Способ получения основного ингибитора протеаз из легкого и поджелудочной железы крупного рогатого скота

 

Изобретение может быть использовано в медицине, в энзимологии, в клеточной и молекулярной биологии. Техническая задача: упрощение технологии, сокращение стадий, удешевление целевого продукта, повышение его выхода и удельной активности. Сущность изобретения: замороженные органы крупного рогатого скота гомогенизируют, экстрагируют из них основной ингибитор протеза водным раствором кислоты при pH 1-3, полученный экстракт фракционируют и концентрируют ультрафибрацией в тангенциальном потоке сначала на полых волокнах с размерами пор 15-50 КДа, затем 5 КДа, окончательную очистку проводят катионообменной хроматографией. Технический результат: упрощение технологии, удешевление продукта, повышение выхода в 8 раз, удельной активности в 10,8 раз. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине и энзимологии, в частности к технологии получения основного ингибитора протеза (ОИП) трипсина, калликреина, плазмина. ОИП служит действующим началом лекарственных препаратов: контрикала, гордокса, тразилола и других, применяется в биохимии, клеточной и молекулярной биологии [1, 2] Известен способ получения ОИП из легких, поджелудочной, подчелюстной и слюнной желез крупного рогатого скота (КРС) путем их измельчения, кислотной экстракции ОИП, фракционирования с помощью сульфата аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии [3] Однако этот способ требует значительного расхода сульфата аммония и экологически вреден.

Известен способ получения ОИП из тканей органов КРС путем их измельчения, кислотной экстракции и последующей аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе [4] Этот способ дает целевой продукт с удельной активностью 7.000 Kiu/мг, но используемая смола слишком дорога для промышленного применения.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения ингибитора протеза и поджелудочной железы крупного рогатого скота [5] Способ получения основного ингибитора протеза, заключается в следующем: легкие или поджелудочную железу крупного рогатого скота измельчают, экстрагируют 1% ным раствором щавелевой кислоты, удаляют осадок фильтрованием, проводят хроматографию на селикагеле, целевой продукт элюируют ацетоном с последующим его подщелачиванием, ОИП осаждают 4-6 объемами ацетона, обессоливают и высушивают. Выход ОИП составляет 40000-57000 Е/кг при удельной активности 500-600 Kiu/мг.

Сопоставительный анализ предлагаемого способа и прототипа показал, что определяющим существенным отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что целевой продукт выделяют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке, а не хроматографией и осаждением продукта органическим растворителем (прототипом).

Технической задачей изобретения является упрощение способа получения ОИП, удешевление процесса, повышение выхода и удельной активности целевого продукта.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем: замороженные легкие, поджелудочные, подчелюстные или слюнные железы КРС измельчают в мясорубке, гомогенизируют, добавляют трихлоруксусную или уксусную кислоты до pH 1-3 и жмых отделяют центрифугированием. Доводят pH супернатанта до 6,2-7,2 с помощью NaOH. Экстракт подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с размером пор 15-50 КДа и концентрируют на полых волокнах с размером пор 5 КДа. Концентрат наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой проводя сорбцию целевого продукта при pH 6,2-7,2, а десорбцию 0,45 М раствором хлорида натрия. Выход составлял для поджелудочной железы 104,500 Е/кг с удельной активностью 5,500 Kiu/мг, что больше, чем по способу-прототипу в 1,8 и 9 раз соответственно. При выделении ОИП из легких выход составлял 455,000 Е/кг с удельной активностью 6500 Kiu/мг, что больше, чем по способу-прототипу в 8 и 10,8 раз соответственно.

Отличительными существенными признаками являются следующие.

Выделение целевого продукта проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке сначала на полых волокнах с размером пор 15-50 кДа, а затем с размером пор 5 кДа, а затем с размером пор 5 кДа, что позволяет последовательно сначала провести фракционирование белков после кислотной экстракции, а затем осуществить концентрирование экстракта, что позволяет упростить способ. Проведенное исследование белкового состава экстракта показано, что основное количество примесных белков имеет молекулярную массу больше 15 кДа, поэтому наиболее оптимальным режимом фракционирования (выделения ОИП) является ультрафильтрация на полых волокнах с размером пор 15-50 кДа. Концентрирование полученного фильтрата проводят ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 5 кДа, что позволяет избавиться от низкомолекулярных примесей, в 20-30 раз сократить объемы рабочей жидкости перед хроматографической очисткой ОИП, и, тем самым, упростить дальнейшие процедуры и повысить выход целевого продукта.

Очистку целевого продукта проводят сорбцией на карбоксиметилцеллюлозе при pH 6,2-7,2 с последующей десорбцией ОИП 0,45 М раствором хлорида натрия, что позволяет дополнительно очистить целевой продукт в 30-50 раз.

Именно вышеназванные отличительные признаки позволяют получить качественно новый положительный эффект по сравнению с прототипом, а именно - существенно упростить способ получения и увеличить выход ОИП из поджелудочной железы по активности в 2,2 раза, по удельной активности в 10 раз, а из легких в 9,5 раз и в 11,8 раз соответственно. Кроме этого, предлагаемый способ позволяет снизить себестоимость целевого продукта за счет снижения расхода химических реактивов, повысить пожаробезопасность и экологическую чистоту процесса за счет исключения использования больших количеств ацетона.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения: Пример 1. Один кг замороженных легких КРС измельчают в мясорубке, затем в гомогенизаторе, добавляют воды до объема 3 л и ТХУ-150 мл 50% раствора, размешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Далее все операции можно проводить при комнатной температуре. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием при 5,000g 10 мин. и доводят pH до 6,2-7,2 с помощью NaOH. Экстракт фильтруют на установке УПЛ-0,6 с полыми волокнами АР-0,2-50 ПА. Полученный фильтрат концентрируют на полых волокнах АР-0,2-5 ПА до 100 мл. Концентрат наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой СМ-52 (3x7) фирмы "Ватман", уравновешенную водой. Колонку промывают водой и ингибитор элюируют 100 мл 0,45 М раствора хлорида натрия.

Выход составил 455,000 Е/кг с активностью 6,500 Kiu/мг.

Пример 2. Все операции проводили как описано в примере 1, используя в качестве исходного сырья 1 кг поджелудочной железы.

Выход составил 104,500 Е/кг с активностью 56500 Kiu/мг.

Пример 3. Все операции проводили, как описано в примере 1, используя вместо ТХУ ледяную уксусную кислоту, доводя pH до 1-3.

Выход составил 235,000 Е/кг с активностью 5,000 Kiu/мг.

Таким образом, предлагаемый способ получения ОИП по сравнению со способом-прототипом позволяет: 1. Сократить число стадий процесса, его длительность.

2. Удешевить целевой продукт за счет снижения расхода химреактивов.

3. Увеличить выход ОИП из поджелудочной железы по активности в 1,8 раз, по удельной активности в 9 раз, а из легких в 8 раз и 10,8 раз соответственно.

Источники информации: 1. Frifz H, Wunderer G. Drug Res. 1983, 33 (1), N 4, pp. 479-494.

2. Состояние разработки лекарственных препаратов ОИП, Фармация, 1992, N 2, стр. 66-69.

3. Vogel R. Trantschold I. Worle E. ads. Natural Rcoteinase Inhibitors, pp. 76-95, Academie Press, New York, 1968.

4. Chauvet J. Acher R. FEBS Lett, 23, 317, 1972.

5. DE, патент N 1492114, кл. АНК 17/00, 1972 г.

Формула изобретения

1. Способ получения основного ингибитора протеаз из легких и поджелудочной железы крупного рогатого скота, включающий измельчение исходного сырья, экстракцию водным раствором кислоты, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что выделение целевого продукта осуществляют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке сначала на полых волокнах с размером пор, отсекающим белки с мол. м. 15 50 КДа, затем с мол. м. 5 КДа, а очистку целевого продукта проводят хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе, осуществляя сорбцию при pH 6,2 7,2, а десорбцию 0,45 М раствором хлорида натрия при том же pH.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию проводят водным раствором уксусной или трихлоруксусной кислоты при pH 1 3.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.03.2005

Извещение опубликовано: 20.02.2006        БИ: 05/2006

---