 табл., 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к моноклональным антителам (МоАТ) и элементам технологии их получения методами гибридомной технологии для дальнейшего использования в медицине, ветеринарии и научно-исследовательских работах.

Известно, что основные процессы, протекающие с участием тромбоцитов, опосредуются мембранными гликопротеидами (ГП), в первую очередь комплексом IIb-IIIa, являющимся рецептором фибриногена. Предполагается, что фибриноген образует мостики между тромбоцитами или служит кофактором в процессе агрегации.

Известны МоАТ и штаммы их продуцирующие, способные специфически связываться с комплексом ГП IIb-IIIа, ингибируя связывание фибриногена и других белков с тромбоцитами, имитируя состояние тромбоцитов, сходное с наблюдаемым при тромбастении Гланцмана. При этом тромбоциты теряют способность к агрегации, индуцированной большинством агонистов (АДФ, тромбин, коллаген, адреналин и др.).

Антитела, обладающие подобными свойствами, перспективны для использования в клинической практике в качестве антитромботических агентов, в частности, при лечении инфаркта миокарда и при операциях по протезированию сосудов.

Однако известные МоАТ способны полностью ингибировать агрегацию тромбоцитов только при концентрации антител более 5 мкг/мл, что может явиться их недостатком при использовании в клинической практике.

Целью изобретения является получение более эффективных антител и гибридомы, их продуцирующей.

Это достигается созданием гибридомного штамма FRaMon (6C4.2F5.1В5) и одноименных антител.

Штамм FRaMon был получен в результате ступенчатого реклонирования и отбора из первичной популяции 6С4 гибридомы СRC64, полученной на основе клеток иммунной селезенки мыши ВАLВ/С и мышиной миеломной линии Х63-Аg8-653.

Получение штамма СRС64 описано ранее и включает в себя иммунизацию мышей линии ВАLВ/С свежеотмытыми тромбоцитами в буфере Тироде-НЕРЕS и последующую гибридизацию клеток селезенки иммунной мыши с клетками мышиной миеломы Х63-Аg8-653 в присутствии среды RPMI 1640, содержащей 45% (объем/объем) ПЭГ (мол. вес 3350) и 15% DMSO. После гибридизации и отмывки от ПЭГ клетки высевали в 96-луночные планшеты.

Для получения штамма FRaMon клонирование клеток СRС64 осуществлялось из расчета 1,5 кл/лунку в среде RPMI 1640 с добавлением 20% сыворотки плода коровы, 4мМ глутамина, 10мМ пирувата натрия, аминокислот и витаминов.

Через неделю культивирования проводили отбор первичных гибридных клонов-продуцентов, определяя содержание антитромбоцитарных антител стандартным иммуноферментным анализом для тестирования иммуноглобулинов (тест а) и агрегационным тестом для определения специфической активности по ингибированию агрегации тромбоцитов человека (б).

Скрининг МаАТ, связывающихся с тромбоцитами, осуществляли методом ИФА с использованием интактных тромбоцитов. Отмытые тромбоциты (10 млн. в 100 мкл раствора Тироде-НЕРЕS) вносили в лунки 96-луночного планшета и осаждали в течение 5 мин при 1000 g. Для лучшего прикрепления тромбоцитов планшеты инкубировали 30 мин при 37Б198ЮС и затем удаляли неприкрепившиеся тромбоциты, промывая лунки раствором Тироде-НЕРЕS. После этого пластик блокировали 1% БСА (150 мкл/лунку, 30 мин, при 37^oС). Культуральную жидкость или очищенные антитела вносили в лунки по 50 мкл и инкубировали 40 мин при 37^oС. После отмывки раствором Тироде-НЕРЕS (5 раз) в лунки вносили по 50 мкл козьих антител против I g мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена. После инкубации (30 мин) и отмывки (7 раз) связавшуюся пероксидазу определяли по цветной реакции с хромогеном (0,1 мг/мл 1,2-фенилендиамина и 0,006% Н₂0₂ в 50 мМ цитратном буфере, рН 4,5). Хромоген добавляли по 100 мкл. Через 5-10 мин реакцию останавливали внесением 25 мкл 50%-ной Н₂S0₄. Оптическую плотность определяли спектрофотометрически при 492 нм. В положительном контроле использовали сыворотку иммунизированных мышей, а в отрицательном культуральную жидкость от миеломных клеток и сыворотку интактных мышей.

Способность МоАТ ингибировать агрегацию тромбоцитов (тест б) проверяли следующим образом. Агрегацию, стимулированную АДФ, исследовали в обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП, 3х10⁸ тромбоцитов/мл), а агрегацию, индуцированную тромбином, в суспензии отмытых тромбоцитов (3х10⁸ тромбоцитов/мл). Агрегацию определяли в агрегометре при 37^oС и перемешивании 900 об/мин.

Гибриды-продуценты клонировали методом предельных разведений на фидерном слое спленоцитов мыши. Эффективность клонообразования составляла 70-90% При этом количество продуктивных клонов составляло 80-90% В результате четырех ступенчатого реклонирования и отбора был получен штамм, значительно превосходящий первичную популяцию по стабильности, скорости роста и уровню синтеза высокоэффективных антител.

Условное наименование штамма FRaMon (6С4.2F5.1В5). Штамм депонирован в Коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером 644D и характеризуется следующими свойствами.

Морфология: клетки штамма FRaMon прозрачные, хорошо преломляющие свет, округлой или эллипсоидной формы, растущие в культуре в виде агрегатов (3-5 кл) и изолированных клеток. Однородность популяции по морфологии и размерам составляет не менее 85% Полиморфные клетки составляют не более 15% состава популяции.

Стандартные условия культивирования штамма: среда RPMI 1640 с 20% сыворотки плода коровы, 4 мМ глутамина, 10 мМ пирувата натрия, аминокислотами и витаминами, пенициллином и стрептомицином по 100 Ед/мл и 100 мкг/мл, соответственно.

Криоконсервация: в сыворотке плода коровы с 10% DMSO в концентрации 1 млн/мл.

При выращивании на среде RPMI 1640 с 20% сыворотки плода коровы насыщающая плотность популяции в статической культуре достигала 1,34 млн/мл при жизнеспособности 80-90% в течение 24 ч после достижения максимальной плотности.

Стандартная кривая роста штамма приведена на фиг.1.

Уровень синтеза антител, определяемый тестом а, составлял 60-80 мкг/мл культуральной жидкости. В тесте б на специфическую активность уровень синтеза составил 60-72 мкг/мл. Процедура замораживания-оттаивания практически не влияет на скорость роста клеток. Уровень синтеза антител на 3 сут после размораживания снижается на 10-15 мкг,затем в течение 7-10 дней восстанавливается до прежнего уровня (фиг.2). Жизнеспособность клеток после размораживания не менее 75% Характеристика культивирования гибридомы в организме животного.

Для получения препаративных количеств антител клетки штамма FRaMon культивируют в брюшной полости мышей линии ВАLВ/С. За 7 сут до инъекции клеток мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно в дозе 4х10⁶. Асцит образуется через 7-10 сут. По сравнению с исходной популяцией 6С4 штамм FRaMon характеризуется следующими свойствами (табл.1).

Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом FRaMon получило аналогичное условное наименование FRaMon.

Антитело FRaMon является иммуноглобулином класса IgG1. Концентрация МоАТ в асцитной жидкости, определяемая ИФА, составляет 10-20 мг/мл.

Выделение МоАТ FRaMon из асцитной жидкости проводят с помощью преципитации сульфатом натрия с последующей хроматографией на DEAE-ТоуореаrI. Очищенное антитело электрофоретически гомогенно и имеет мол.в. 150 кДа. Оно специфически связывается с ГП IIb-IIIa тромбоцитов человека. Определение природы антигена проводят методом его преципитации МоАТ FRaMon из лизата ¹²⁵J-меченных тромбоцитов. В преципитатах обнаруживаются два белка с мол. весами 130 кДа и 90 кДа в невосстанавливающих условиях и 100 кДа, в восстанавливающих, что соответствует электрофоретическим характеристикам ГП IIb и IIIa. Диссоциация комплекса ГП IIb-IIIa с помощью ЭДТА предотвращает связывание МоАТ FRaMon.

Специфичность МоАТ. Для характеристики специфичности определяли параметры связывания антитела FRaMon с тромбоцитами в присутствии двухвалентных катионов или ЭДТА. В присутствии ЭДТА антитело практически не связывалось с тромбоцитами, что соответствует данным иммунопреципитации и указывает на комплекс-зависимую природу эпитопа МоАТ FRaMon. В насыщающей концентрации с одним тромбоцитом связывалось порядка 48000 молекул ₁₂₅J-FRaMon. Это соответствует числу копий комплекса ГП IIb-IIIa на поверхности тромбоцита (40-50 тыс/кл). Сравнение параметров связывания и результатов агрегометрии показывает, что насыщение антителами мест связывания и полное блокирование агрегации тромбоцитов происходит при одних и тех же концентрациях антитела.

Приведенные данные позволяют считать, что антигеном антитела FRaMon является комплекс ГП IIb-IIIa, причем антитело распознает детерминанты только на комплексе данных белков.

МоАТ FRaMon предназначено для ингибирования агрегации тромбоцитов человека. Это свойство антитела проверено на тромбоцитах 25 доноров. Полное ингибирование АДФ-индуцированной агрегации в ОТП наблюдается при концентрации антител 3 мкг/мл. У некоторых доноров полное ингибирование агрегации отмечено при меньших концентрациях антитела (наименьшее значение 0,5 мкг/мл). Тромбин-индуцированная агрегация полностью ингибировалась в присутствии 3 мкг/мл, а неполная при 1 мкг/мл.

Действие F (ab')₂-фрагментов антитела FRaMon на агрегацию исследовано на тромбоцитах 15 доноров. F (ab')₂- фрагменты в концентрации 5 мкг/мл полностью блокировали индуцированную агрегацию.

Таким образом, МоАТ FRaMon, как и большинство описанных в литературе сходных по действию антител, является комплекс-специфическим и не взаимодействует с диссоциированными белками. Его специфическое действие обусловлено блокированием рецептора фибриногена комплекса ГП IIb-IIIa.

Основными свойствами МоАТ FRaMon являются: относится к классу I g G1; молекулярный вес 150 кДа; продуцируется гибридомой FRaMon депонированной ВСКК (П) под номером 644D; связывает на поверхности тромбоцитов комплекс мембранных гликопротеидов IIb-IIIa; ингибирует фибриноген-зависимую агрегацию тромбоцитов.

Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируется примером конкретного осуществления изобретения.

Клонирование первичной популяции гибридомы СRС64 отбиpают 600 клеток пеpвичной гибpидомы CRC64 в фазе логарифмического роста в 40 мл полной культуральной среды (пропись см.выше) и рассевают в четыре 96-луночных планшета с фидерным слоем по 100 мкл/лун, что составляет 1,5 кл/лун. За сутки до клонирования готовят фидер из спленоцитов интактной мыши. Для этого за сутки до клонирования рассевают суспензию спленоцитов из расчета 10⁵ клеток на лунку в объеме 100 мкл/лун. Планшеты инкубируют во влажной атмосфере 5-10% СО₂ при 37^oС.

Учет клонообразования проводят через 10 дней. Эффективность клонообразования составляет 80% Уровень синтеза антитела в клонах контролируют стандартным иммуноферментным анализом (метод а). Отбирают клоны с максимальным уровнем синтеза и повторяют полностью всю процедуру 4 раза. Уровень синтеза антитела FRaMon после 4 реклонирования составляет 60-80 мкг/мл.

Наработка антитела FRaMon в асцитной жидкости.

Клетки клона с уровнем синтеза 70 мкг/мл инъекцируют мышам линии ВАLС/С в дозе 4 млн внутрибрюшинно. За 7 сут до инъекции клеток мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Сбор асцита проводят через 10 сут. Концентрация антитела в асците составляет 15 мг/мл.

Очистка антитела FRaMon из асцитной жидкости.

К одному объему асцитной жидкости, содержащей антитело FRaMon, добавляют капельно 0,9 объема 2,53 М раствора Na₂SO₄и перемешивают в течение 90 мин. Преципитат осаждают при 5000 g в течение 30 мин и затем растворяют в 10 мМ фосфатном буфере (рН 8,0) для последующей очистки на ионообменном сорбенте. Раствор антитела FRaMon в 10 мМ фосфатном буфере наносят на колонку с сорбентом DEAE-ToyoPearl. После нанесения МоАТ колонку промывают 10 мМ фосфатным буфером (3 объема колонки) и затем элюируют сорбированное антитело градиентом фосфатного буфера 10-150 мМ (общий объем элюента 500 мл для колонки V= 30 мл). Содержание антител во фракциях определяют методом ИФА. Фракции, содержащие антитела объединяют, концентрируют и диализуют против ФСБ. Чистоту препарата МоАТ контролируют с помощью электрофореза в 7,5% ПААГ по Laemmli. Очищенное антитело электрофоретически гомогенно и имеет мол.вес 150 кДа.

Ингибирование агрегации тромбоцитов человека антителом FRaMon.

Агрегацию тромбоцитов измеряли по изменению светопропускания суспензии тромбоцитов с помощью агрегометра "Aggre- gation Analaizer" (БИОЛА, Россия) при концентрации тромбоцитов 2-3х10 /мл,температуре 37^oС и перемешивании 900 об/мин.

Для этого в кювету агрегометра вносили 400 мкл суспензии тромбоцитов, добавляли испытуемое антитело (50 мкл) в разведении 1:8 (1-3 мкг/мл), или контрольное антитело VM 64, не влияющее на агрегацию тромбоцитов. После трехминутной инкубации стимулировали агрегацию добавлением 10 мкМ АДФ. Агрегацию регистрировали в течение 3 мин после добавления индуктора и оценивали по уровню светопропускания. В контроле уровень светопропускания увеличивался до 100% При ингибировании агрегации МоАТ FRaMon уровень светопропускания не изменялся (см. фиг. 3, где 1 обогащенная тромбоцитами плазма + МоАТ FRaMon 3 мкг/мл; 2 обогащенная тромбоцитами плазма + F (ab')₂ фрагмент МоАТ FRaMon 2 мкг/мл; 3 обогащенная тромбоцитами плазма + МоАТ FRaMon 2 мкг/мл; 4 контроль).

Формула изобретения

1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) N 644Д продуцент моноклонального антитела к гликопротеинам IIв IIIа тромбоцитов человека.

2. Моноклональное антитело FRaMon к гликопротеинам IIв IIIа тромбоцитов человека, имеющее следующие свойства: продуцируется штаммом гибридных культивируемых клеток FRaMon; относится к Ig G1; обладает мол. м. 150 кДа; ингибирует фибриногензависимую агрегацию тромбоцитов; связывает на поверхности тромбоцитов комплекс мембранных гликопротеинов IIв IIIа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 22-2002

(73) Патентообладатель:Шереметев Владимир Георгиевич (RU)

Договор № 14504 зарегистрирован 29.05.2002

Извещение опубликовано: 10.08.2002        

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 20.12.2004        БИ: 35/2004

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.12.2008

Извещение опубликовано: 20.12.2008        БИ: 35/2008

---