Мурамилдипептидные производные, противогриппозная вакцина

 

Использование: иммунология, медицина, биотехнология. Сущность изобретения: получены новые мурамилпептидные производные, в частности [6-0-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил] -L-аланил-D-глютамамид и [6-0-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил] -L-аланил-N-метил-D -глютамамид. Мурамилдипептидные производные обладают иммуногенной активностью и используются для приготовления синтетических противогриппозных вакцин. Предложена противогриппозная вакцина, содержащая мурамилдипептидное производное и антиген вируса гриппа. 2 с и 6 з.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение касается мурамилдипептидных производных, обладающих иммуногенной активностью и потому используемых в качестве одного из компонентов синтетических противогриппозных вакцин типа виросомных вакцин. Изобретение также касается противогриппозной вакцины, использующей производные по изобретению и представляющей собой комплекс мурамилдипептидных производных и антигена оболочки вируса гриппа.

Вследствие того, что эффективность используемых в настоящее время противогриппозных вакцин на основе ГА (гемагглютинина) вируса гриппа не является постоянной вследствие мутаций гемагглютининовой молекулы этого широко распространенного вируса, имеется большая потребность в создании более эффективных вакцин, чем традиционные ГА-вакцины.

Из уровня техники известна комплексная, состоящая из ГА (гемагглютинина) и НА (неураминидазы) в качестве компонентов белковой оболочки синтетических вирусоподобных частиц антигена гриппа, которую получают из 6-О-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина. Это так называемая виросомная вакцина (см. выложенную в "J.P.KOKAI" заявку Японии N 61-282321). В частности, известная вакцина демонстрирует превосходный эффект повышения титра антител в крови.

Однако известная вакцина оказывает раздражающее действие в месте ее нанесения, приводя к покраснению кожи, что является нежелательной побочной реакцией и препятствует ее использованию в качестве терапевтического средства.

Задачей настоящего изобретения является создание новых мурамилдипептидных производных, которые могут использоваться в качестве компонента виросомных вакцин, не имеющих вышеописанных недостатков.

Другой задачей изобретения является создание новой противогриппозной вакцины виросомного типа, эффективной в отношении продуцирования антител и в то же время безопасной.

В соответствии с первым аспектом изобретения, предлагаются мурамилдипептидные производные следующей общей формулы: где R представляет ацетилгруппу, X- остаток L-аланина, A представляет остаток жирной кислоты с 10-60 атомами углерода, и R¹ представляет атом водорода, и R² представляет атом водорода или низшую алкилгруппу.

В соответствии со вторым аспектом изобретения, предлагается противогриппозная вакцина, содержащая антиген вируса гриппа и иммуностимулирующую добавку. Вакцина по изобретению содержит, в качестве иммуностимулирующей добавки, соединение общей формулы (1), причем в качестве антигена вируса гриппа использован ГАНА-антиген при следующем соотношении компонентов (мас. ч.): Гана-антиген вируса гриппа 1/300-10 Соединение формулы (1) 1 Описание сопровождается иллюстрациями, на которых изображено: фиг.1- электронная микрофотография (95000х) образца вакцины N 1 по изобретению; и фиг. 2 электронная микрофотография (95000х) образца вакцины N2 по изобретению.

Часть соединения формулы (1), а именно структура -NHCH-(CONH₂)-CH₂CH₂CO-
имеет D- и L-изомеры, поскольку в ней содержится асимметрический атом углерода. Обычно предпочтительно присутствие D-изомера.

Что касается сахарозного остатка в положении 1 формулы (1), то он имеет аномерные изомеры (альфа- и бета-изомеры), которые оба могут использоваться для вакцины по изобретению.

Для удобства оба аномерных изомера представлены одной и той же структурой формулой

Ниже приводятся технологическая схема получения соединения формулы (1):

А именно, соединение формулы (II) можно прореагировать с соединением (III) посредством метода конденсации, часто используемого для синтеза пептидов, такого как карбодиимидный метод, Eintopf-конденсация, или метод активного сложного эфира, для образования требуемого соединения формулы (I). Например, если обычно используют активно-эфирный метод, то соединение формулы (II) растворяют в инертном органическом растворителе, таком как диметилформамид, тетрагидрофуран, диоксан, ацетонитрил или их смесь, и осуществляют реакцию с реагентом для получения активного сложного эфира, такого как N, N-дисукцинимидилкарбонат, N,N-карбонилимидазол или N,N-дисукцинимидил-оксалат, предпочтительно, в присутствии органического основания, такого как триэтиламин, N-метилморфолин или 4-диметиламинопиридин при температуре от 0^oС до примерно 60^oС в течение от 30 минут до нескольких часов с образованием активного сложного эфира, к которому добавляют аминосоединение формулы (III) в присутствии основания, такого как вышеописанные основания, при температуре от приблизительно -15^oС до приблизительно 60^oС, предпочтительно, от 0^oС до 25^oС, и эта реакция может проводиться в течение от нескольких минут до примерно одного дня. Вышеуказаннй реагент для образования активного сложного эфира может использоваться в эквимолярном количестве по отношению к соединению формулы (II). Вышеуказанное органического основание может также использоваться эквимолярно или в избытке по отношению к соединению формулы (II). Полученный продукт очищают хроматографией на силикагелевой колонке или подобном устройстве с получением соединения формулы (I).

Соединение формулы (II) может быть приготовлено способом, описанным в патенте Японии 93-11359.

Комплекс, составляющий вакцину по изобретению, является таким, что соединение формулы (I) или его соль аггрегируют, если требуется, с липидом для получения везикулы, в оболочку которой внедряют антиген вируса гриппа. Типичным примером является вакцина, содержащая вирусоподобные частицы, называемые виросомами.

Антигены, которые могут использоваться по изобретению, включают антиген ГА (гемагглютинин), антиген НА (неураминидаза) и подобные антигены вируса гриппа. Обычно предпочтительнее использовать их смесь, так называемый ГА-НА антиген. ГА-НА антиген может быть получен посредством очистки вируса гриппа низко- или высокоскоростным центрифугированием для разделения фаз, или химической обработкой аллантоисной жидкости, инфицированной вирусом гриппа, с последующим переводом вируса в растворимое состояние поверхностно-активным веществом, таким как Тритон Х-100, натриевая соль холиевой кислоты или т.п. или посредством отделения вируса таким органическим растворителем, как эфир, и его очистки и выделения центрифугированием с градиентом плотности сахарозы, афинной хроматографией и т.п. Полученный таким образом антиген используется обычно в количестве от 1/300 до 10 мас.ч. предпочтительно, от 1/100 до 1 мас.ч. на одну весовую часть соединения формулы (I) или его соли.

Вакцину по изобретению можно получить различными методами, например, традиционным методом для получения липосом. Типичные примеры процесса получения вакцин приведены ниже.

Антиген вируса гриппа, соединение формулы (I) или его соль и предпочтительно фосфолипид смешивают вместе в подходящем буферном растворе, таком как фосфатно-буферный раствор или т.п. и к смеси для ее растворения добавляют эффективное количество (предпочтительно от 0,1 до 20 мас./об.) поверхностно-активного вещества, такого как холат натрия, октил-гликозид или т.п. Смесь затем подвергают диализу для удаления использованного поверхностно-активного вещества, получая при этом противогриппозную вакцину по изобретению. В полученную таким образом вакцину по изобретению могут добавляться в качестве изотонирующих веществ сахарид, такой как глюкоза, мальтоза или дактоза, соль, такая как хлорид натрия, или их смесь.

Примеры фосфолипидов включают фосфатидил-глицерины, такие как димиристоилфосфадил-глицерин и дипальмитоилфосфатидил-глицерин; фосфатидил-серин; фосфатидил-холины, такие как дипальмитоилфосфатидил-холин; фосфатидил-этаноламин; фосфатидилинозитол; фосфатидная кислота и т.п. Эти вещества могут быть получены из натурального сырья, такого как яичный желток или соевые бобы, или могут быть синтезированы. Они могут использоваться как по отдельности, так и в смеси.

В вышеописанном процессе, фосфолипид может использоваться в комбинации с холестерином, альфа-токоферолом, дицетилфосфатом, стеариламином или т.п. которые используют обычно в количестве не более 2 мас.ч. предпочтительно, от 1/10 до 1/2 мас.ч. на одну массовую часть соединения формулы (I) или его соли.

Вакцина по изобретению, полученная таким образом, обычно находится в таком виде, что соединение формулы (I) или его соль и фосфолипид образуют частицы, в мембрану которых внедрен антиген с получением так называемых виросом. Средний размер частиц и zeta-потенциал их поверхности может регулироваться посредством изменения соотношения количеств соединения формулы (I) или его соли и фосфолипида. Обычно средний диаметр виросомных частиц предпочтительно составляет от 40 до 300 нм, а их zeta-потенциал предпочтительно составляет от -5 до -70 mV.

Вакцина по изобретению предназначена обычно для подкожного введения. Вводят от 350 до 12 μг вакцины (из расчета антигенного белка) единовременно или несколько раз за сезон.

Мурамилдипептидные производные по изобретению обладают превосходной адъювантной активностью и являются прекрасными компонентами виросомной вакцины.

Вакцина по изобретению вызывает продуцирование антител с активностью, эквивалентной или более высокой, чем активность известной виросомной вакцины, причем с точки зрения возможных воспалений и лихорадки настоящая вакцина значительно безопаснее известной. Кроме того, вакцина по изобретению обладает высокой стабильностью при хранении, и ее можно хранить замороженной или лиофилизированной.

Для иллюстрации изобретения, ниже приводятся примеры его выполнения, не ограничивающие его объем.

Пример 1.

1,0 г [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил]-L-аланил-D-изоглютамина растворяли в 100 мл тетрагидрофурана. К раствору добавляли 0,3 г N, N-дисукцинимидил-карбоната и 0,15 мл триэтиламина, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Затем добавляли 0,22 мл 28%-ного водного раствора аммиака и перемешивали дальше при комнатной температуре еще 30 мин.

Реакционную жидкость концентрировали при пониженном давлении, и остаток подвергали хроматографии на силикагелевой колонке. После очистки элюированием смесью хлороформ/метанол с последующей сушкой замораживанием из смеси вода/диоксан получили 0,44 г [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил] -L-аланил-D-глутамамида. Температура плавления: 155-165^oС. Молекулярная масса: 926 (C₄₉H₉₁N₅O₁₁);
FAB Масс-спектрометрия m/z 927 (М+1)
¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ:
0,85 (6H, т, J=7 Гц),1,2-1,3,1,39, 1,50 (58Н, м),1,72 (1Н,м)
1,80 (3Н,с), 1,93(1Н,м), 2,08(2Н, т,J=8 Гц),2,30(1Н,м),
3,28(1Н,т, J=9 Гц), 3,46(1Н,т,J=9 Гц),3,67(1Н,м),3,81(1Н,м),
4,02 (1Н,д-д,J=12 Гц,5 Гц),4,12(1Н,д-кв,J=9 Гц, 5 Гц),
4,31 (2Н,м), 4,34(1Н,д,J=10 Гц), 4,44 и 4,98 (1Н),
5,43 (1Н,д,J=4 Гц), 6,67(1Н,д,J=4 Гц), 6,74 (1Н,с),
7,01 (1Н,с), 7,27 (1Н,с), 7,30(1Н,с), 7,65(1Н,д,J=7 Гц),
8,08 (1Н,д,J=8 Гц), 8,17 (1Н,д, J=8 Гц).

Пример 2
1,0 г [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил]-L-аланилD-изоглюта- мина растворяли в 100 мл тетрагидрофурана. К раствору добавляли 0,3 г N, N-дисукцинимидил-карбоната и 0,15 мл триэтиламина, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Затем в смесь добавляли 0,2 ил 40% -ного водного раствора метиламина и перемешивали дальше при комнатной температуре еще 30 мин.

Реакционную жидкость концентрировали при пониженном давлении, и остаток подвергали хроматографии на силикагелевой колонке. После очистки элюированием смесью хлороформ/метанол с последующей сушкой замораживанием из смеси вода/диоксан получили 0,5 г [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил] -L-аланил-N-метил-D- глутамамида. Температура плавления: 95-100^oС. Молекулярная масса: 939 (C₅₀H₉₃N₅O₁₁);
FAB Масс-спектрометрия m/z 940 (М+1)
¹Н-ЯМР (ДMSO-d₆) δ:
0,85 (6H,т, J=7 Гц),1,2-1,3,1,39,1,50 (58Н,м),1,73 (1Н,м),
1,79 (3Н,с), 1,93(1Н,м),2,07 (2Н,т,J=8 Гц), 2,30 (1Н,м),
2,55 (3Н,д,J=5 Гц), 3,26 (1Н,т,J=9 Гц), 3,46 (1Н,т,J=9 Гц),
3,68 (1Н,м), 3,82 (1Н,м), 4,03 (1Н,д-д,J=12 Гц, 5 Гц),
4,12 (1H,д-кв, J=9 Гц,5 Гц),4,30 (2Н,м),4,36 (1Н,д,J=10 Гц),
4,98 (1Н,т,J=3,5 Гц), 5,43 (1Н,д,J=4 Гц),6,67 (1Н,д,J=4 Гц),
7,01(1Н,с),7,31(1Н,с),7,64 (1Н,д,J=7 Гц),7,71 (1Н,д,J=5 Гц),
8,07 (1Н,д, J=8 Гц), 8,17 (1Н, д,J=8 Гц).

Пример 3
По примеру 2, получали [6-O-(2-тетрадецилгексадеканол)-N-ацетилмурамоил] -L-аланил-N-этил-D- глутамамид. Молекулярная масса: 953 (C₅₁H₉₅N₅O₁₁);
FAB Масс-спектрометрия m/z 954 (М+1)
¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ:
0,85(6Н,т,J=7 Гц),0,99(3Н,т,J=7 Гц),1,2-1,3,1,39,1,50(58Н,м),
1,71 (1Н,м),1,79 (3Н,с),1,93 (1Н,м),2,06 (2Н,т,J=8 Гц), 2,29 (1Н,м),
3,04 (2Н,д-кв,J=3,5 Гц, 7 Гц), 3,28 (1Н,т,J=9 Гц),3,45 (1Н,т,J=9 Гц),
3,68 (1Н,м),3,81 (1Н,м),4,03 (1Н,д-д, J=12 Гц, 5 Гц),
4,12 (1Н,д-кв, J=9 Гц,5 Гц), 4.29 (2Н,м), 4,35 (1Н,д,J=10 Гц),
4,97 (1Н,т,J=3,5 Гц),5,44 (1Н,д,J=7 Гц), 6,68 (1Н,д,J=4 Гц),
7,01(1Н,с),7,30(1Н,с),7,64(1Н,д,J=7 Гц),7,76(1Н,д,J=5,5 Гц),
8,07 (1Н,д, J=8 Гц),8.16 (1Н,д,J=8 Гц).

Пример 4.

Приготовление ГА-НА антигена вируса гриппа.

Очищенный вирус получают из аллантоисной жидкости, инфицированной штаммом Yamagata/120/86 вируса гриппа А с помощью высокоскоростного центрифугирования (23 тыс.об./мин, 90 мин), низкоскоростного центрифугирования (6 тыс. об. /мин, 3 ч) и центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Затем к раствору вируса добавляют Тритон Х-100 в таком количестве, чтобы концентрация Тритона составила 1% Смесь тщательно перемешивают для растворения вируса и затем получают раствор очищенного ГАНА-антигена посредством равновесного метода градиента плотности сахарозы.

Приготовление виросомной вакцины.

Из полученного как описано выше раствора очищенного ГАНА-антигена приготавливают четыре вида образцов вакцины, каждый из которых имеет состав, показанный в табл.1, следующим образом:
соответствующие ингредиенты смешивают и затем к смеси добавляют октилглюкозид в таком количестве, чтобы его концентрация составила 4% для растворения ингредиентов смеси. Затем осуществляют диализ в содержащем 5% глюкозы фосфатно-буферном растворе (рН 7,4) традиционным методом. Концентрацию ГАНА-антигена в каждом полученном таким образом образце доводили до 70 μг/мл:. Виросомные образования наблюдали в полученном образце. Виросомы образцов N 1 и 2 по изобретению показаны на фиг.1 и 2.

Виросомные вакцины (N 1 и 2) по изобретению и контрольную вакцину разводили до концентрации 1/15 исходного вакцинного раствора и вводили подкожно в области спинки каждой из группы морских свинок, состоявшей их 10 животных, в количестве 0,5 мл. Через три недели после инокуляции, свинок инокулировали вакциной еще раз в том же количестве. Через три и пять недель соответственно, у свинок брали кровь и тестировали ее на гемагглютин-ингибирование согласно методу WHO для определения активности продуцирования антител. Результаты показаны в табл.1.

Из вышеприведенной таблицы очевидно, что вакцины по настоящему изобретению проявляют активность продуцирования антител, эквивалентную или более высокую, чем контрольные вакцины.

Примечание: контрольное соединение - [6-O-(2-тетрадецилгексадеканол)-N-ацетилмурамоил]-L-аланил-D-изоглютамин.

Тест на реакцию покраснения
В ходе теста на реакцию покраснения, 0,5 мл образца инокулировали подкожно в спинку каждому из пяти кроликов, и каждый день определяли площадь покрасневшей области кожи Затем рассчитывали общую площадь у пяти кроликов и затем рассчитывали среднюю площадь области покраснения. Результаты показаны в табл.2.

Из вышеприведенной таблицы очевидно, что степень покраснения, вызванного вакцинами по изобретению, ниже, чем степень покраснения, вызываемого контрольными вакцинами.

Тест на лихорадку
В ходе теста на лихорадку, 1 мл каждого образца вводили в вену кролику согласно Стандартной Общей методики исследования биологических продуктов. Когда общее повышение температуры, возникшее в результате реакции на введение вакцины у трех кроликов, составляло 1,3^oС или менее, то результат теста рассматривался как отрицательный, а когда это повышение температуры составляло 2,5^oС или более, то результат считался положительным. Результаты приведены в табл. 3.

Из вышеприведенной таблицы очевидно, что степень повышения температуры, вызванного введением вакцины по изобретению ниже, чем степень повышения температуры, вызванного контрольной вакциной.

Формула изобретения

1. Мурамилдипептидные производные общей формулы I

где R ацетилгруппа;
X остаток L-аланина;
A остаток жирной кислоты с 10 60 атомами углерода;
R₁ атом водорода;
R₂ атом водорода или низшая алкилгруппа.

2. Производные по п. 1, отличающиеся тем, что А - тетрадецилгексадеканоил.

3. Производные по п. 1, отличающиеся тем, что R² С₁ - С₂-алкил.

4. Производные по п. 1, отличающиеся тем, что выбраны из группы, состоящей из [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил]-L-аланил-D-глутама- мида, [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)-N-ацетилмурамоил]- L-аланил-N-метил-D-глутамамида и [6-O-(2-тетрадецилгексадеканоил)- N-ацетилмурамоил] -L-аланил-N-этил-D-глутамамида.

5. Противогриппозная вакцина, содержащая антиген вируса гриппа и иммуностимулирующую добавку, отличающаяся тем, что в качестве иммуностимулирующей добавки она содержит соединение общей формулы I по п. 1, а в качестве антигена вируса гриппа ГАНА-антиген при следующем соотношении компонентов, мас. ч.

ГАНА-антиген вируса гриппа 1/300 10
Соединение формулы I по п. 1 1
6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что в соединении формулы I по п. 1 А тетрадецилгексадеканоил.

7. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что соединение формулы I или его соль по п. 1 и любой липид образуют везикулу, в оболочку которой внедрен гриппозный ГАНА-антиген.

8. Вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что она содержит фосфолипид в количестве от 1/4 до 3 мас.ч. на 1 мас.ч. соединения формулы I или его соли по п. 1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2