Способ получения окситоцина, рекомбинантная плазмидная днк ртотеilox 3, кодирующая гибридный белок ilox3 для получения окситоцина, штамм escherichia coli - продуцент гибридного белка ilox3

 

Использование: биотехнология, генная и белковая инженерия. Сущность изобретения: способ получения окситоцина основан на культивировании штамма-продуцента Escherichia coli ВКПМ В6511 в богатой среде, далее выращенные клетки разрушают, выделяют гибридный белок ILOX3, расцепляют его ферментативным путем, заменяют C-концевой остаток лизина на амидогруппу и получают целевой продукт. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTOTEilox3, кодирующая гибридный белок 1 L OX3 для получения окситоцина, мол. м. 2,34 мДа, состоит из Hind III/EcoRI-фрагмента плазмиды TOTE2Il3, содержащего тандем промоторов P8 фага fd и ptac, два lac-оператора, усилитель трансляции гена 10 фага T7, терминатор транскрипции фага fd, ген β -лактамазы, и N -концевую часть гена человеческого интерлейкина-3, и Hind III/EcoRI-франгмента, содержащего синтетический ген олигомера окситоцина с 3 мономерными единицами, фланкированные остатками лизина. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В6511-продудент гибридного белка 1 OX3, получен путем трансформации клеток Escherichia coli TG1 плазмидой pTOTEilox 3. 3 с.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно включает сконструированную in vitro серию рекомбинантных плазмидных ДНК pTOTEilox, обуславливающих биосинтез гибридных белков ILOX, аминокислотная последовательность которых включает 63 N-концевых аминокислоты человеческого интерлейкина-3 и олигомер окситоцина, содержащий от 3 до 9 мономерных единиц, фланкированных остатками специфических аминокислот, штаммы E.coli/pTOTEilox продуценты гибридных белковых ILOX и способ получения окситоцина на основе вышеуказанных рекомбинантных ДНК и штаммов-продуцентов.

вырабатывается в человеческом организме нейросекреторными клетками гипоталамуса и накапливается в задней доле гипофиза [1, 2] Он стимулирует сокращение гладкой мускулатуры матки и секрецию молока молочными железами [3, 4] Благодаря этому окситоцин находит широкое применение в медицине и ветеринарии [5] Трудности выделения и очистки природного гормона делают его малодоступным. Практически используется окситоцин, полученный химическим синтезом. Недостатком химического метода является трудоемкость и необходимость очистки препарата от сопутствующих близких по химической природе примесей, присутствующих в препарате вследствие ограничений, присущих синтетическому процессу (неколичественные выходы пептидного синтеза и реакций удаления защитных групп и др.).

В связи с этим более перспективным является способ получения гормона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта с высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья.

Известно однако, что короткие пептиды в бактериальной клетке быстро деградируют. Поэтому, чтобы избежать деградации пептида, его необходимо получать в составе гибрида с белком-носителем и выделять после химического или ферментативного расщепления. В литературе описаны многие такого рода гибриды, в которых роль белка-носителя выполняет β -галактозидаза, фактор некроза опухолей (TNF), a -интерферон и др. [6, 7, 8] а присоединенными пептидами являются энкефалин, соматостатин и др.

Недостатком известных конструкций является небольшая доля пептида в составе гибридного белка [6, 7, 8, 11] Окситоцин в составе гибридных белков не описан.

Группа изобретений позволяет получать рекомбинантный окситоцин по простой технологии и с высоким выходом.

Предлагаемый способ получения окситоцина заключается в том, что рекомбинантной плазмидной ДНК pTOTEilox трансформируют клетки штамма Escherichia coli TG1, полученный штамм Escherichia coli TG1/pTOTEilox культивируют в богатой среде, выращенные клетки разрушают в буферном растворе, выделяют гибридный белок ILOX, расщепляют его ферментативным или химическим путем с последующим или одновременным восстановлением дисульфидных связей, а в образовавшемся декапептиде заменяют C-концевой остаток аминокислоты на амидогруппу.

Таким образом, в основе способа лежит получение новых гибритных белков ILOX (ILOX3 ILOX9), в которых роль белка-носителя выполняет небольшой N-концевой фрагмент человеческого интерлейкина-3 (63 аминокислоты), а для повышения доли целевого нонапептида C-концевая часть представляет собой олигомер окситоцина, содержащий от 3 до 9 мономерных единиц, фланкированных остатками специфических аминокислот для селективного химического или ферментативного расщепления, таких как лизин, триптофан, метионин и т.п.

Предлагаемые рекомбинантные плазмидные ДНК pTOTEilox характеризуется следующими признаками: кодируют аминокислотную последовательность гибридного белка ILOX, включающую 63 N-концевых аминокислоты человеческого интерлейкина-3 и олигомер окситоцина, содержащей от 3 до 9 мономерных единиц, фланкированных остатками специфических аминокислот; имеют молекулярную массу 2,34 2,40 МДа; состоят из: HindIII/EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды pTOTE2IL3, содержащего тандем промоторов P8 фага fd и Ptac, два lac-оператора, усилитель трансляции гена 10 фага T7, терминатор транскрипции фага fd, ген b-лактамазы и N-концевую часть гена интерлейкина-3; HindIII/EcoRI-фрагмента, представляющего собой синтетический ген олигомера окситоцина; при этом олигомер содержит от 3 до 9 мономерных единиц, фланкированных специфическими аминокислотами; содержат: в качестве генетического маркера ген b-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидами pTOTEilox клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта HindIII: HpaI 120 п.о. EcoRV 184 п.о. XbaI 220 п.о. BamHI 545 п.о. PstI - 1860 п.о. BglII 3085 п.о. EcoRI 3439 п.о.

Конструкция рекомбинантных плазмидных ДНК pTOTEilox обеспечивает высокий уровень экспрессии гибридных генов, содержащих ген олигомера окситоцина.

Рекомбинантные плазмидные ДНК pTOTEilox являются по сути гомологами и отличаются друг от друга только количеством кодируемых ими мономерных единиц окситоцина: так, рекомбинантная плазмидная ДНК pTOTEilox3 содержит синтетический ген тримера окситоцина, рекомбинантная плазмидная ДНК pTOTEilox4 содержит синтетический ген тетрамера окситоцина и т.д.

Для их конструирования использован химический подход, позволяющий создавать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

Ген олигомера окситоцина, фланкированного специфическими аминокислотами, получают из соответствующих синтетических олигонуклеотидов путем ферментативной сшивки с помощью ДНК-лигазы.

Источником векторного фрагмента служит известная рекомбинантная плазмидная ДНК pTOTE2IL3, кодирующая человеческий интерлейкин-3 [9] Экспрессия гена интерлейкина-3 в этой плазмиде контролируется промоторами P8 бактериофага fd и Ptac и усилителем трансляции гена 10 фага Т7. Штамм E.coli TG1, содержащий плазмиду pTOTE2IL3, обеспечивает высокий уровень биосинтеза интерлейкина-3.

Рекомбинантную плазмидную ДНК pTOTE2IL3 расщепляют эндонуклеазами HindIII и EcoR1, полученный фрагмент лигируют с синтетическим HindIII/EcoR1-фрагментом, содержащим ген олигомера окситоцина, и получают рекомбинантные плазмидные ДНК pTOTEilox.

Предлагаемые штаммы-продуценты Escherichia coli TG1/pTOTEilox характеризуется следующими признаками.

Морфологические. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культурные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические. Клетки растут при температуре от 4^oC до 40^oC при отпимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штаммы-продуценты E. coli TG1/pTOTEilox отличаются от штамма-реципиента E. coli TG1 только наличием рекомбинантных плазмидных ДНК pTOTEilox, которые и придают им устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток E.coli TG1 соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки E.coli TG1/pTOTEilox являются продуцентами гибридных белков ILOX. При индукции изопропилтио-b-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка, который накапливается в клетках в виде телец включения, и его выход составляет более 30% суммарного белка бактерий.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTOTEilox. Для этого сначала получают векторный фрагмент плазмиды pTOTE2IL3 путем ее расщепления эндонуклеазами HindIII и EcoR1. После очистки электрофорезом в 1%-ном агарозном геле векторный фрагмент лигируют с синтетическим HindIII/EcoR1-фрагментом, содержащим ген олигомера окситоцина, фланкированного остатками лизина, или метионина, или триптофана, или другой аминокислоты для специфического расщепления.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli TG1 и высевают на YT-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией с ³²P-мечеными олигонуклеотидами B, C и H, и из клонов, гибридизующихся со всеми тремя зондами, выделяют плазмидные ДНК, которые подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз HindIII, TcoR1, BamHi и BglII, а также определением последовательности между сайтами EcoRV и EcoRI. Штамм-продуцент E. coli TG1/pTOTEilox выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.), индуцируют изопропилтио- b -D-галактозидом, и снова выращивают до достижения максимальной плотности культуры.

Выделение гибридного белка ILOX из клеток продуцента включает следующие стадии: разрушение выращенных клеток одним из обычно применяемых способов;
отмывку буферными растворами телец включения от растворимых компонентов клетки;
солюбилизацию денатурированного целевого белка из телец включения либо в 5 8 М растворе мочевины, било в 5 М растворе гидрохлорида гуанидина, либо в другом подходящем растворителе;
очистку гибридного белка в результате ступенчатого разбавления растворов в мочевине или гидрохлориде гуанидина, либо другими методами.

Расщепление гибридного белка проводят ферментативным или химическим путем с последующими или одновременным восстановлением дисульфидных связей для разъединения образующихся при расщеплении пептидных фрагментов. Например, при ферментативном расщеплении гибридного белка, в котором мономерные единицы окситоцина фланкированы остатками лизина, используют трипсин, а затем восстанавливают дисульфидные связи с помощью карбоксипептидазы B. А в случае, если мономеры фланкированы другими специфическими для расщепления остатками аминокислот используют другие соответствующие им ферменты. Химическое расщепление гибридного белка, если, например, мономерные единицы фланкированы остатками метионина, осуществляют с помощью бромциана и т.д.

Укрепление C-концевого аминокислотного остатка из окситоцинового декапептида, образующегося при расщеплении гибридного белка, проводят либо с помощью карбоксипептидазы Y (с одновременным амидированием концевого остатка глицина в окситоцине), либо с помощью карбоксипептидазы B с последующим химическим амидированием концевой аминокислоты (глицина) и получают окситоцин.

На фиг. 1 изображена частичная структура плазмиды pTOTEilox3 в области гена гибридного белка ILOX3 и соответствующая ей аминокислотная последовательность гибридного белка; на фиг. 2 -структура синтетического фрагмента, содержащего тример гена окситоцина и схема его сборки из синтетических олигонуклеотидов.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Химический синтез олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (НПО "Биосан", Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов 5'- диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-(b-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5 -07 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл [10]
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTOTEilox3.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pTOTE2IL3 (3мкг) обрабатывают в 40 мкл буфера KGB (100 мМ K-глутамат, pH 8,8, 25 мМ трис-ацетат, pH 7, 6, 10 мM Mg-ацетат, 1 мМ меркаптоэтанол) рестриктазами HindIII (10 ед. акт.) и EcoRI (10 ед. акт. ) в течение 1 ч при 37^oC. Векторный фрагмент величиной 3,45 т. п.о. после электрофореза в 1%-ном агарозном геле электрофоретически перемещают в слой геля 0,5% LGT-агарозы, и затем элюируют методом вымораживания агарозы и последующего осаждения ДНК из раствора этанолом.

Синтетический фрагмент с геном тримера окситоцина получают лигированием 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов B,C,D,E,F,G и нефосфорилированных A и H (фиг.2) (концентрация каждого олигонуклеотида 0,25 мкМ) в 100 мкл буфера L (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мM MgCl₂, 0,2 мM rATP, 10 мM дитиотреит) с помощью 50 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 10 ч при 15^oC, и фрагмент длиной 106 п. о. выделяют после электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. 10 пмоль синтетического фрагмента в 20 мкл буфера, содержащего 50 мM трис-HCl, pH 7,6, 10 мM MgCl₂, 5 мM дитиотреит, 0,1 мM спермидин и 0,1 мM EDTA, и фосфорилируют с 20 пмоль rATP и 10 ед.акт. Т4-полинуклеотидкиназы в течение 1,5 ч при 37^oC.

4 мкл полученного раствора фосфорилированного синтетического фрагмента, содержащего 2 пмоль, прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера L и лигируют с помощью 20 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 6 ч при 10^oC.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli TG1. Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ c ³²P-мечеными олигонуклеотидами A, B и H. Из клонов, гибридизующихся со всеми тремя зондами выделяют ДНК и анализируют с помощью эндонуклеаз HindIII, BamHI,EcoRI и BglII, и определением нуклеотидной последовательности регулярного участка, начала структурного гена и клонированного синтетического фрагмента.

Пример 3. Получение штамма E.coli TG1/pTOTEilox3 (ВКПM В6511) - продуцента гибридного белка ILOX3 и определение его продуктивности.

Клетки E.coli TG1, несущие плазмиду pTOTEilox3, структура которой подтверждена данными анализа (пример 2), являются продуцентом гибридного белка ILOX3.

Штамм продуцента E. coli TG1/pTOTEilox3 выращивают при 37^oC в 100 мл YT-бульона (pH 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью врвщения 190 об/мин до мутности A₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-b-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют A₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с A₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100^oC и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15%-ном SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе гибридного белка.

Пример 4. Выделение гибридного белка ILOX3.

Влажные клетки (100 г) суспендируют в 200 мл буфера (50 мM Na-фосфат, 1 мM EDTA, pH 7,5), добавляют лизоцим (100 мкг/мл), инкубируют 30 мин при 20^oC, добавляют раствор MgCl₂ (до 10 мM) и ДНКазу (10 мкг/мл), инкубируют при 20^oC до потери вязкости (30 мин), разбавляют 2 л буфера (50 мM Na-фосфат, 10 мM EDTA, 4 M мочевина, 1% тритон X 100, pH 7,5) и центрифугируют 20 мин при 10000 g. Осадок суспендируют в 2 л буфера (50 мM Na-фосфат, 10 мM EDTA, 4 M мочевина, 1% тритон X 100, pH 7,5) с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) и центрифугируют 20 мин при 10 000 g. Отмывку буфером повторяют еще раз, затем аналогично промывают буфером (50 мM Na-фосфат, 1 мM EDTA, pH 7,5). Осадок ресуспендируют в 2 л буфера (50 мM Na-фосфат, 1 мM EDTA, 5 M гуанидингидрохлорид, pH 7,5) и инкубируют при 20^oC. Полученный раствор разбавляют при перемешивании 8 л буфера (50 мM Na-фосфат, 1 мM EDTA, pH 7,5) и центрифугируют.

Пример 5. Ферментативный гидролиз гибридного белка ILOX3 и получение дезамидоокситоцина.

Суспензию 100 мг гибридного белка ILOX3 в 10 мл 0,1 М аммоний-карбонатного буфера, pH 8,5, обрабатывают 2 мг трипсина 6 ч при 37^oC, до полного растворения осадка. Полноту гидролиза белка контролируют с помощью ВЭЖХ, используя смолу Sepharon C-18 в градиенте концентрации 20 - 80% ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте.

К 10 мл трипсинового гидролизата ILOX3 прибавляют 1 мг карбоксипептидазы B и инкубируют 1 ч при 37^oC. Раствор замораживают, лиофилизуют и выделяют дезамидоокситоцин обращенно-фазовой хроматографией на смоле Sepharon C-18 в градиенте концентрации 20 80% ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте.

Пример 6. Превращение дезамидоокситоцина в окситоцин.

К раствору 50 мг дезамидоокситоцина в 2 мл диметилформамида прибавляют 20 мг БОК-пирокарбоната (2,5-кратный избыток) и 20 мкл триэтиламина (5-кратный избыток), смесь выдерживают 10 ч при 20^oC (контролируя полноту ацилирования с помощью ВЭЖХ) и упаривают. Остаток растворяют в 2 мл диметилформамида и обрабатывают 10 мг пентафторфенилпирокарбоната в присутствии триэтиламина в течение 1 ч, затем упаривают с толуолом для удаления избытка реагентов, растворяют в 5 мл смеси диметилформамид-хлористый метилен и обрабатывают 200 мг хлористого аммония в присутствии избытка триэтиламина или 2 н. раствором аммиака в хлористом метилене в течение 24 ч (контроль конверсии с помощью ВЭЖХ). Образовавшийся БОК-окситоцин выделяют обращенно-фазовой хроматографией и обрабатывают трифторуксусной кислотой 40 мин при 20^oC. После упаривания получают 10 мг окситоцина.

Аналогично получают рекомбинантные плазмидные ДНК pTOTEilox4 pTOTEilox9, содержащие гены олигомера окситоцина с различным количеством мономерных единиц и соответствующие им штаммы-продуценты E.coli TG1/pTOTEilox(4 9).

Таким образом, группа изобретений позволяет получит рекомбинантный окситоцин путем микробиологического синтеза и последующего расщепления гибридного белка по простой технологии и с высоким выходом.

Литература.

1. Lederis K. Gen. Compar. Endocrinol. 1961, V. 1, No. 1, p. 80 86.

2. Du Vigneaud V. Science. 1956, V. 123, p. 956.

3. Du Vigneaud V. Ressler Ch. Trippet S. J. Biol. Chem. 1953. V. 205, p. 949 957.

4. Dale H.H. Biochem. J. 1909, V. 4, p. 427 447.

5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. Медицина. Т. 2. c. 72.

6. Черненькая Е. А. Гуревич А.И. Коробко В.Г. Биоорганическая химия, 1989, т. 15, N 4, с. 508 513.

7. Авт. св. СССР N 1321063, кл. C 12 N 15/00, 14.11.85.

8. Авт. св. СССР N 1724691, кл. C 12 N 15/42, 20.06.90.

9. Луценко С. В. Гуревич А.И. Птицын Л.Р. Рязанова Л.А. Смирнов В.А. - Биоорган. химия, 1992, т. 19, No 3. с. 391 397.

10. Atkinson T. Smith M. in: Oligonucleotide synthesis; a practical approach, -1984, Ed. Gait M.J. p. 35 81. IRL Press. Oxford.

11. Collect. Czech. Chem. Commun, 1985, 50, 12, p. 2775 2782 (прототип).

Формула изобретения

1. Способ получения окситоцина, отличающийся тем, что проводят культивирование штамма-продуцента Escherichia coli ВКПМ В6511 в богатой среде, выращенные клетки разрушают в буферном растворе, выделяют гибридный белок TLOX3, расщепляют его ферментативным путем, заменяют С-концевой остаток лизина на амидогруппу и получают целевой продукт.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТОТЕilox3, кодирующая гибридный белок ТLOX3 для получения окситоцина молекулярной массы 2,34 МДа, состоящая из Нind III/EcoRI-фрагмента плазмиды рТОТЕ21L3, содержащего тандем промоторов Р8 фага fd и Ptac, два lac-оператора, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, терминатор транскрипции фага fd, ген β-лактамазы и N-концевую часть гена интерлейкина-3, Нind III/EcoRI-фрагмента, представляющего собой синтетический ген олигомера окситоцина, содержащего 3 мономерные единицы, фланкированные остатками лизина, содержит синтетический маркер ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость к пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта Нind III: Hpa 1 120 п.о. EcoRV 184 п.о. Xba 1 220 п.о. Bam Н1 545 п.о. Pst 1 1860 п.о. Bg III 3085 п.о. EcoRI 3439 п.о.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В6511 продуцент гибридного белка ILОХ3.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2