Тиомаринол, обладающий антибактериальными свойствами, штамм микроорганизма alteromonas rava sank-73390 - продуцент тиомаринола и способ получения антибиотика тиомаринола

 

Использование: в качестве антибактериального средства. Тиомаринол получают путем культивирования штамма Alteromonas rava SANK 73390 и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости. 3 с.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к новому соединению, которое назвали "Thiomarind", а также способу приготовления тиомаринола, включающему ферментативное использование микроорганизма биологического рода Alteromonas и особенно образец нового вида Alteromonas rava, обозначенный как SANK 73390, который является новым сам по себе и составляет часть настоящего изобретения. Тиомаринол обладает множеством лечебных, в частности антибактериальными, эффектов, следовательно, изобретение представляет также композиции и способы терапевтического или профилактического использования этого соединения.

Организмы рода Alteromonas могут быть выделены из морской воды и было показано, что они образуют соединения, пригодные для терапевтического использования. Например, соединение, известное как Viscabelin, было получено из одного из видов Alteromonas и было показано, что оно выявляет антиопухолевую активность (Японская патентная Kokai заявка N Sho 63-27484).

Что касается структуры тиомаринола, известны несколько веществ - антибиотиков, имеющих аналогичные структуры, и эти вещества могут быть разделены на три группы.

Первая группа включает псевдомоновые кислоты, прежде всего выделяемые из вида Pseudomonas. Эти соединения включают псевдомоновую кислоту А [образованную Pseudomonas fluorescens раскрываемую в J.Chem. Soc.Perkin Trans, 1, 294, 1977] псевдомоновую кислоту С [там же 2827, 1982] и псевдомоновую кислоту D [там же, 2655, 1983] Псевдомоновая кислота А продается под названием "Bactroban" (зарегистрированная торговая марка Beleham) в форме 2% -ной дерматологической мази для антибактериального использования.

Другие производные псевдомоновой кислоты были получены из морских бактерий [Am. Chem. Soc. Abstr.Pap, 200 (2), (1990)] но эта ссылка не касается вопроса какой-либо бактериальной активности.

Вторая группа веществ, имеющих структуру, аналогичную структуре соединений изобретения, включает группу, которую содержит антибиотики голомицин [Helv. Chim. Acta, 42, 563, 1959] пирротин [J.Am.Chem.Soc. 77, 2861, 1955] тиолютин [Anero. Chem. 66, 745, 1954] ауреотрицин [J.Am.Chem.Soc. 74, 6304, 1952] и другие. Эти антибиотики образуются типичным образом лучистыми грибками и характеризуются наличием серусодержащего хромофора. Ксеноpхабдины I-V являются веществами, родственными голомицину, и также могут быть выделены из бактерий (описаны WO 84/01775).

Были проведены различные исследования производных этих двух групп, но мы не имеем сведений о каких-либо открытиях вещества, имеющего молекулярное строение тиомаринола или которое бы характеризовалось аналогичными свойствами.

Третья группа соединений раскрывается в публикациях, таких как Японская заявка Kokai NN 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 и 54-125672, которое раскрывают псевдомоновые кислотные производные, имеющие структуру, аналогичную тиомаринолу, но в которых концевая карбоксильная кислота замещена на аминогруппу. Эти соединения не выявляют сравнимой антибактериальной активности и не показывают широкого спектра антибактериальной активности. Действительно, эти соединения демонстрируют тенденцию в наличии более слабой антибиотической активности в сравнении с исходной псевдомоновой кислотой.

Ни одно из описанных выше соединений не было выделено из вида Alteromonas и ни одно не является идентичным тиомаринолу. Например, одной из характеристик строения тиомаринола является присутствие ОН-группы, расположенной между 6-членным кольцом и α,β-ненасыщенной карбонильной группой. Соответственно, тиомаринол имеет явное отличие от описанных в предшествующем уровне техники.

Целью изобретения является создание нового соединения, имеющего улучшенную эффективность и более широкий спектр антибактериальной активности по сравнению с описанными выше группами антибиотиков.

Следовательно, представленное изобретение дает соединение формулы I: Изобретение также описывает способ приготовления тиомаринола, который включает выращивание тиомаринол-образующего микроорганизма Alteromonas рода и выделение тиомаринола из культуры.

Изобретение дает также фармацевтическую композицию, включающую тиомаринол в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Далее изобретение представляет использование тиомаринола в терапии, в частности для лечения или профилактики бактериальных инфекций.

Изобретение предусматривает использование тиомаринола для изготовления лекарственного для лечения или профилактики бактериальных инфекций.

Кроме того, изобретение предусматривает способ лечения или профилактики бактериальных инфекций, который включает прием эффективного количества тиомаринола млекопитающим, которым может быть человек, страдающий от такой инфекции или чувствительный к ней.

Из вышеизложенного ясно, что тиомаринол содержит ряд асимметричных углеродных атомов и несколько двойных связей. Изомеризация, в частности, возможна в α,β-ненасыщенной карбонильной части тиомаринола. Таким образом, тиомаринол может образовывать различные оптические и геометрические изомеры. И хотя все эти соединения представляются здесь единственной молекулярной формулой, данное изобретение включает как индивидуальные, выделенные изомеры, так и их смеси, включая рацематы. В случае применения стереоспецифических методов синтеза или оптически активных соединений, в качестве исходных веществ, могут быть непосредственно получены индивидуальные изомеры; с другой стороны, если готовится смесь изомеров, индивидуальные изомеры могут быть получены использованием стандартных способов разделения.

Естественный тиомаринол имеет тенденцию принимать стандартную оптическую конфигурацию. Таким образом, хотя другие конфигурации и даются, предпочтительной является природная конфигурация.

Тиомаринол может быть получен выращиванием тиомаринолобразующим микроорганизмом рода Alteromonas и затем собиранием тиомаринола из питательной среды. Варианты тиомаринола, обладающие необходимой антибактериальной активностью, могут быть получены аналогичным образом из других видов или образцов Alteromonas, которые образуют требуемое соединение, или они могут быть получены соответствующей модификацией соединения, полученного ферментацией, как было описано, или они могут быть синтезированы непосредственно химическим путем.

В частности, мы особенно предпочитаем использовать в качестве микроорганизма новые образцы Alteromonas rava и особенно недавно выделенный вид Alteromonas rava, который мы обозначили SANK 73390. Вид SANK 73390 является морским микроорганизмом, который был выделен из морской воды, собранной в области моря Koina, Minamiyzu Machi, префектура Shiruona, Япония, и этот вид был депонирован в Институте Депонирования, Исследовательском Институте микробиологической технологии, Агентстве промышленных исследований и технологии, Япония 30 апреля 1991 г. N регистрации FERM ВР-3381 согласно Будапештскому Договору.

Таксономные характеристики вида Alteromonas rava SANK 73390 представлены ниже.

1. Морфологические характеристики.

Вид Alteronomas rava выращивался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Последующие микроскопические наблюдения показали, что клетки имели палочкообразную форму и каждая имела размер в диаметре от 0,8 до 1,0 мкм и в длину от 2,0 до 3,6 мкм. Этот вид является грамотрицательным и развивается посредством полярного одножгутикового flagellum.

2. Рост на морском агаре.

SANK 73390 выращивался в течение 24 ч при 23^oC на морском агаре (Difco). Образующиеся колонии наблюдались в виде палевых серо-желтого цвета, круглых, плоских и сплошных образований. Водорастворимый пигмент не образовывался.

3. Физиологические свойства.

(1) Требования к морской воде: SANK 73390 требует для роста морскую воду.

(2) Окислительно-ферментативное испытание (Hugh-Zeifson метод. [J.Bact, 66, 24-26 (1953)] в питательной среде, приготовленной из искусственной морской воды): не действует на карбогидрат.

(3) Оксидаза: + (4) Каталаза: + (5) Кислородное требование: аэробное (6) Снижение нитрата: - (7) Гидролиз крахмала: + (8) Разложение агара: - (9) Разжижение желатина: + (10) Выработка ol Naze:
(11) Выработка липазы: +
(12) Температура для роста: слабый рост при 4^oC, хороший рост между 17^oC и 26^oC, отсутствие роста при 35^oC.

(13) Требование к фактору роста: на основных питательных средах, описанных в Journal of Bacteriology, 107, 268-294 (1971), SANK 73390 требует не содержащей витаминов Casamino кислоты.

(14) Усваиваемость источников углерода: на основных питательных средах, описанных в Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971), дополнительно включающих 0,1 мас. к объему не содержащей витаминов Casamino кислоты при культивировании в условиях перемешивания (см. табл. 1).

4. Хематаксономическая характеристика.

(1) Мол. гуанина и цитозина (содержание G + C) ДНК: 43,4% (метод ВЭЖХ).

(2) Хиноновая система: Ubiguinon Q-8.

Принимая во внимание приведенные выше таксономические характеристики, вид Alteromonas rava SANK 73390 сравнивался с видами, описанными в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, т. 1 (1984), а также и с аналогичными видами, описанными в последних выпусках Междунаpодного журнала Системой бактериологии. Мы установили, что вид Alteromonas rava SANK 73390 имеет определенное сходство с Alteromonas citrea, другим морским микроорганизмом. SANK 73390 и Alteromonas cirea АТСС 29719 (стандартный вид) культивировались в аналогичных условиях и сравнивались.

По сравнению с палевым, серо-желтого цвета микроорганизмом SANK 73390, колонии АТСС 29719 были зеленовато-желтого цвета. SANK 73390 отличается от Alteromonas citrea показателем роста при 4^oC и способностью к усвоению трехалозы и пропионата натрия в качестве источников углерода.

Соответственно Alteromonas rava вид SANK 73390 является новым видом Alteromonas rava и отличается по основным характеристикам от ближайших известных видов, выделенных в соответствии с каталогом N АТСС 29719.

Приведенные выше характеристики являются типичными характеристиками вида SANK 73390. Однако хорошо известно, что характеристики видов Alteromonas являются изменчивыми как для природных, так и для искусственных видов. Приведенные выше характеристики определяют выделенный вид Alteromonas rava, но не являются типичными для других видов Alteromonas или видов Alteromonas rava, которые способны образовывать тиомаринол или его существующие в природе разновидности. Такие другие виды подпадают под действие изобретения.

Очевидно, что SANK 73390 или любой другой вид микроорганизма, способный к созданию тиомаринола или одного из его разновидностей, может быть подвергнут субкультивированию или биотехнологическому изменению или модифицированию с образованием организма с отличающимися характеристиками. Единственным требованием является требование, чтобы образующийся организм был способен к производству требуемого соединения.

Такие альтерации и модификации могут принимать любую желаемую форму, или могут быть следствием таких явлений, как, например, условия культивирования. Виды могут быть изменены культивированием и таким отбором, который имеет целью создать характеристики повышения роста или роста при более низкой/более высокой температурах.

Целевыми могут быть в основном биотехнологические модификации и могут быть представлены выборочные характеристики, такие как бактериостатическая устойчивость или восприимчивость, или их комбинация для того, чтобы сохранить чистоту или создать возможность для очистки культур, особенно посевов культур время от времени.

Другими характеристиками, которые могут быть произведены генетическим воздействием, являются любые характеристики, допустимые для видов Alteromonas. Например, могут быть объединены сопротивления плазмидного кодирования или могут быть устранены какие-либо существующие в природе плазмиды. Благоприятными плазмидами являются такие, которые дают ауксотропные свойства. Плазмиды могут быть получены из соответствующего источника или могут быть получены с помощью инженерии выделением существующего в природе плазмида Altromonas и введением желаемого гена или генов из другого источника. Природные плазмиды также могут быть модифицированы любым другим желаемым способом.

Для того, чтобы получить тиомаринол из культуры соответствующего микроорганизма, микроорганизмы должны быть ферментированы в соответствующей среде. Такие среды обычно являются хорошо известными и часто используются при создании других ферментативных продуктов.

Типичным является, когда для питательной среды является необходимым наличие любой комбинации источника углерода, источника азота и одного или большего числа неорганических солей, ассимилируемых соответствующим микроорганизмом. Минимальным требованием для питательной среды является требование, чтобы она содержала эти ингредиенты, существенные для роста микроорганизма.

Соответствующими источниками углерода являются глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, маннитол, глицерин, декстрин, овсяная пища, хлебная водка, кукурузный крахмал, картофель, кукурузный порошок, порошок соевых бобов, масло хлопкового семени, сироп, лимонная кислота и винная кислота, любой из которых может быть использован как один, так и в сочетании с другим или с большим числом названных веществ. Типичными применяемыми количествами являются количества в интервале от 1 до 10 мас. на объемное количество среды, хотя это количество может по желанию изменяться в соответствии с желаемым результатом.

Соответствующими источниками азота являются любые вещества, содержащие протеин. Примерами источников азота являются органические источники азота животного и растительного происхождения, ими могут являться также экстракты из таких природных источников, как порошок соевых бобов, порошок гороховых зерен, порошок из хлопковых семян, гидролизат казеина, фермамин, рыбный порошок, зерновая выщелоченная жидкость, пептон, мясной экстракт, солодовый экстракт, и из таких неорганических источников азота, как нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония. Что касается источников углерода, то они могут использоваться по одному или в сочетании друг с другом. Типичным соответствующим количеством таких веществ может быть интервал от 0,1 до 6 мас. от объема питательной среды.

Соответствующими питательными неорганическими солями являются такие, которые дают микроэлементы, а также и основные заместители солей. Предпочтительно соли должны давать такие ионы, как натрий, калий, аммоний, кальций, магний, железо, фосфат, сульфат, хлорид и карбонат. Могут присутствовать также следы металлов, таких как кобальт, марганец и стронций, или соли, способные давать такие ионы, как бромид, фторид, борат или силикат-ионы.

Следует отметить, что Alteromonas rava встречается в природе в морской воде, так что при отсутствии противоположных показаний условия для развития ее культуры идеально соответствуют морским условиям. Следовательно, следы ионов, найденные в море, оказывают благоприятное воздействие при включении в любую среду, используемую для выращивания Alteromonas.

В том случае, когда микроорганизм ферментируется в виде жидкой культуры, предпочтительным является применение антивспенивающего агента, такого как силиконовое масло или другой соответствующий серфектент.

Предпочтительно, чтобы рН питательной культурной среды для Alteromonas rava вид SANK 73390 при использовании для производства тиомаринола поддерживалось в области рН от 5,0 до 8,0, хотя единственным требованием является, чтобы значение рН не предотвращало рост микроорганизма или не оказывало отрицательного необратимого воздействия на количество конечного продукта. Предпочтительным является добавление избытка кислоты или щелочи для прекращения ферментации.

Alteromonas rava вид SANK 73390 в основном дает рост в температурном интервале от 4 до 32^oC, а хорошо растет при температуре от 17 до 26^oC. Могут применяться и другие температуры, не попадающие в этот интервал, когда образуется вид, который может расти при более низких или более высоких температурах. Для производства тиомаринола предпочтительными температурами является интервал между 20 и 26^oC.

Тиомаринол идеально получается с использованием аэробной культуры и может быть использован любой соответствующий способ аэробного культивирования, такой, например, как твердое культивирование, культивирование с использованием перемешивания или аэрационно-перемешивающее культивирование.

Если культивирование проводится в небольших масштабах, тогда ферментное культивирование с использованием перемешивания проводится предпочтительно в течение нескольких дней при температуре от 20 до 26^oC.

В начале ферментативного культивирования предпочтительно применяют метод исходного посева, приготовленного в один или в два этапа, например, в колбе Эрленмейера. Для культурной питательной среды может быть использована комбинация источника углерода и источника азота. Посевная колба потряхивается в термостатируемом инкубаторе при температуре 23^oC в течение 1-3 дней или до тех пор, пока не будет наблюдаться достаточный рост организмов. Получающаяся посевная культура может быть использована затем для инокуляции вторичной посевной культуры или продуктивной культуры. Если проводится вторичный посев, это осуществляется аналогичным образом и частично используется для инокуляции питательной среды. Колба, в которой осуществляется посев, перемешивается в течение 1-3 дней или до тех пор, пока не достигается максимальная продуктивность перемешивание осуществляется при соответствующей температуре. После завершения культивирования содержимое колбы может быть собрано центрифугированием или фильтрацией.

Если культивирование осуществляется в большом масштабе, предпочтительно используется культура в подходящем аэрационно-перемешивающем ферментере. При использовании этого способа питательная среда может быть приготовлена в ферментере. После стерилизации при 125^oC среда охлаждается и осуществляется посев соответствующим посевным материалом, предварительно выращенным в стерилизованной среде. Культивирование проводится при температуре от 20 до 26^oC при перемешивании и аэрации. Этот способ является подходящим для получения большого количества соединения.

Количество тиомаринола, образованного культивированием, может контролироваться во времени, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией. Обычно количество образованного тиомаринола достигает максимума по истечении времени от 19 до 96 ч.

По достижении соответствующего периода времени тиомаринол может быть выделен и очищен любым известным способом. Например, тиомаринол, остающийся в питательном бульоне, может быть получен, например, отфильтровыванием твердого вещества с использованием диатомита в качестве фильтрующего средства или центрифугированием и последующей экстракцией из верхнего слоя очисткой в соответствии с физико-химическими свойствами тиомаринола. Например, тиомаринол, имеющийся в фильтрате или в всплывающем слое, может быть экстрагирован смешивающимся с водой органическим растворителем таким, как этилацетат, хлороформ, этиленхлорид, метиленхлорид или любой из их смеси в нейтральной или кислой среде очищен.

Или же в качестве адсорбента может быть использован активированный уголь или адсорбирующая смола, такая как Amberlite XAD-2, XAD-4 (Rohm Haas) или Diaion НР-10, НР-20, СЕР-20, НР-50 (Mitsubishi Kesei Corporation). Примеси могут быть удалены после адсорбции пропусканием жидкости, содержащей тиомаринол, через слой адсорбента; или тиомаринол может быть очищен после адсорбции элюированием с подходящим элюентом таким, как водный раствор метанола, водный ацетон или бутанол/вода.

Внутриклеточный тиомаринол может быть очищен экстракцией подходящим растворителем, таким как 50-90%-ный водный ацетон или водный метанол, с последующим удалением органического растворителя, сопровождающего экстракцию, как это описано выше для фильтрата или всплывающего слоя.

Образующийся тиомаринол может быть далее очищен хорошо известными способами, например пропусканием через адсорбционную хроматографическую колонку с использованием носителя такого, как силикагель или магний-силикагель, например, который продается под торговым названием "Florisil", разделительной хроматографией через колонку с использованием в качестве адсорбента такого вещества, как Sephadex ZH-20 (торговое название для фармацевтического продукта); высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием колонки нормальной фазы или обратной фазы. Как известно, такие способы выделения и очистки могут быть проведены каждая в отдельности или в любом сочетании и, если необходимо, повторно для того, чтобы выделить и очистить нужный конечный продукт.

В том случае, когда соединения изобретения используются для терапевтических целей, они могут приниматься сами по себе или в соответствующем фармацевтическом продукте, содержащем помимо активного соединения один или большее число стандартных разбавителей, носителей, наполнителей или вспомогательных веществ. Природа фармацевтической композиции, безусловно, зависит от предполагаемого пути приема. Тем не менее, для орального пути приема соединение предпочтительно готовится в виде порошков, гранул, таблеток, капсул или сиропов. Для парентерального приема предпочтительным является приготовление в виде инъекций (которые могут вводиться внутривенно, внутримышечно или подкожно) или в виде капель или суппозиториев.

Препараты могут быть приготовлены известными способам и с добавлением таких дополнительных компонентов, как наполнители, связующие, дезинтеграторы, смазывающие вещества, стабилизаторы, улучшающих веществ, солюбилизирущих добавок, суспензирующих агентов, или веществ, используемых для покрытий. Хотя дозировка препарата может меняться в зависимости от симптомов и возраста пациента, природы и серьезности инфекции и пути и способа приема, в случае орального приема взрослым человеком соединения изобретения, принимаются обычно в виде дневной дозы от 20 до 2000 мг. Соединения могут приниматься в виде единичной дозы или раздельными дозами, например, два или три раза в день.

Тиомаринол показывает антибактериальный эффект по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям у животных (например, у человека, собак, кошек и кроликов), часто актуальным является его применение обычно в виде крема, мази или геля. Подобные рассмотрения по составлению и приготовлению таких форм приема аналогичны данным выше.

Следующие примеры иллюстрируют получение тиомаринола и его антибактериальную активность, но их не следует рассматривать, как ограничивающие данное изобретение каким-либо образом.

Пример 1. Ферментация тиомаринола в ферментере.

А) Культивирование.

Alteromonas rava штамм SANK 73390 культивировался в течение 3 дней при 22^oC на скошенном морском агаре (продукт Difco). Получающаяся культура суспензировалась в 3 мл искусственной морской воды. 0,1 мл суспензии была взята асептически и инокулировалась в 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл стерилизованной питательной среды [37,4 г морского бульона (продукт Difco) в 1 л деионизованной воды, рН не регулировалась]
Колба термостатировалась при перемешивании в течение 24 часов при 23^oC при 200 об/мин (радиус вращения 70 мм) с использованием ротационного встряхивателя. По прошествии этого времени в каждый из четырех 30-литровых ферментеров, в каждом из которых содержится 15 л стерильной питательной среды, инокулировалось 15 мл культуры, взятой асептически из колбы Эрленмейера. Ферментеры термостатировались при перемешивании (100 об./мин) в течение 23 ч при 23^oC и при скорости аэрации 7,5 л/мин.

В) Выделение.

Через 23 ч содержание ферментеров соединялось с выходом 60 л жидкой культуры. Затем рН жидкости регулировалось до величины 3 добавлением соляной кислоты, затем следовало добавление 60 л ацетона и смесь экстрагировалась в течение 30 мин при перемешивании. Раствор фильтровался с использованием 1,2 кг целитового фильтрующего средства 545 (Торговая марка продукта, получаемого от John Manville Co). Затем 110 л получающегося фильтрата экстрагировались 60 л этилацетата один раз и еще дважды этилацетатом каждый раз по 30 л. Органический слой промывался 30 л 5%-ного водного раствора бикарбоната натрия от объема и последовательно 30 л насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушился над безводным сульфатом натрия и упаривался до сухого состояния при пониженном давлении с образованием 14 г маслянистого вещества.

Полученное маслянистое вещество растворялось в метиленхлориде и раствор подвергался адсорбированию на колонке, заполненной 200 г силикагеля в метиленхлориде. Целевое соединение подвергалось элюированию растворителем повышающейся полярности в следующем порядке: метиленхлорид/этилацетат; этилацетат; этилацетат/метанол. Элюент собирался на фракции в 18 мл и фракции, элюированные смесью этилацетат-метанол, которые содержали тиомаринол, улавливались.

Уловленные фракции конденсировались до сухого состояния выпариванием с получением 7 г маслянистого вещества, которое растворялось в 400 мл 50%-ного объемного количества водного метанола и адсорбировались на 600 мл колонке, заполненной Diaion НР-20 (Торговая марка продукта, получаемого от Mitsulishi Chem. Jnd. ) в воде. После промывания 50%-ным количеством по объему водным раствором метанола, целевое вещество подвергалось элюированию 90%-ным количеством по объему водным метанолом и после конденсирования до сухого состояния при пониженном давлении был получен 1 г желтого порошка. Желтый порошок далее элюировался на хроматографической колонке с использованием Sephadex ZH-20 и проявлялся метиленхлоридом в смеси с этилацетатом и метанолом (19: 19:2 по объему) для сбора активных фракций. Было получено 750 мг тиомаринола в виде желтого порошка.

Получающийся тиомаринол имел приведенные ниже свойства.

1) Природа и внешний вид: желтый порошок
2) Точка плавления: 84-89^oC
3) Молекулярная формула: C₃₀H₄₄N₂O₉S₂
4) Молекулярная масса: 640, определенная по методу "FAB-MS" (масс-спектрометрия методом бомбардировки тяжелыми атомами).

5) Масс-спектрометрия высокого разрешения:
С₃₀H₄₅N₂O₉S₂ [(М+Н)⁺ по методу бомбардировки тяжелыми атомами]
Рассчитано: 641,2567
Найдено: 641,2585
6) Элементарный анализ:
Рассчитано, С 56,23; Н 6,92; N 4,37; S 10,01;
Найдено, С 55,92; Н 6,82; N 4,23; S 9,90.

7) Инфракрасный спектр поглощения: инфракрасный спектр показывает следующие максимумы (по методу KBr диска, n_max см^-1):
3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.

8) Ультрафиолетовый спектр поглощения:
В метаноле или метаноле + HCl тиомаринол имеет ультрафиолетовый спектр поглощения, показанный ниже: [данный как λ_max нм (ε)]
387 (12,000), 300 (3,500), 214 (26,000) а в метаноле + NaOH имеет ультрафиолетовый спектр, показанный ниже: [данный как ]
386 (9,600), 306 (3,200), 206 (25,000).

9) Удельное вращение: (С=1,0 метанол).

10) Высокоэффективная жидкостная хроматография:
Разделительная колонка: Senshu- Pak ODS H-2151. (Размер колонки, 6х150 мм, Продукт Senshu Scientific Co. Ztd.).

Растворитель: 40% по объему ацетонитрил.

Скорость течения: 1,5 мл/мин.

Длина волны: 220-350 нм (определенная рядом фотодиода).

Время удерживания: 5,9 мин.

11) ¹H-спектр ядерного магнитного резонанса: (δ_мил.д.). Спектр ядерного магнитного резонанса (270 МГц) в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилана показан ниже:
0,91 (3Н, дублет, J=6,8 Гц);
0,95 (3Н, дублет, J=5,9 Гц);
1,30 (6Н, уширен, мультиплет);
1,55 (5Н, уширен, мультиплет);
2,03 (3Н, синглет);
2,09 (3Н, мультиплет);
2,34 (2Н, триплет, J=7,3 Гц);
3,3 (1Н, дублет, J=10,7 Гц);
3,52 (2Н, мультиплет);
3,64 (2Н, мультиплет);
3,73 (1Н, двойной дублет);
4,02 (2Н, триплет, J=6.6 Гц);
4,18 (1Н, уширен. дублет, J=7,3 Гц);
4,30 (1Н, дублет, J=4,4 Гц);
4,44 (1Н, дублет, J=7,8 Гц);
4,63 (1Н, дублет, J=3,4 Гц);
4,89 (1Н, дублет, J=7,3 Гц);
5,37 (2Н, мультиплет);
5,97 (1Н, уширен. синглет);
7,04 (1Н, синглет);
9,80 (1Н, уширен. синглет);
10,68 (1Н, уширен. синглет).

12) Спектр ¹³C-ядерного магнитного резонанса;
(δ_мил.д.): спектр ядерного магнитного резонанса (68 МГц) в тетрадейтерированном метаноле с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилана показан ниже:
174,3 (синглет), 170,4 (синглет), 168,6 (синглет),
161,1 (синглет), 137,9 (синглет), 135,7 (дублет),
135,1 (синглет), 129,8 (дублет), 116,3 (дублет),
115,8 (синглет), 113,7 (дублет), 77,6 (дублет),
74,4 (дублет), 72,1 (дублет), 71,8 (дублет),
66,0 (триплет), 65,7 (дублет), 64,9 (триплет),
45,3 (дублет), 43,9 (дублет, 36,6 (триплет),
33,4 (триплет), 30,1 (триплет), 30,0 (триплет),
29,7 (триплет), 27,0 (триплет), 26,7 (триплет),
20,3 (квартет), 16,6 (квартет), 16,3 (квартет).

13) Растворимость:
Растворим в спиртах, таких как метанол, этанол, пропанол и бутанол; и растворим в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, хлороформе, этилацетате, ацетоне и этиловом эфире; нерастворим в гексане и воде.

14) Цветные реакции:
Положительная на серную кислоту, иод и перманганат калия.

15) Тонкослойная хроматография:
Значение Rf: 0,57.

Адсорбирующий агент Силикагель (Merek A Co.In.c. ст. 5715).

Проявляющий растворитель: метиленхлорид метанол 85:15 по объему.

Испытательный пример 1.

Антибактериальная активность тиомаринола.

Была определена минимальная ингибирующая концентрация (МIC) тиомаринола, выраженная в виде мг/мл, против грамположительных и грамотрицательных бактерий по методу разбавления агаровой среды с использованием питательной агаровой среды (Продукт Eiken Chemical Co. Ltd).

Результаты даны в табл. 2.

Испытательный пример 2.

Антимикоплазменная активность тиомаринола.

Используя тот же способ, что и в испытательном примере 1, была испытана активность тиомаринола в противодействии различным штаммам микоплазмы. Результаты даны в табл. 3.

Инокулят: 0,005 мл 10⁵ CFU/мл.

Среда для испытания:
М.Bovis and M. gallisepticum chanock среда [приготовленная как описано в P.N.A.S. 48, 41-49 (1962) и дополненная 20%-ной лошадиной сывороткой]
M. Synovial Frey питательная среда [приготовленная как описано в Am.J. Vet.Res. 29, 2163-2171 (1968) и дополненная 12%-ной свиной сывороткой]
M. hyosinovial. Слизистый секрет РРLO^* агаровой среды (дополненный 15%-ной лошадиной сывороткой).

Условия культивирования: 37^oC, 5 дней, слабая аэрация (метод BBL gas [культивирование в оборудованном генераторе СО₂ frpm Becton Dickinson Microbiology System, Cockeyville, MD 2103 США]
^*PPLO (микроорганизм, подобный плевропневмонийному).

PPLO бульон без CV (Difco) 21 г
Бактериологический слизистый секрет (Difco) 5 г
Дистиллированная вода 800 мл
Агар благородный (Difco) 12 г
Конская сыворотка 150 мл
25%-ный свежий дрожжевой экстракт 50 млм

Формула изобретения

1. Тиомаринол формулы I

обладающий антибактериальными свойствами.

2. Штамм микроорганизма Alteromonas rava SANK 73390 продуцент тиомаринола.

3. Способ получения антибиотика тиомаринола формулы

заключающийся в том, что культивируют штамм Alteromonas rava SANK 73390 и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2