Способ получения иммуноглобулина для ингибиции имунного ответа

 

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к способам получения иммуноглобулина человека. Сущность изобретения: получают иммуноглобулин из плазмы крови человека с титром анти-HIA антител не менее 1:32, которую обрабатывают натрия октаноатом в концентрации 0,35±0,05% и pH 4,15±0,5 с последующим применением ионообменной хроматографии. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения иммуноглобулина человека.

Интенсивная терапия гематологических больных компонентами крови, например тромбоцитами, часто сопровождается образованием анти-HIA антител, что существенно затрудняет проводимое лечение из-за развития посттрансфузионных реакций негемолитического типа или состояния рефрактерности. Ведется интенсивный поиск способов, позволяющих предотвратить или отсрочить образование анти-HIA антител и, следовательно, повысить безопасность и эффективность применения отдельных препаратов крови. Большие надежды возлагают на идиотипические анти-анти-HIA антитела, принципиальная возможность образования которых показана у лиц, сенсибилизированных к HIA. Снижение образования анти-HIA антител под влиянием пассивного наведения антиидиотипических антител отмечено после введения коммерческих препаратов иммуноглобулина, предположительно содержащих эти анти-антитела. Известно, что коммерческие препараты иммуноглобулина, получаемые традиционным методом фракционирования этанолом, не содержат анти-HIA антитела. Это может происходить, во-первых, за счет нестандартного и низкого содержания антител в исходных сыворотках, объединяемых в производственную загрузку, что приводит к их разведению и взаимному истощению. Во-вторых, метод фракционирования этанолом, являющийся относительно жестким, приводит к частичной денатурации белка и угнетению специфической активности антител.

Целью заявляемого технического решения является получение иммуноглобулина для ингибиции иммунного ответа за счет использования исходного сырья, содержащего анти-HIA антитела, и щадящего метода фракционирования.

Для этого к плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре 37^oC. Центрифугируют смесь при + 4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси 4,15±0,05; при постоянном перемешивании вводят натрия окатноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35±0,05% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия отканоата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение 1 мес. при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 128.

Таким образом, предложенное техническое решение в совокупности с известными признаками позволяет решать новую задачу получения из плазмы крови человека анти-HIA иммуноглобулина, обладающего специфической активностью в той степени, которая необходима для ингибиции иммунного ответа.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре 37^oC. Центрифугируют смесь при + 4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 128, электрофоретическую чистоту 98% выход целевого продукта - 2,4 г из одного литра плазмы.

Пример 2. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,30% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 96, электрофоретическую чистоту 95% выход целевого продукта 2,8 г из одного литра плазмы.

Пример 3. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаонат до его конечной концентрации в растворе 0,40% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта 2,0 г из одного литра плазмы.

Пример 4. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,10; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку ДЕАЕ-целлюлозы, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта - 2,1 г из одного литра плазмы.

Пример 5. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,2; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^o в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 96, электрофоретическую чистоту 96% выход целевого продукта 2,7 г/л плазмы.

Пример 6. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,6 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,20% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят растворы белка через колонку с DEAE-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 64, электрофоретическую чистоту 92% выход целевого продукта - 3,2 г из одного литра плазмы.

Пример 7. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях компактного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,50% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с DEAE-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта 1,7 г из одного литра плазмы.

Пример 8. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,0; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с DEAE-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта - 1,6 г из одного литра плазмы.

Пример 9. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8, коррегируют pH смеси до 4,3; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с DEDA-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 64, электрофоретическую чистоту 93% выход целевого продукта - 3,3 г из одного литра плазмы.

Изложенные выше примеры, подтверждающие возможность осуществления способа, иллюстрируют данные таблицы.

Таким образом, полученные данные подтверждают, что только параметры способа, изложенные в примерах 1 5, обеспечивают при минимально требуемом титре анти-HIA антител в плазме (1:32) уровень специфических антител в препарате иммуноглобулина, достаточном для подавления иммунного ответа (1:96 1:192); при оптимальном выходе целевого продукта (2,1-2,8 г/л) и его электрофоретической чистоте 95 100% Параметры фракционирования плазмы, выходящие за оптимальные пределы предлагаемого способа, не позволяют получать целевой продукт с достаточным уровнем концентрирования анти-HIA антител и электрофоретической чистотой (примеры 6 и 9). Увеличение концентрации натрия октаноата выше 0,4% (пример 7) или снижение концентрации водородных ионов ниже 4,1 (пример 8) позволяет получать препараты с высоким титром анти-HIA антител (1 192) и электрофоретической чистотой 100% однако выход целевого продукта в этих режимах существенно снижен.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулина для ингибиции иммунного ответа путем фракционирования плазмы крови человека, отличающийся тем, что из плазмы крови используют плазму, содержащую Н1А специфические аллоантитела в титре не менее 1 32, а фракционирование проводят натрия октаноатом в концентрации 0,35 ± 0,05% при pH 4,15 ± 0,05 с последующей ионообменной хроматографией.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2