Способ получения гиалуроновой кислоты

 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения гиалуроновой кислоты, используемой в медицине и косметике в качестве вязкоэластичного и влагоудерживающего средства. Изобретение решает задачу повышения выхода гиалуроновой кислоты. Указанный результат достигается тем, что в способе получения гиалуроновой кислоты, предусматривающем аэробную ферментацию продуцируемого микроорганизма на водной питательной среде, содержащей источники азота, углерода, минеральные соли и бактериолитический фермент, при температуре 25 - 40^oС и рН 6,5 - 8,0, удаление мицелия центрифугированием и хроматографическую очистку надосадочной жидкости на ионообменной смоле, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Streptomyces violascense FERM ВР-11132, ферментацию проводят в течение 36 - 96 ч, в состав питательной среды вводят, в мас.%, 1,0 - 2,0 казеина, 0,8 - 1,8 кукурузного крахмала, 0,6 - 1,2 мясного экстракта, 0,5 - 1,0 соевой муки, 0,4 - 0,7 глюкозы, 0,4 - 0,6 хлорида натрия, 0,3 - 0,5 хлорида магния, 0,2 - 0,4 сульфата цинка, 0,1 - 0,2 хлорида кобальта, в качестве бактериолитического фермента используют препарат оразу в количестве 0,1 - 0,2 г/л, в качестве ионообменной смолы используют диэтиламиноэтилцеллюлозу, а перед хроматографической очисткой надосадочную жидкость обрабатывают 3 - 4 объемами ацетона и осадок растворяют в воде. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения гиалуроновой кислоты (ГК), используемой в медицине и косметике в качестве вязкоэластичного и влагоудерживающего средства (Стейси М. Баркер С. Углеводы живых тканей. М. Мир, 1965, с. 76 80, Бычков С.М. Колесникова М.Ф. "Биохимия", 1969, т. 34, ч. I, с. 204).

Известны способы получения ГК из различных граммположительных и граммотрицательных микроорганизмов (патент США N 3988205, 1976, патент Японии N 59 185150, 1984; N 60 80949, 1985). Недостатки этих способов заключаются в низком выходе целевого продукта, не превышающем 2 4 г/л культурального бульона.

Наиболее близким к заявленному по технической сущности является принятый за прототип способ получения ГУ (1), согласно которому в качестве продуцирующих микроорганизмов используют штаммы Streptococcus equi ВР-879 или Streptococcus Zooepidemicus ВР-878, аэробную ферментацию проводят в течение 24 48 ч при 25 40^oС и рН 6,5 8,0 на водной питательной среде, содержащей рассчитанные количества источников азота, углерода и минеральных солей, а также бактериолитический фермент лизоцим, поверхностно-активные вещества и сыворотку крови коров, овец, лошадей или человека, а целевой продукт очищают хроматографией на ионообменной смоле амберлите ХАД-2.

При этом получают ГК с молекулярной массой 0,6 2·10⁶ Д, содержанием белка менее 0,05% и истинной вязкостью 12 17,3 дл/г.

Недостаток известного способа заключается в низком выходе ГК 5,2 5,8 г/л.

Изобретение решает задачу повышения выхода ГК.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения ГК, предусматривающем аэробную ферментацию продуцирующего микроорганизма на водной питательной среде, содержащей источники азота, углерода, минеральные соли и бактериолитический фермент, при температуре 25 40^oС и рН 6,5 8,0 удаление мицелия центрифугированием и хроматографическую очистку надосадочной жидкости на ионообменной смоле, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Streptomyces violascence FERM BP-11132, ферментацию проводят в течение 36 96 ч, в состав питательной среды вводят, в мас. 1,0 2,0 казеина, 0,8 1,8 кукурузного крахмала, 0,6 1,2 мясного экстракта, 0,5 - 1,0 соевой муки, 0,4 0,7 глюкозы, 0,4 0,6 хлорида натрия, 0,3 0,5 хлорида магния, 0,2 0,4 сульфата цинка, 0,1 0,2 хлорида кобальта, в качестве бактериолитического фермента используют препарат оразу в количестве 0,1 0,2 г/л, в качестве ионообменной смолы используют диэтиламиноэтилцеллюлозу, а перед хроматографической очисткой надосадочную жидкость обрабатывают 3 4 объемами ацетона и осадок растворяют в воде.

В результате реализации технологического процесса получают ГК с молекулярной массой 1,8 2,4·10⁶ Д, содержанием белка менее 0,05% и истинной вязкостью 15 18 дл/г, т.е. не уступающую по этим показателям препарату ГК, получаемому по известному способу. Однако выход ГК увеличивается в 1,7 2,1 раза и составляет 8,8 12,2 г/л.

Пример 1. В 0,5 л стерильной водной питательной среды, содержащей, в мас. 1,0 казеина, 0,8 кукурузного крахмала, 0,6 мясного экстракта, 0,5 соевой муки, 0,4 глюкозы, 0,4 NaCl, 0,3 MgCl₂·6Н₂О, 0,2 ZnSO₄·7Н₂О, 0,1 CoCl₂ и 0,05 г оразы (использовали фармокопейный гранулированный препарат сразу из культуры гриба Aspergillus oryzae), рН 6,5, вносят культуру Streptomyces violascense FERM ВR-11132, инкубируют в аэробных условиях (0,5 объема стерильного воздуха в минуту) при 25^oС в течение 36 ч, мицелий отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин), к 450 мл надосадочной жидкости добавляют 1350 мл ацетона (3 объема), через 1 ч образующийся осадок отфильтровывают, растворяют в 100 мл воды, раствор пропускают через колонку (1 х 40 см) с диэтиламиноэтил-целлюлозой (ДЭАЭ-Ц), колонку вымывают фосфатным буферным раствором, рН 7,4, активные фракции элюата сушат сублимацией и получают 4,4 г гиалуроновой кислоты (выход 8,8 г/л), с молекулярной массой 1,8·10⁶ Д, содержанием белка 0,04% и истинной вязкостью 15 дл/г.

Пример 2. В 0,5 л стерильной водной питательной среды, содержащей, в мас. 1,5 казеина, 1,4 кукурузного крахмала, 0,9 мясного экстракта, 0,75 соевой муки, 0,55 глюкозы, 0,5 NaCl, 0,4 MgCl₂·6H₂O, 0,3 ZnSO₄·7H₂O, 0,15 СoCl₂ и 0,075 г оразы, рН 7,2, вносят культуру Streptomyces violascense FERM BP-11132, инкубируют в аэробных условиях (0,5 объема стерильного воздуха в минуту) при 32^oС в течение 66 ч, мицелий отделяют центрифугированием при 3000 об./мин, к 450 мл надосадочной жидкости добавляют 1575 мл ацетона (3,5 объема), через 1 ч образующийся осадок отфильтровывают, растворяют в 100 мл воды, раствор пропускают через колонку (1 х 40 см) с ДЭАЭ-Ц, колонку вымывают фосфатным буфером, рН 7,4, активные фракции элюата сушат сублимацией и получают 5,25 г гиалуроновой кислоты (выход 10,5 г/л), с молекулярной массой 1,95·10⁶ Д, содержанием белка 0,03% и истинной вязкостью 16,5 дл/г.

Пример 3. В 0,5 л стерильной водной питательной среды, содержащей, в мас. 2,0 казеина, 1,8 кукурузного крахмала, 1,2 мясного экстракта, 1,0 соевой муки, 0,7 глюкозы, 0,6 NaCl, 0,5 MgCl₂·6H₂O, 0,4 ZnSO₄·7Н₂О, 0,2 СoCl₂ и 0,1 г оразы, рН 8,0, вносят культуру Streptimyces violascense BP-11132, инкубируют в аэробных условиях (0,5 объема стерильного воздуха в минуту) при 40^oС в течение 96 ч, мицелий отделяют центрифугированием при 3000 об./мин, к 450 мл надосадочной жидкости добавляют 1800 мл ацетона (4 объема), через 1 ч образующийся осадок отфильтровывают, растворяют в 100 мл воды, раствор пропускают через колонку (1 х 40 см) с ДЭАЭ-Ц, колонку вымывают фосфатным буферным раствором, рН 7,4, активные фракции элюата сушат сублимацией и получают 6,1 г гиалуроновой кислоты (выход 12,2 г/л), с молекулярной массой 2,4·10⁶ Д, содержанием белка 0,04% и истинной вязкостью 18 дл/г.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей известного способа и заявляемого объекта приведен в таблице.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать препарат гиалуроновой кислоты, не уступающий известному по физико-химическим характеристикам, но с большим выходом (в 1,7 2,1 раза).

Формула изобретения

Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий аэробную ферментацию продуцирующего микроорганизма на водной питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли с добавлением бактериолитического фермента при 25 40^oC и pH 6,5 8,0, удаление мицелия центрифугированием и выделение целевого продукта хроматографической очисткой на ионообменной смоле, отличающийся тем, что в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Streptomyces violascence FERM ВР-11132, ферментацию проводят в течение 36 96 ч, в качестве водной питательной среды используют среду состава, мас.

Казеин 1 2 Кукурузный крахмал 0,8 1,8 Мясной экстракт 0,6 1,2 Соевая мука 0,5 1,0 Глюкоза 0,4 0,7 Хлорид натрия 0,4 0,6 Сульфат цинка 0,2 0,4 Хлорид кобальта 0,1 0,2 Вода Остальное
в качестве бактериолитического фермента используют препарат оразу из культуры гриба Aspergillus oryzal в количестве 0,1 0,2 г/л водной питательной среды, после удаления мицелия центрифугированием надосадочную жидкость обрабатывают 3 4 объемами ацетона и образующийся осадок растворяют в воде, полученный раствор используют для выделения целевого продукта хроматографической очисткой на ионообменной смоле, а в качестве ионообменной смолы используют диэтиламиноэтилцеллюлозу.

РИСУНКИ

Рисунок 1