Способ получения мурамилпептидов
Изобретение касается усовершенствованного способа получения мурамилпептидов (собственно мурамилпептидов и глюкозаминилмурамилпептидов). Способ включает получение активированного эфира незащищенной N-ацетилмурамовой кислоты или N-ацетилглюкозанимил (
1-4) N-ацетилмурамовой кислоты, его конденсацию с незащищенной аминокислотой, пептидами или их солями в пиридине, его гомологах или смесях с органическими растворителями и выделение с использованием хроматографии. Способ позволяет получать с высоким выходом чистые мурамилпептиды с использованием малостадийных схем синтеза. 3 ил.
Изобретение относится к области синтеза физиологически активных пептидов, конкретно к усовершенствованному способу получения мурамилпептидов общей формулы I: 
где R-водород или 
А остаток аминокислоты или пептида.
1 4) N-ацетилмурамилдипептид (ГМДП) [2,3] В основе всех известных на сегодняшний день способов получения мурамилпептидов лежит конденсация защищенного или незащищенного производного N-ацетилмурамовой кислоты с активированной карбоксильной группой с защищенным пептидом или аминокислотой, с последующим удалением защитных групп [3-7] Недостатком этих способов является наличие стадии деблокирования защищенного мурамилпептида каталитическим гидрированием, а также проведение конденсации активированных эфиров N-ацетилмурамовой кислоты с пептидами в таких растворителях, как ДМФА или смеси ДМФА с ацетонитрилом, которые способствуют рацемизации. Известен способ получения н-бутилового эфира N-ацетилглюкозаминил /b1-4/-N-ацетилмурамилдипептида конденсацией н-бутилового эфира дипептида с пентафторфениловым эфиром N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты в ДМФА [8] однако этот способ не может быть использован для получения мурамилпептидов с незащищенной карбоксильной группой, вследствие крайне низкой растворимости незащищенных пептидов и аминокислот, а также их солей в ДМФА и возможности протекания при синтезе реакций О-ацилирования [9] эпимеризации [10] переэтерификации [11] Протекание вышеуказанных реакций препятствует получению мурамилпептидов, не содержащих микропримесей, близких по хроматографическому поведению к целевому веществу, отделение которых обычными методами затруднено. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения гликопептидов конденсацией активированного по карбоксильной группе производного N-ацетилмурамовой кислоты реагентом Вудворда К. с защищенным дипептидом в ДМФА в присутствии органического основания с последующим деблокированием защищенного мурамилпептида каталитическим гидрированием над палладиевой чернью [3] Способ позволяет получать мурамилпептиды с выходом до 40% из расчета на сахаридную компоненту. Широкому использованию способа препятствуют наличие технически сложной стадии каталитического гидрирования мурамилпептида, низкий выход целевого продукта и многостадийность его получения. Исходный защищенный дипептид получают в результате 6-стадийного синтеза, в целом синтез мурамилпептида включает 8 стадий (см. фиг.1). Заявляемый способ получения мурамилпептидов осуществляется следующим образом. Для получения активированных эфиров и ее замещенных используют дизамещенные карбонаты (дипентафторфенилкарбонат, динитрофенилкарбонат, дисукцинимидкарбонат и др.). Полученный раствор активированного эфира смешивают с раствором свободных аминокислоты или пептида или соли аминокислоты или пептида в пиридине или его гомологе. Реакцию образования пептида проводят при pH 8-10. По завершении образования пептидной связи реакционную смесь упаривают и выделяют мурамилпептид с использованием хроматографии. Отличиями разработанного способа от известных является использование раствора активированного эфира незащищенной N-ацетилмурамовой кислоты или ее замещенного в пиридине или его гомологах или в их смесях с органическими растворителями. Описано, что при активации карбоксильной группы N-ацетилмурамовой кислоты в пиридине могут получаться сложные смеси продуктов [12] в нашем случае этого не происходит, и получаются с высоким выходом продукты, не содержащие близких по хроматографическому поведению к основному веществу примесей. Использование пиридина или его гомологов в качестве растворителей позволяет проводить синтез со свободными пептидами, аминокислотами или их солями без защиты функциональных групп. Основными преимуществами способа являются отсутствие технически сложной стадии гидрирования конечного мурамилпептида, что обусловлено использованием в синтезе свободного пептида, аминокислоты или их солей. Рискованность гидрирования конечного мурамилпептида обусловлена возможностью отравления катализатора компонентами исходной смеси и возможностью гидрирования на палладиевом катализаторе альдегидной формы N-ацетилмурамовой кислоты. Оба процесса ведут к снижению выхода целевого продукта и его загрязнению. Таким образом, использование пиридина или его гомологов в качестве растворителей в нашем случае позволяет проводить синтез со свободными пептидами, аминокислотами и пептидами или их солями без защиты функциональных групп. Кроме того, использование незащищенных пептидов и сахаров позволяет получать мурамилпептиды минуя стадию деблокирования. Возможность использования в синтезе пептидов и аминокислот с незащищенными карбоксильными, окси- и амидными группами позволяет не только исключить стадию деблокирования целевого продукта, но и упростить получение самого целевого пептида за счет сокращения стадий в его синтезе. При этом суммарное количество стадий в синтезе ГМДП снижается с 8 до 5 стадий (см. фиг.2). А для мурамилпептида GLcNAc(1
4)MurNAcAla-D-Glu с 5 до 3 стадий за счет отсутствия стадий защиты и деблокирования карбоксильных групп (см. фиг.3). Использование в описываемом способе в качестве исходных соединений вещество со свободными карбоксильными и окси-группами в смеси с активированными эфирами N-ацетилмурамовой кислоты и основаниями потребовало проведения реакций в средах, содержащих пиридин или его гомологи. По данным ВЖХ, полученные по такой методике мурамилпептиды не содержали примесей, обусловленных побочными реакциями эпимеризации [10] О-ацилирования [9] и переэтерификации [11] Указанные отличия позволяют получать мурамилпептиды высокой степени чистоты за минимальное число стадий. Выход целевого продукта, как правило, превосходит 70% считая углеводную компоненту. Примеры конкретного выполнения. Синтез дипептидов проводят с использованием описанных методик [3,2,6,7] Дисахарид из биомассы M.lysodeicticus получают по методике аналогичной [13] Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводят на C18 обращенной фазе на колонке 0,45 х 10 см в градиенте 0,01% трифторуксусная кислота _ 0,01% трифторуксусная кислота в 40% ацетонитриле за 20 мин или в других подобных условиях. Структуру мурамилпептидов подтверждали данными масс-спектрометрии и сравнением ВЖХ и ТСХ со стандартами, полученными по методу [3] Пример 1. Получение N -ацетилглюкозаминил-(1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина (ГМДП). 496,5 мг (1 ммоль) N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамовой кислоты растворяют в 3 мл ДМФА, добавляют 394 мг порошка дипентафторфенилкарбоната и перемешивают при 0 +5o в течение 1 ч, затем добавляют 120 мкл N-метилморфолина и перемешивают еще 0,5 ч. К полученной реакционной смеси при 0 +5o добавляют при перемешивании раствор 434 мг (2 ммоль) L-аланил-D-изоглутамина в 5 мл пиридина и 440 мкл N-метилморфолина. Реакционную смесь выдерживают при +7 в течение 17 ч. По завершении реакции растворители отгоняют в вакууме, добавляют 15 мл уксусной кислоты и повторно упаривают досуха. Полученный мурамилпептид растворяют в 15 мл воды, наносят на колонку 1,5 х 50 см с Sephadex DEAE А-25 в ацетатной форме и хроматографируют. Элюцию осуществляют водой, затем 0,04 М раствором уксусной кислоты. Фракции, содержащие ГМДП, упаривают и получают 521,8 мг (75%) целевого продукта 97% чистоты. Пример 2. Получение N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина (ГМДП). 496,5 мг (1 ммоль) N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамовой кислоты растворяют в 3 мл ДМФА, добавляют 302 мг порошка 4,4-динитрофенилкарбоната, 120 мкл N-метилморфолина и оставляют перемешиваться при +20o на 17 ч. К полученной реакционной смеси при +20oC добавляют при перемешивании раствор 662 мг (2 ммоль) трифторацетата L-аланил-D-изоглутамина и 440 мкл N-метилморфолина в 4 мл пиридина. Реакционную смесь выдерживают при +20o в течение 40 ч. Растворители отгоняют в вакууме при +45o досуха. Реакционную смесь растворяют в воде и хроматографируют на колонке с Sephadex DEAE А-25 в ацетатной форме. Элюцию осуществляют водой, затем 0,04 М раствором уксусной кислоты. Фракции, содержащие ГМДП, упаривают и получают 556,58 мг (80%) целевого продукта 98% чистоты. Пример 3. Получение N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина (ГМДП). 496,5 мг (1 ммоль) N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N ацетилмурамовой кислоты растворяют в 5 мл пиридина, добавляют 394 мг дипентафторфенилкарбоната и 120 мкл N метилморфолина и перемешивают при +10o 17 ч, затем к полученной реакционной смеси добавляют 496,5 мг трифторацетата L-аланил-D-изоглутамина и 480 мкл N-метилморфолина в 4 мл пиридина. Реакционную смесь выдерживают при +10o в течение 17 ч, затем упаривают досуха. Добавляют 30 мл 50% уксусной кислоты и упаривают досуха повторно. Полученный препарат хроматографируют в условиях примера 1, фракции содержащие ГМДП, упаривают и получают 591,4 мг (85%) целевого продукта 98% чистоты. Пример 4. Получение N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина (МДП). 293,3 мг (1 ммоль) N-ацетилмурамовой кислоты растворяют в 4 мл ДМФА, охлаждают до +5o, добавляют при перемешивании 394 мг (1 ммоль) дипентафторфенилкарбоната, перемешивают 1 ч, затем добавляют 120 мкл N-метилморфолина и перемешивают 0,5 ч. Далее синтез и выделение проводят аналогично примеру 1. Фракции, содержащие МДП, упаривают и получают 394 мг (80%) целевого продукта 97% чистоты. Пример 5. Получение N-ацетилглюкозаминил -(b1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты. 496,5 мг (1 ммоль) N-ацетилглюкозаминил-(b1-4) N-ацетилмурамовой кислоты растворяют в 3 мл ДМФА, добавляют 256 мг дисукцинимидкарбоната, 120 мкл N-метилморфолина и оставляют перемешиваться при +20o на 6 ч, к полученной смеси при +20o добавляют при перемешивании раствор 498,15 мг трифторацетата L-аланил-D-глутаминовой кислоты и 460 мкл N-метилморфолина в 10 мл 2-пиколина, реакционную смесь оставляют перемешиваться при +20o на 19 ч, затем упаривают, переупаривают с 20 мл 50% уксусной кислоты и хроматографируют на колонке 1,5 х 50 см с Sephadex DEAE A-25 в 0,15 М уксусной кислоте, фракции, содержащие целевой продукт, упаривают и получают 518 мг (73%) целевого продукта 97% чистоты. Пример 6. Получение N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-ацетилмурамил-L-аланина. Препарат получают в условиях примера 3, исходя из раствора 100 мг аланина в 5 мл пиридина и 180 мкл N-метилморфолина. Вес полученного продукта 397 мг (70%).Формула изобретения
Способ получения мурамилпептидов общей формулы
где R водород или 
A остаток аминокислоты или пептида,
путем конденсации активированного производного N-ацетилмурамовой кислоты с аминокислотой или пептидом или их солями с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что конденсации подвергают незащищенные аминокислоту, или пептид, или их соли и процесс осуществляют в пиридине, или его гомологах, или в их смесях с органическими растворителями.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3
Похожие патенты:
