Способ твердофазного люминесцентного иммуноанализа компонентов биологических жидкостей

 

Использование: в медицине, иммунологии, микробиологии, биохимии, в частности определение компонентов биологических жидкостей.

Сущность изобретения: иммобилизованные на внутренней стенке капилляра в виде нескольких реактивных зон иммуносорбенты, исследуемый образец и реагенты взаимодействуют между собой, при этом при облучении капиллярной трубки источником излучения возникает сигнал люминесценции, интенсивность которого пропорциональна количеству определяемого компонента. После связывания компонентов биологической жидкости с иммуносорбентами в капиллярную трубку вводят антитела, связанные с биотином, а в качестве люминесцентного реагента используют Pt или Pd комплекс порфирина с авидином или стрептоавидином, при этом измеряют замедленную люминесценцию реактивных зон капиллярной трубки с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции.

Способ позволяет увеличить полезный сигнал люминесценции, повышает достоверность результатов анализа. 1 табл.

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к способам определения компонентов биологических жидкостей и может быть использовано в медицине, микробиологии, биохимии.

Известен иммуноферментный способ определения множества компонентов биологических жидкостей с использованием капиллярной трубки (пат. США N 4690907, МКИ 436-514). Сущность способа заключается в том, что в капиллярной трубке создают несколько реактивных зон-сегментов твердофазного носителя (пористой матрицы), на которых иммобилизованы различные антигены или антитела, способные связываться в иммунный комплекс с антителами или антигенами, присутствующими в контролируемой жидкости. Пористая матрица может быть выполнена в виде зерен, частичек волокон и т.п. Реактивные зоны разделены пористыми нереактивными зонами, при этом первый и последний сегменты выполнены также нереактивными и играют роль уплотнителей. Образец исследуемой жидкости и флуорогенный субстрат подаются в капиллярную трубку под действием капиллярных сил, и при наличии в исследуемой жидкости искомых компонентов образуется иммунный комплекс, при этом каждая реактивная зона окрашивается в определенный цвет.

Длительность подготовки пористых носителей к анализу, необходимость соблюдения определенных условий для хранения их приводят к усложнению способа. В связи с тем, что иммуноферментная реакция происходит в жидкости, при работе с капиллярами, заполненными пористым носителем, необходимо соблюдать осторожность, т.к. встряхивание приводит к миграции вещества с одного сегмента на другой, смешению цветов, что снижает достоверность результатов анализа, а использование в качестве флуоресцентной метки флуоресцеин изотиоцианата позволяет измерять только короткоживущую флуоресценцию; при этом уменьшается чувствительность измерений из-за наличия фоновой люминесценции гетерологичных примесей.

Известен способ одновременного анализа нескольких аналитов в потоке жидкого образца с использованием капиллярной трубки, заполненной серией реактивных сегментов, каждый из которых имеет антигены или антитела, иммобилизованные на его поверхности (заявка PCT N 89/00290, кл. G 01 N 33/543). Реактивные сегменты разделены водонерастворимыми нереактивными сегментами. При осуществлении способа капиллярную трубку с помощью шприца, присоединенного у одному из ее концов, наполняют исследуемым образцом, после отмывки наполняют вторичным иммунореагентом, способным реагировать с одним из компонентов комплекса, образовавшегося на поверхности твердофазного носителя (реактивного сегмента), удаляют несвязавшийся вторичный иммунореагент из капиллярной трубки. После осуществления иммунологической реакции связавшийся с твердофазным носителем компонент исследуемой биологической жидкости детектируют облучением капилляра и измерением люминесценции (флуоресценции) от каждого сегмента отдельно. Качественный анализ осуществляют визуально, количественный с использованием измерительной аппаратуры. Из-за большой внутренней поверхности в капиллярной трубке по отношению к объему и за счет малых расстояний происходит быстрое молекулярное взаимодействие аналита и реагента, что приводит к ускорению способа и уменьшению объема реагентов и аналита, требуемых для исследования. Способ позволяет использовать множество субстратов для определения множества компонентов биологических жидкостей.

Однако, использование субстратных смесей, содержащих ферментные метки, требует разделения реактивных сегментов нереактивными, осторожной работы с капиллярной трубкой (без встряхивания), чтобы предотвратить перетекание продуктов реакции с одного реактивного сегмента на другой. Несоблюдение этих условий приводит к недостоверности результатов анализа, а введение нереактивных сегментов к увеличению габаритов капиллярной трубки и усложнению способа.

Известен способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа биологических жидкостей (авт.св. СССР N 1679382, кл. G 01 N 33/533). Сущность способа заключается в том, что для анализа пробы, содержащей два аналита одновременно, используется комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум антигенам. Антигены связывают с антителами, сенсибилизированными на твердом носителе, отмывают для удаления непрореагировавших компонентов и вносят смесь двух антител, меченных двумя разными металлопорфиринами (комбинированный иммуносорбент). Интенсивность фосфоресценции каждого металлопорфирина (определение антигенов) измеряют путем последовательной смены длин волн возбуждения и/или регистрации.

Недостатком способа является заметное перекрытие спектральных характеристик металлопорфиринов, которое удается снять лишь частично за счет различного временного режима регистрации, что затрудняет выделение одного антигена в присутствии другого. Кроме того, для определения каждого антигена используется определенный металлопорфирин, что не дает возможности определять несколько компонентов пробы одновременно.

Наиболее близким является способ множественного иммуноферментного анализа (пат США N 4806313, кл. МКИ 422-61). Сущность способа заключается в том, что на внутреннюю поверхность капилляра наносят несколько зон различных антигенов или антител. После отмывки для лучшего связывания с иммуносорбентами исследуемый образец биологической жидкости пропускают через капилляр несколько раз с использованием попеременного воздействия вакуума-давления. Затем пропускают промывочную жидкость для удаления несвязавшегося образца и после этого через капилляр пропускают флуорогенный субстрат. В способе используются ферментные метки, меченные различными флуоресцентными веществами. Подача исследуемого образца, конъюгата, флуорогенного субстрата и промывочной жидкости осуществляется циклически, несколько раз для лучшего использования небольшого количества реагентов образца. Использование капиллярной трубки в качестве твердофазного носителя позволяет использовать максимальное количество аналита, т.к. расстояние молекулярной диффузии мало. В качестве связывающих реагентов используют моно- и поликлональные антитела.

Однако, не все ферментные метки, используемые при осуществлении способа, устойчивы к длительному хранению, что усложняет способ из-за необходимости следить за их состоянием.

Кроме того, при анализе гетерологичных систем и наличии флуоресцирующих примесей уменьшается соотношение сигнал/шум, что снижает чувствительность способа, а из-за того, что иммуноферментная реакция осуществляется в жидкости, существует угроза размывания реактивных зон, что приводит к недостоверности результатов анализа, а быстродействие способа ограничено необходимостью времени наработки из-за использования ферментной метки.

Решаемой задачей является создание способа твердофазного люминесцентного иммуноанализа малых количеств сложных (многокомпонентных) биологических жидкостей, в котором в качестве твердой фазы используется внутренняя поверхность капиллярной трубки, на которой иммобилизованы антитела в виде реактивных зон. При этом необходимо добиться увеличения полезного сигнала за счет увеличения соотношения сигнал/шум и повышения достоверности результатов анализа.

Предлагается изобретение, решающее указанную задачу и устраняющее недостатки прототипа.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе твердофазного люминесцентного иммуноанализа множества компонентов биологической жидкости, включающем взаимодействие иммобилизованных на внутренней стенке капиллярной трубки в виде нескольких реактивных зон иммуносорбентов, исследуемого образца и реагента, определение наличия искомых компонентов биологической жидкости по световому сигналу от зон, возникающему при облучении капиллярной трубки источником излучения, после связывания компонентов исследуемой биологической жидкости с иммуносорбентами реактивных зон в капиллярную трубку вводят антитела, ковалентно связанные с биотином, а в качестве люминесцентного реагента используют Pt или Pd комплекс копропорфирина с авидином или стрептоавидином и измеряют замедленную люминесценцию реактивных зон капиллярной трубки с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции.

Изобретение является новым, т.к. использование в качестве реагентов антител, меченных биотином, и Pt или Pd копропорфирина с авидином или стрептоавидином позволяет иммунный анализ на поверхности твердофазного носителя, что исключает размывание реактивных зон, перетекание реагентов с одной зоны на другую, что в свою очередь, повышает достоверность анализа. Измерение замедленной люминесценции реактивных зон с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции позволяет увеличить отношение сигнал/шум за счет исключения флуоресценции гетерологичных примесей и измерительного оборудования, что приводит к повышению чувствительности анализа. Кроме того, использование одного универсального люминесцентного реагента для определения множества компонентов биологической жидкости, отсутствие необходимости хранения ферментных меток упрощают и удешевляют способ.

Изобретение имеет изобретательский уровень, т.к. авторам не известен люминесцентный способ одновременного определения множества компонентов биологической жидкости с заявляемой совокупностью признаков.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый образец с помощью перистальтического насоса со скоростью подачи 0,5-1 мл/мин пропускают через капиллярную трубку. Для лучшего связывания небольшого количества компонентов исследуемого образца с антителами, иммобилизованными на стенках капиллярной трубки, образец прокачивают через капиллярную трубку несколько раз. Отмывают капиллярную трубку для удаления несвязавшегося образца, пропуская через капиллярную трубку буфер анализа (изотоничный раствор 0,85% NaCl, бычий сывороточный альбумин (БСА) 1% и 0,1М карбонат бикарбонатный буфер (pH 7,4) и сульфит натрия в концентрации 2 мг/мл). Пропускают через капиллярную трубку несколько раз раствор антител, меченных биотином, отмывают трубку для удаления несвязавшихся антител, затем пропускают люминесцентный реагент Pt или Pd комплекс порфирина в авидином или стрептоавидином, отмывают от избытка несвязавшегося люминесцентного реагента буфером анализа, облучают стенки капиллярной трубки источником излучения и измеряют длительную люминесценцию прореагировавших зон с задержкой во времени между актами возбуждения и измерения люминесценции. О количестве искомых компонентов биологической жидкости судят по интенсивности люминесценции реактивных зон.

Пример 1. Приготовление капиллярной трубки для анализа.

Для приготовления капиллярной трубки с реактивными зонами сенсибилизированных на ее внутренней поверхности антител используют поликлональные кроличьи антитела и/или моноклональные мышиные антитела к различным возбудителям заболеваний: сыпного тифа (R. Prowazekii), туляремии (Fr. tularensis), бруцелеза (Br. abortus), вируса венесуэльского энцефаломиэлита лошадей (ВЭЛ-V. equins encephalitis) и осповакцины (Vaccinia virus).

Капиллярную трубку составляют из фрагментов капилляров, на внутренних стенках которых сенсибилизированы определенные антитела. Фрагмент капилляра из полистирола длиной 10 мм и внутренним диаметром 1 мм заполняют раствором одного из антител в концентрации 20 мкг/мл и оставляют на сенсибилизацию в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого капилляр промывают буфером анализа в объеме не менее десяти объемов капилляра и заполняют блокировочным раствором, содержащим изотонический раствор NaCl (0,85%) в 0,1М карбонат бикарбонатном буфере с 1% БСА ("Serva" ФРГ). Блокировочным раствором также заполняют контрольный фрагмент капилляра, свободный от антител. После двухчасовой инкубации при температуре 37^oC капилляры промывают дистиллированной водой, объемом, превышающим объем капилляра в пять раз, и подсушивают при комнатной температуре в течение двух часов. После этого отдельные фрагменты капилляров, сенсибилизированные антителами к различным возбудителям заболеваний, и контрольный фрагмент капилляра объединяют в единую капиллярную трубку с помощью хлорвиниловых трубчатых сегментов. Подготовленные таким образом капиллярные трубки хранят в холодильнике при температуре 2-8^oC в полиэтиленовой упаковке до шести месяцев.

Пример 2. Определение R. Prowazekii, Fr. tularensis и Br.abortus методом люминесцентного иммуноанализа.

В капиллярную трубку, сенсибилизированную антителами к возбудителям R. Prowazekii, Fr. tularensis, Br. abortus, Vaccinia virus и V. equins encephalitis вносят пробу мочи человека, содержащую 3·10⁴ микробных тел в 1 мл R. Prowazekii, 3·10⁴м. т./мл Fr. tularensis и 3·10⁴ м.т./мл Br. abortus. Пробу готовят из коммерческих препаратов: диагностикума туляремийного жидкого для объемной кровяно-капельной реакции агглютинации ВФС-42-63 (предприятие по производству бакпрепаратов, г.Одесса), диагностикума риккетсий Провачека корпускулярный сухой для реакции агглютинации ФС-42-5 (производство НИИЭМ им. Гамалеи, г.Москва), вакцины бруцеллезной сухой ВФС-42-111 (производство Омского НИИ ВС).

Пробу объемом 1 мл прокачивают со скоростью 0,5 мл/мин через капиллярную трубку с помощью перистальтического насоса по замкнутому контуру в течение 15 мин. Затем вносят в трубку смесь из коньюгатов биотина (коммерческий препарат) с моно- и поликлональными антителами к возбудителям R. Prowazekii, Fr. tularensis и Br. abortus. Коньюгаты биотина с антителами готовят в соответствии с методикой, описанной в J. Immunological methods, 1992, v.140, p.247-253 и вносят в смеси в концентрации 0,5 мкг/мл каждый.

После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре несвязавшуюся смесь коньюгатов удаляют промывкой буфером анализа в объеме, эквивалентном пяти объемам капиллярной трубки, а затем в концентрации 0,1 мкг/мл вносят раствор люминесцентного метчика коньюгата Pt копропорфирина тетракислоты с авидином (ТУ 64-16-57-90).

Коньюгаты Pt копропорфирина с авидином предварительно готовят по методике получения коньюгатов копропорфирина с белками с помощью карбодиимидов (см. ЕР N 0071991 и N 0127797) и хранят в виде водного раствора с 50% глицерина в концентрации 100 мкг/мл. Раствор люминесцентного метчика инкубируют в капиллярной трубке в течение 15 мин и удаляют промывкой буфером анализа в объеме, равном десятикратному объему капиллярной трубки.

После окончания реакции капиллярную трубку помещают в регистратор длительной люминесценции (Arcus 1232, Финляндия или ИФИ-01, ГосНИИ БП), облучают светом с длиной волны в максимуме поглощения Pt копропорфирина (381 нм) и регистрируют уровень длительной люминесценции на длине волны 645 нм. При этом возбуждение и регистрацию люминесценции осуществляют в стробоскопическом режиме с разнесением во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции 50 мкс и длительностью строба 100 мкс. Фиксируют уровень сигнала в каждой из пяти зон.

Результаты измерений приведены в таблице.

Пример 3. Определение V. equin encephalitis и Vaccinia virus.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины (V. Vaccinia) в концентрации 10⁴ 00Е/мл (оспо-образующих единиц) и вируса венесуэльского энцефалита (V. equin encephalitis) в концентрации, эквивалентной 2·10⁴ БОЕ/мл (бляшко-образующихся единиц). Для приготовления анализируемой пробы используют диагностикум ВЭЛ культурный концентрированный сухой для РТТА (производство Свердловского НИИ ВС).

Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2. Данные эксперимента приведены в таблице.

Пример 4. Определение Vaccinia virus и Fr. tularensis.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины в концентрации 10⁵ 00Е/мл и возбудитель туляремии в концентрации 3·10⁵ м.т./мл.

Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2. Данные эксперимента приведены в таблице.

Пример 5. Определение Vaccinia virus и Fr. tularensis.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины в концентрации 10⁶ 00Е/мл, и возбудитель туляремии в концентрации 3·10⁶ м.т./мл.

Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2. Данные эксперимента приведены в таблице.

Пример 6. Определение Vaccinia virus и Fr. tularensis.

В капиллярную трубку, приготовленную в соответствии с примером 1, вносят анализируемую пробу мочи человека, содержащую вирус осповакцины в концентрации 10⁵ 00Е/мл, и возбудитель туляремии в концентрации 3·10⁵ м.т./мл. Эксперимент проводят так же, как описано в примере 2, только в качестве люминесцентного метчика используют коньюгат Pt копропорфирина со стрептоавидином в той же концентрации, что и в примере 2, приготовленный по той же методике.

Результаты анализа приведены в таблице.

Пример 7. Определение Fr. tularensis и Vaccinia virus.

Эксперимент проводят так же, как описано в примерах 2, 6, только в качестве люминесцентного метчика используют конъюгат Pd копропорфирина со стрептоавидином в той же концентрации и приготовленный по аналогичной методике. При этом длительную люминесценцию измеряют на длине волны 665 нм при возбуждении на длине волны 392 нм с задержкой во времени 300 мкс и длительностью строба 600 мкс.

Результаты измерений сведены в таблице.

Пример 8. Определение Vaccinia Virus и Fr. tularensis.

Эксперимент проводят аналогично примерам 2, 7, только в качестве люминесцентной метки используют конъюгат Pd копропорфирина с авидином в той же концентрации, приготовленный по аналогичной методике.

Результаты измерений приведены в таблице.

Пример 9. Определение Fr. tularensis и R. Prowazekii.

Эксперимент осуществляют так же, как описано в примере 2, только в качестве исследуемого образца используют пробу сыворотки крови человека, содержащую бактериальные и риккетсиозные антигены.

Результаты экспериментов приведены в таблице.

Как видно из примера 2 (столбец 3 табл.) в пробах, содержащих возбудители Fr. tularensis, Br. abortus и R. Prowazekii, уровень сигнала реакционных зон, сенсибилизированных к присутствующим в пробе возбудителям, превышает уровень сигнала контрольной зоны (пороговый сигнал от фрагмента капилляра, не содержащего специфических антител, увеличенный на 6σ, в то время как уровень сигнала от реакционных зон, сенсибилизированных к другим возбудителям, отсутствующим в пробе (вирус осповакцины, ВЭЛ), не превышает уровень сигнала контрольной зоны.

Аналогичные выводы можно сделать из примера 3 (столбец 4 табл.) Из примеров 2, 4, 5 (столбцы 4, 5, 6 табл.) видно, что повышение концентрации искомых антигенов в пробе в 10 и 100 раз (примеры 4 и 5 соответственно) приводит к эквивалентному увеличению сигнала от реакционных зон.

Аналогичные результаты получены при использовании конъюгатов Pt копропорфирина со стрептоавидином (примеры 6, 7, 8 столбцы 7, 8, 9 табл.) и Pd копропорфирина с авидином и стрептоавидином (пример 9 столбец 10 табл.) Предлагаемый способ, в котором в качестве первого реагента использованы антитела, меченные биотином, а в качестве второго реагента конъюгаты Pt или Pd копропорфирина с авидином или стрептоавидином, позволяющие разнести во времени акты возбуждения и регистрации люминесценции, обеспечивает одновременное определение различных компонентов биологических жидкостей при уменьшении влияния фоновой люминесценции измерительного оборудования и примесей на величину полезного сигнала, что позволяет получить высокий уровень чувствительности, достоверности анализа и широкий динамический диапазон анализируемых концентраций.

Для проведения анализа используется стандартное оборудование и химические вещества, выпускаемые отечественной промышленностью.

Способ может быть использован при медицинских, ветеринарных и других клинических анализах образцов биологических жидкостей, при поиске возбудителей вирусной, бактериальной и риккетсиозной природы и других белковых веществ в пробах, отобранных из внешних источников.

Формула изобретения

Способ твердофазного люминесцентного иммуноанализа компонентов биологических жидкостей, включающий взаимодействие иммобилизованных на внутренней стенке капиллярной трубки в виде нескольких реактивных зон иммуносорбентов, исследуемого образца и реагентов, определение наличия искомых компонентов биологической жидкости по световому сигналу от реактивных зон, возникающему при облучении капиллярной трубки источником излучения, отличающийся тем, что после связывания компонентов биологической жидкости с иммуносорбентами реактивных зон в капиллярную трубку вводят антитела, ковалентно связанные с биотипом, а в качестве люминесцентного реагента используют Pt- или Pd-комплекс копропорфирина с авидином или стрептоавидином и изменяют замедленную люминесценцию реактивных зон капиллярной трубки с задержкой во времени между актами возбуждения и регистрации люминесценции.

РИСУНКИ

Рисунок 1