Способ получения дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов

 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности, к способу получения дезоксинуклеозил-51-трифосфатов общей формулы: где B - тимин-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-1-ил или гуанин-1-ил, которые широко используются в молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. С целью увеличения выхода целевого продукта, скорости его образования и снижения себестоимости процесса указанные соединения получают путем реакции соответствующего дезоксинуклеозид-51-монофосфата с активирующим реагентом и взаимодействия полученного активированного производного с три-н-бутил-аммоний пирофосфатом, при этом в качестве активирующего реагента используют сначала трифторуксусный ангидрид с последующим удалением его избытка из реакционной смеси, а затем -N-метилимидазол. Реакцию активирования ведут в апротонном растворителе в присутствии третичного амина. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к способу получения химических веществ, конкретно дезоксинуклеозид-51-трифосфатов (dNTP) общей формулы где M+ катион щелочного металла, B тимин-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-9-ил или гуанин-9-ил.

Указанные соединения являются биологически активными и широко используются в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины.

Известные способы получения dNTP представляют собой многостадийные процессы, ключевой стадией которых является реакция активации фосфатной группы нуклеотида при помощи активирующего реагента, обычно в смеси в амином в органическом растворителе. После удаления избытка активатора из реакционной смеси полученный фосфамид далее обрабатывают неорганическим пирофосфатом и получают dNTP.

Известен способ получения dNTR [1] состоящий в активировании нуклеотида путем взаимодействия его с дициклогексилкарбодиимидом (ДЦК) и морфолином в водном третбутаноле при нагревании в течение 2 4 ч с последующим разложением ДЦК водой, экстракцией его эфиром и обработкой полученного морфолида нуклеотида раствором пирофосфата в диметилсульфоксиде в течение 2 4 сут. при комнатной температуре. Выход dNTP составляет 73-80% длительность процесса - 2-4 сут.

Недостатками известного способа являются низкая скорость и высокая трудоемкость процесса.

Известен способ получения dNTP [2] заключающийся в активировании нуклеотидов 1,1'-карбонилдиимидазолом в диметилформамиде при комнатной температуре в течение 4 ч, с последующим метанолизом избытка активатора и обработкой пирофосфатом в течение 1 дн. Выход dEIP 45-60% длительность процесса 28 ч.

Недостатками способа являются невысокий выход продукта и низкая скорость процесса.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения dNTP [3] состоящий из двух последовательных стадий: реакция активирования нуклеотида при помощи пары трифенилфосфиндипиридилдисульфид (TPP-DPDS) и 4-(N,N-диметил)аминопиридина (DMAP) в диметилсульфоксиде-этаноле в течение 20 мин при комнатной температуре; добавление к полученному DMAP-производному нуклеотида раствора пирофосфата в спирте, удаление последнего в вакууме и выдерживание реакционной смеси в течение 45-60 мин при комнатной температуре.

Выход продукта составляет 40-65% длительность процесса 65-80 мин.

Существенными недостатками известного способа являются: недостаточно высокий выход целевого продукта; относительно низкая скорость процесса; высокая стоимость активирующего реагента TPP-DPDS и DMAP.

Задачей настоящего изобретения является увеличение выхода целевого продукта, скорости его образования и снижение его себестоимости.

Задача достигается тем, что соответствующий дезоксинуклеозид-51-монофосфат подвергают реакции с активирующим реагентом в органическом растворителе с последующим взаимодействием полученного активированного производного с три-н-бутиламмоний пирофосфатом и выделением целевого продукта в виде гидрата соли щелочного металла, при этом в качестве активирующего реагента используют трифторуксусный ангидрид (ТФА) с последующим удалением его избытка из реакционной смеси, а затем N-метилимидазол, а в качестве органического растворителя используют апротонный растворитель в присутствии третичного амина.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: Нуклеотид суспендируют в апротонном растворителе, выбранном предпочтительно из группы: ацетонитрил, N,N-диметилформамид (ДМФ), хлороформ в присутствии третичного амина (триэтиламин, N,N-диметиланилин, пиридин) и добавляют раствор ТФА в том же растворителе при перемешивании и охлаждении. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре до растворения нуклеотида, удаляют избыток ТФА в вакууме, добавляют N-метилимидазол и третичный амин и далее полученное активированное производное обрабатывают раствором три-н-бутиламмоний пирофосфата в апротонном растворителе и выделяют продукт известными методами (схема).



а) B=BTfa тимин-1-ил;
б) B=цитозин-1-ил, BTfa=N4-трифторацетилцитозин-1-ил;
в) B=аденин-9-ил, BTfa=N6-трифторацетиладенин-9-ил;
г) B=гуанин-9-ил, BTfa N2-трифторацетилгуанин-9-ил;
R3N (C2H5)3N; .

Выход целевого продукта (IV а-г) составляет 87 92% длительность процесса 25 30 мин.

Отличительными признаками заявляемого способа являются:
Активирование нуклеотида при помощи трифторуксусного ангидрида с последующим удалением его из реакционной смеси и обработкой полученного смешанного ангидрида (II а-г) N-метилимидазолом. Это позволяет увеличить скорость реакции пирофосфорилирования за счет большей реакционной способности метилимидазолида (III а-г) по сравнению с DMAP-производным нуклеотида в прототипе. Применение ТФА, более дешевого чем пара TPP-DPDS, позволяет снизить стоимость целевых dNTP, а также упростить его удаление из реакционной смеси (ТФА легко улетает при выдерживании в вакууме, т.кип. 38oC). Способность ТФА временно блокировать OH- и NH2-группы нуклеотида позволяет ускорить реакцию активирования за счет увеличения растворимости трифторацетильного производного нуклеотида в органическом растворителе.

Реакцию активирования проводят в апротонном растворителе в присутствии третичного амина, что обеспечивает стабильность лабильных реагентов ТФА и ангидрида (II а-г), а также исключает закисление среды ионами водорода, выделяющимися в процессе реакции.

В известных научно-технических и патентных источниках сведений с применением ТФА в сочетании с N-метилимидазолом для получения dNTP заявителем не обнаружено.

Пример 1. Тимидин-51-трифосфат (IVа).

К суспензии тимидин-51-фосфорной кислоты (0,322 г, 1 ммоль) в ацетонитриле (2 мл) добавляют триэтиламин (0,7 мл, 5 ммоль) и при охлаждении в водяной бане (155oC) и перемешивали раствор ТФА (0,7 мл, 5 ммоль) в 1 мл ацетонитрила в течение 1 2 мин. Смесь перемешивают до растворения нуклеотида при комнатной температуре в течение 5 10 мин и выдерживают в вакууме 5 10 мин для удаления избытка ТФА. Остаток обрабатывают N-метилимидазолом (0,24 мл, 3 ммоль) и триэтиламином (0,28 мл, 2 мл), выдерживают 2 5 мин и добавляют 1 M раствор ди(три-н-бутил)аммоний пирофосфата в ацетонитриле (4 мл, 4 ммоль). Через 5 мин смесь обрабатывают 25% NH4OH (1 мл) и 70% водным метанолом (4 мл). Осадок аммоний пирофосфата отфильтровывают, промывают 70% водным метанолом (3х3 мл), фильтрат упаривают в вакууме и продукт выделяют ионообменной хроматографией (колонка 1,1 х 10 см, DEAE-сефадекс A-25 в HCO-3-форме, элюент 0,1 0,6 M NH4HCO3). Осаждение продукта раствором NaClO4 в ацетоне дает 0,57 г (92%) Na4 соли тригидрата трифосфата (IVа). 1H-ЯМР-спектр (прибор WP-200, частота 200,13 Мгц, D2O, 30oC, внешний стандарт TMS, , м.д.):7,51c(1, H6); 6,11т(1, H1I); 4,44 м (1, Н3I); 3,70 м (3, H4I5I5II); 2, 15 м (2, H2I2II); 1,69c(3,CH3). 31P-ЯМР-спектр (прибор AC-200, частота 81,015 Мгц, DMF, 25oC, внешний стандарт 85% H3PO4, d, м.д.): -6,33 д (1, P; -10,80 д (1, P; -21,66 т (1,P). УФ-спектр (вода, pH 7,5): lmax267 нм (9600); отношения A250/A260 0,642; A280/A260 0,782; A290/A260 0,283. Данные анализа MKX (Polisil CA, 5 мм, 0 0,3 M K-фосфат, pH 7,5, 30% CH3CN): dTTP 96,6% моно-, ди- и полифосфаты - 0,18% 2,3% 0,92% соответственно.

Пример 2. Дезоксицитидин-51-трифосфат (IYб).

К суспензии дезоксицитидин-51-фосфорной кислоты (0,307 г, 1 ммоль) в диметилформамиде (2 мл) добавляют пиридин (0,48 мл, 6 ммоль) и далее обрабатывают ТФА как описано в примере 1. После удаления ТФА смесь обрабатывают N-метилимидазолом (0,24 мл, 3 ммоль) и триэтиламином (0,84 мл, 6 ммоль), выдерживают 2-5 мин и добавляют 1 М раствор ди(три-н-бутил)аммоний пирофосфата в ацетонитриле (4 мл, 4 ммоль). Продукт далее выделяют как описано в примере 1, получая 0,55 г (90%) Na4-соли тригидрата трифосфата (IYб) 1H-ЯМР-спектр (в условиях примера 1): 7,74д(1,H6); 6,07т(1, H11); 5,91д (1,H5); 4,37м(1, H31); 3,97м(3, H4151511); 2,14м(2, H21211). УФ-спектр (H2O, pH 7,5): max 272нм(9100), А250/A2600,857; A280/A2601,058; A290/A260 0,428. МКХ-анализ (в условиях примера 1): dCTP 95,1% моно-, ди- и тетрафосфаты 1,6% 2,5% и 0,8% соответственно.

Пример 3. Дезоксиаденозин-51-трифосфат (IYв).

К суспензии дезоксиаденозин-51-фосфорной кислоты (0,331г, 1 ммоль) в ацетонитриле (3,5 мл) добавляют триэтиламин (0,28 мл, 2 ммоль), диметиланилин 0,51 мл, 4 ммоль) и при перемешивании и охлаждении до 2-5oC в течение 5 мин добавляют раствор ТФА (0,7 мл, 5 ммоль) в ацетонитриле (1,5 мл). Смесь перемешивают до растворения осадка в течение 5-10 мин при комнатной температуре и далее синтез проводят как описано в примере 1. Получают 0,56г (88%) Na4-соли тригидрата dATP (IYв). 1H-ЯМР-спектр (в условиях примера 1): 8,15с(1, H8); 7,82с(1, H2); 6,15т(1, H11); 4,52м(1,H31; 4,01м(3,H4151511); 2,51м(1, H21); 2,39м(1, H211). УФ-спектр (H2O, pH 7,5): max 260нм(15400), A250/A260 0,778; A280/A260 0,187; A290/A260 0,009. МКХ-анализ (см. пример 1): dATP 95,2% моно-, ди- и тетрафосфаты 3,2% 0,8% и 0,4% соответственно.

Пример 4. Дезоксигуанозин-51-трифосфат (IYг).

К суспензии дитриэтиламмониевой соли дезоксигуанозин-51-фосфата (0,55г, 1 ммоль) в ацетонитриле (3,5 мл) добавляют триэтилами (0,28 мл, 2 ммоль) и N, N-диметиланилин (0,51 мл, 4 ммоль) и далее обрабатывают как описано в примере 3. Получают 0,56 г (87%) Na4-соли тригидрата dGTP (IYг). 1H-ЯМР-спектр (в условиях примера 1). 7,82с(1,H8); 5,99т(1,H11); 4,52м(1,H31); 3,99м(3, H4151511); 2,46м(1,H21); 2,30м(1,H211). УФ-спектр (H2O): max 252 нм(13700); A250/A260 1,122; A280/A260 0,654; A290/A260 0,302. МКХ-аналих (в условиях примера 1): dGTP 95,0% моно-, ди- и тетрафосфаты 1,1% 3,1% и 0,8% соответственно.

Для получения любой соли dNTP достаточно воспользоваться известными методами ионообменной хроматографии, например, хроматографией на катионообменных смолах типа Dawex 50wx2 или КРС.

Пример 5.

Синтез тимидин-51-трифосфата ведут аналогично описанному в примере 1. После выделения инообменной хроматографией раствор аммониевой соли в воде (5 мл) наносят на колонку, содержащую 10 мл смолы Dawex 50Wx2 (Li+), после элюции продукта водой и лиофилизации водного раствора получают 0,51 г (95%) дигидрата тетралитиевой соли тимидин-51-трифосфата.

Аналогично получают с любым катионом, в том числе в виде алкиламмониевой соли и т.д.

Использование предлагаемого способа получения dNTP обеспечивает следующие преимущества:
увеличение выхода целевого продукта до 97-92%
снижение времени проведения процесса до 30 мин;
снижение стоимости активирующего реагента в 15 раз (1 моль пары трифенилфосфин-дипиридилдисульфид стоит 730 $, а 1 моль ТФА 48 $).


Формула изобретения

1. Способ получения дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов общей формулы

где М+ катион щелочного металла, В тимин-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-9-ил или гуанин-9-ил,
включающий реакцию соответствующего дезоксинуклеозид-5'-монофосфата с активирующим реагентом в органическом растворителе с последующим взаимодействием полученного активированного производного с три-н-бутиламмоний пирофосфатом и выделением продукта в виде гидратов щелочных металлов, отличающийся тем, что в качестве активирующего реагента используют трифторуксусный ангидрид с последующим удалением его избытка из реакционной смеси, а затем N-метилмидазол, при этом в качестве органического растворителя используют апротонный растворитель в присутствии третичного амина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве апротонного растворителя используют ацетонитрил, N,N-диметилформамид или хлороформ.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве третичного амина используют триэтиламин, N,N-диметиланилин или пиридин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к новым химическим соединениям трилитиевым солям (1 R,5 R)-3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6- оксо- пуринил-9)-аза-3 дезокси-3 -(азидонафталин-1-суфамидо)гексопиранозил-6 -трифос- фатов общей формулы HO где R1 N3 и R2 Н (I) или R1 Н и R2 N3 (II), как специфическим фотоактивируемым необратимым ингибиторам РНК-полимеразы

Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности, к получению -дезоксирибонуклеозид-5 -0-(1-тио)трифосфатов общей формулы 0е -Р(ОХОв)-0-Р-(ОХОе)-0Р (5ХОе)-0-СН2-СН-0-СНВ-СНг-СН(рН)

Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности к получению 2 -дезоксирибонуклеозид-5-0-(1-тио)трифосфатов общей формулы Ое-Р(0)(Ое)-0-Р(0)(Ое)-0P (SXO 0-CH2-CH-0-CHB-CH2-CH 9H, где В-аденин-9-ил или тимин-1-ил, используемых в генетической инженерии и молекулярной биологии

Изобретение относится к нуклеозидам, в частности к получению смеси рибонуклеозид-2<SP POS="POST">1</SP>, и 3<SP POS="POST">1</SP>-монофосфатов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине и фармацевтике

Изобретение относится к химии нуклеотидов, в частности к N-незащищенному 51-0- диметокситритилдезоксинуклеоэид-3 -Н-фосфонату ф-лы где В - аденозин, гуанозин или цитидин, который используют в качестве мономера в синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к усовершенствованию способа получения п-хлорфениловых эфиров, N, 3'-0-дианцилдезоксинуклеотидов общей формулы 1 HO где B - защищенные по экзоциклическим аминогруппам гетероциклические основания - тимин, аденин, гуанин, цитозин; R - ацильный остаток

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано в биохимической промышленности для производства рибои дезоксирибонуклеозид-5<SP POS="POST">1</SP>-трифосфатов
Наверх