Способ получения пептидов, восстанавливающих функцию предстательной железы

 

Изобретение относится к производству лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из предстательной железы. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Для этого сырье измельчают, экстрагируют в растворе уксусной кислоты при комнатной температуре при периодическом перемешивании в течение 18 - 24 ч, затем сырье разливают в бачки и подвергают однократному замораживанию при температуре минус 5 - 20^oC с последующим оттаиванием. После полного оттаивания содержимое бачков фильтруют через капроновую сетку, осветляют и подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом пропускания 10 кД. Полученный ультрафильтрат разводят дистиллированной водой до требуемого содержания полипептидов и готовят лекарственную форму. Выход целевого продукта с единицы сырья повысился в 5 - 8 раз. 1 ил.,1 табл.

Изобретение относится к производству лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья.

Новым подходом к проблеме коррекции нарушений функций организма является создание лекарственных средств на основе эндогенных биологически активных веществ. Среди них важную роль играют регуляторные пептиды внутри и межклеточные мессенджеры, осуществляющие перенос информации, необходимой для нормального функционирования, развития и взаимодействия клеточных популяций. Установлено, что регуляторные пептиды обладают выраженной тканеспецифичностью, восстанавливая функции тех органов и тканей, которые служат исходным материалом для их получения и в то же время не имеют молекулярной видоспецифичности, благодаря чему полученные на их основе препараты не несут антигенных свойств и ассоциированных с ним побочных эффектов (1, 2).

Результаты экспериментальных клинических исследований свидетельствуют о том, что пептидные биорегуляторы обладают выраженными противовоспалительными, иммунномодулирующими, антимутагенными, гератопротективными и антиканцерогенными свойствами, что позволяет их использовать для профилактики и лечения иммуннодефицитных заболеваний, хронических инфекций, возрастной патологии и т.д. (2).

Так, например, комплекс водорастворимых пептидов, выделенных из предстательной железы крупного рогатого скота (КРС) обладает органотропным действием в отношении человеческой простаты и позволяет осуществлять патогенетическую терапию заболеваний предстательной железы (4, 5).

Для получения пептидного комплекса из предстательной железы КРС предложен метод, выключающий экстрацию измельченного сырья 5%-ной уксусной кислотой с добавлением хлористого цинка, отделение экстракта от жмыха, осаждение целевого продукта пятью объемами ацетона при температуре 5 7^oC, сушку осадка на воздухе, его промывку десятью объемами ацетона и ренатурацию в воде с последующим осветлением и приготовлением лекарственной формы (6). Однако, получаемый таким способом пептидный препарат содержал белковые контаминации, с целью очистки от которых позднее был введен дополнительный этап - ультрафильтрация на мембранах с порогом пропускания 15 кД (7). При этом выход целевого продукта с единицы сырья снизился в 8 раз. Именно этот способ по совокупности признаков является наиболее близким заявляемому. Главным недостатком его является низкий выход целевого продукта (1,5 г с 1 кг сырья). Кроме того, способ-прототип обладает существенными недостатками, связанными с использованием больших объемов ацетона, что делает производство взрывоопасным, нетехнологичным, требует громоздкого оборудования (отстойников, ректификационных колонн и пр.) и огромных производственных площадей.

Настоящим изобретением решена задача создания простого, технологичного и эффективного способа получения биологически активных пептидов с более высоким выходом при сохранении требуемой активности и заданной степени чистоты.

Получаемый, согласно разработанному способу, пептидный комплекс не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (данные ВЭЖХ на фиг.1; а также отрицательная реакция на белок с трихлоруксусной кислотой), отвечает критериям подлинности (максимум поглощения в ультрафиолетовом спектре составляет 270±5 нм) и специфической активности [обладает высокой способностью реактивировать щелочную фосфатазу, ингибированную цистином] (8).

Для достижения поставленной задачи используют предстательные железы крупного рогатого скота (КРС), которые измельчают, экстрагируют в растворе уксусной кислоты, замораживают при температуре минус 5 20^oC и оттаивают, после чего предварительно осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом пропускания 10 кД.

В отличие от способа-прототипа, согласно которому целевой продукт выделяют и концентрируют методом ацетонового осаждения, в заявляемом способе вводится этап замораживания экстрагируемого сырья при температуре минус 5 - 20^oC с последующим оттаиванием, что приводит к значительному увеличению выхода биологически активных полипептидов вследствие криогенного нарушения целостности клеточных мембран, сопровождающегося выбросом интрацеллюлярных продуктов. Кроме того, процесс замораживания-оттаивания приводит к криоструктурированию полидисперсных частиц соединительной ткани и высокомолекулярных белков, что существенно облегчает последующее отделение экстракта от жмыха.

Другой особенностью заявляемого способа является использование для очистки целевого продукта ультрафильтрации на мембранах с порогом пропускания 10 кД. Выбор мембран с указанной селективностью обусловлен молекулярной массой биологически активных пептидов, которая составляет 1 10 кД (2, 9).

Приведенная совокупность отличительных признаков заявляемого способа в литературе не описана, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня знаний в области технологии производства лекарственных препаратов.

Пример 1. 50 кг замороженной бычьей предстательной железы измельчают электромясорубкой, добавляют в фарш 75 л 0,1 н раствора уксусной кислоты и экстрагируют в реакторе при комнатной температуре в течение 18 ч с постоянным перемешиванием.

По окончании экстракции субстрат разливают по 10 12 л в бачки из полиэтилена и подвергают процедуре замораживания при температуре минус 5^oC с последующим оттаиванием. Для ускорения процесса размораживания бачки можно поместить в ванну с горячей водой.

После полного оттаивания, содержимое бачков фильтруют через капроновую сетку, осветляют на сепараторе типа АСГ-3М (6 8 тыч. об/мин) и подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом пропускания 10 кД (установка "Pellicon" с мембраной "PTGC" или аппарат "Sartocon-2" с фильтрами "Polysulfone 10000 D") при рабочем давлении 0,05 0,1 МПа. Из 70 л экстракта получают 65 л ультрафиолета, который разводят дистиллированной водой таким образом, чтобы содержимое полипептидов составляло 4 6 мг/мл, добавляют аминоуксусную кислоту из расчета 10 г/л, стерилизуют, разливают в ампулы по 1 мл лиофилизируют.

Выход целевого продукта составляет 8 г на 1 кг исходного сырья.

Пример 2. 20 кг замороженной бычьей предстательной железы измельчают на волчке и заливают 30 л 0,1 н уксусной кислоты.

Экстракцию проводят в реакторе при комнатной температуре в течение 24 ч с периодическим перемешиванием.

По окончании экстракции субстрат замораживают при температуре минус 20^oC, а затем оттаивают и фильтруют последовательно через капроновую сетку и фильтрокартон.

Осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 10 кД (аппарат "ПРА-4" с мембранами "ПА-10") при рабочем давлении 0,05 0,1 МПа. Далее по примеру 1.

Выход целевого продукта составляет 8 г на 1 кг исходного сырья.

Примечание к таблице: * Реакция с трихлоруксусной кислотой (таблица).

**Биологическую активность пептидов определяли в соответствии с требованиями нормативно-технической документации (8) по их способности восстанавливать (в) активность щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином. Согласно указанным требованиям, процент восстановления активности должен быть не менее 20% (таблица).

На чертеже показана ВЭЖХ образцов биологически активных пептидов из предстательной железы КРС (изокритическая элюция на колонке с "Superosa-12"", 10х30), где А комплекс биологически активных пептидов, полученный согласно заявляемому способу; Б препарат "Простатилен" производства АО "Самсон", СПб, полученный согласно способу-прототипу; В метчики: 1 рибонуклеаза (ММ 14000 Д), 2 цианкобаламин (ММ 1357 Д), 3 мертиолят (ММ 405 Д).

Сравнительный анализ продуктов, полученный согласно заявляемому способу и способу-прототипу ( чертеж), показывает практическую идентичность полипептидных фракций (пики 1, 2) при несколько меньшем содержании в полученном нами продукте, низкомолекулярных контаминирующих фракций (пики 3 - 5), представленных свободными аминокислотами и неорганическими соединениями.

Таким образом, заявляемый способ позволяет в 5 6 раз увеличить выход биологически активных пептидов с единицы сырья, а также исключить из технологии их получения ацетон и тем самым повысить безопасность и экологическую чистоту.

Источники информации: 1. Ашмарин И.П. "Вопр. мед. химии", 1984, 30, 3: 2 7.

2. Яковлев Г.М. и соавт. "Механизмы биорегуляции", Спб, "Наука", 1992, 40 с.

3. Яковлев Г.М. и соавт. "Клин. медицина", 1991, 69,5: 19 23.

4. Ткачук В.Н. Горбачев А.Г, Хавинсон В.Х, "Урол. и нефрол.", 1991, 5: 40 43.

5. Возианов А.В и соавт. "Урол. и нефрол.", 1991, 5: 43 46.

6. Патент РФ N 14172441, кл. A 61 K 35/52, 1988.

7. Технологический регламент производства простатилена, Ленинград, 1989, 93 с.

8. ВФС 42-2077-91, 1991, 8 с.

9. Морозов В. Г. Хавинсон В.X. "Усп. совр. биол.", 1983, 96, 3(6): 339 - 352.

Формула изобретения

Способ получения пептидов, восстанавливающих функцию предстательной железы путем измельчения предстательной железы крупного рогатого скота, обработки гомогената уксусной кислотой с последующим отделением целевого продукта, его осветлением и ультрафильтрацией, отличающийся тем, что после обработки уксусной кислотой гомогенат замораживают при температуре минус 5 - 20^oС, затем оттаивают и отделяют целевой продукт фильтрацией, а ультрафильтрацию проводят на мембранах с порогом пропускания 10 кД.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2