Устройство магнитной сепарации клеток

 

Использование: изобретение применяется в медицине, а именно в онкологии, и предназначено для использования при лечении злокачественных заболеваний человека, связанных с аутотрансплантацией костного мозга. Сущность изобретения: устройство магнитной сепарации клеток содержит контейнеры с суспензией клеток кроветворной системы и с иммуномагнитным сорбентом, с физраствором и контейнеры для сбора клеток и физраствора. Кроме этого, устройство дополнительно содержит блок для перемешивания суспензии клеток с иммуномагнитным сорбентом, блок термоэлементов с блоком регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента, блок электромагнитных клапанов, контейнер с ферментом, блок дозированной подачи фермента и блок термоэлементов физраствора. 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и преимущественно предназначено для использования при лечении злокачественных заболеваний человека, связанном с аутотрансплантацией костного мозга после хирургического удаления опухоли и интенсивной химиотерапии, путем очистки и пересадки собственного костного мозга, что исключает его отторжение.

Изобретение может применяться также при лечении различных злокачественных заболеваний кроветворной системы человека.

Возможно использование изобретения для исследований в области вирусологии, с целью разработки методов лечения таких заболеваний, как СПИД и др. а также в научно-исследовательских учреждениях для негативной и позитивной сепарации клеток при решении фундаментальных медицинских и биологических проблем.

Аутотрансплантация костного мозга в онкологии -это комплексная медицинская технология, включающая забор костного мозга, выделение мононуклеаров, их разделение и/или лекарственную обработку (при необходимости), заморозку и хранение, проведение больному высокодозной химиотерапии (или облучения), собственно трансплантацию костного мозга и ведение больного в остром посттрансплантационном периоде.

Известен способ разделения клеток (а.с. N 1169615), основанный на связывании злокачественных или здоровых клеток со специфическими антителами с липосомами, содержащими монокристаллы ферромагнитного материала, при этом разделение осуществляют в неоднородном магнитном поле.

Фирмой Baxter (USA) для иммуноселективной сепарации клеток созданы ряд систем магнитной сепарации клеток.

Система магнитной сепарации клеток Isolex 50 предназначается для позитивного отбора кроветворных клеток. Система Isolex 50 содержит контейнер с физиологическим раствором, съемный контейнер для суспензии клеток, магнитной системы, механизма приведены в движение магнитов.

Система Isolex 50 предназначается только для исследовательских целей.

Разработанная система Isolex 300 аналогична системе Isolex 50, рассчитана на одновременную очистку до 300 мл и предназначена для клинического использования.

Система магнитной сепарации клеток MaxSep предназначена для сепарации клеток с использованием негативной и позитивной иммуноселекции. Устройство MaxSep состоит из нескольких пластмассовых контейнеров, соединенных между собой эластичными полихлорвиниловыми трубками, блоков магнитной системы, перистальтического насоса, блока управления. При имунно-селективной сепарации используется иммуномагнитный сорбент, состоящий из гладких, однородных нетоксичных магнитных шариков, покрытых полистиролом и соединенных с антителами.

К недостаткам системы магнитной сепарации клеток следует отнести: отсутствие в системе встроенных устройств для инкубации (нагрев, перемешивание) суспензии клеток с иммуномагнитным сорбентом.

Инкубация производится в отдельных специальных дорогостоящих инкубаторах, что удорожает процесс сепарации клеток, нарушается единый технологический процесс очистки, что отрицательно сказывается на выполнении требований стерильности; отсутствует возможность многократного повторения процесса очистки с использованием одного и того же комплекта контейнеров, из-за чего уменьшается степень очистки клеток при позитивной селекции; отсутствие нагрева и регулирования температуры суспензии клеток в процессе очистки, что повышает вероятность снижения жизнедеятельности клеток; при позитивной селекции разделение клеток от иммуномагнитного сорбента осуществляется вне системы; отсутствие автоматизации процесса очистки.

В качестве прототипа берется устройство для магнитной сепарации клеток MaxSep.

Цель изобретения заключается в повышении степени очистки с одновременным ускорением процессов инкубации и фракционирования клеток.

Поставленная цель достигается тем, что в известном устройстве магнитной сепарации клеток MaxSep, состоящем из контейнера с суспензией клеток кроветворной системы и иммуномагнитным сорбентом, контейнера с физиологическим раствором, контейнера для сбора антиген-позитивных (АГ+) клеток и контейнера для сбора физраствора с антиген-негативными клетками, соединенных эластичными трубками, блока магнитной системы, блока управления, введены блок перемешивания суспензии клеток с иммуномагнитным сорбентом, блок термоэлементов и блок регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента, блок электромагнитных клапанов, контейнер с ферментом, блок дозированной подачи фермента, блок термоэлементов с блоком регулирования и поддержания температуры физраствора.Антиген-позитивные (АГ+) клетки имеют на поверхности дертиминанту,специфичную для моноклональных антител, привязанных к иммуномагнитному сорбенту.Все остальные клетки,не несущие такие детерминанты,являются антиген-негативными (АГ-).

При этом выходы блока управления соединены со входами блока электромагнитных клапанов, блока перемешивания с закрепленным на нем контейнером с суспензией клеток и иммуномагнитным сорбентом, блока дозированной подачи ферментов, блока магнитной системы, блока регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента и блока регулирования и поддержания температуры физраствора, выход блока регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента соединен со входом блока термоэлементов суспензии клеток иммуномагнитного сорбента, закрепленного с блоком перемешивания.

Выход блока регулирования и поддержания температуры физраствора соединен со входом блока термоэлементов физраствора, с закрепленным на нем контейнером для физраствора. Выход блока дозированной подачи ферментов соединен со входом контейнера ферментов, выход которого соединен посредством эластичной трубки с контейнером суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента.

Предлагаемые технические решения позволяют получить следующие преимущества по сравнению с имеющимися аналогами и прототипом: повышение степени очистки с одновременным ускорением процессов инкубации и фракционирования клеток достигаемое введением блока для перемешивания суспензии клеток с иммуномагнитным сорбентом и устройства для нагрева и регулирования температуры суспензии клеток, с одновременной возможностью многократного повторения процесса очистки с использованием одного и того же комплекта контейнеров; возможность проведения как позитивной, так и негативной селекции клеток; низкая вероятность повреждения АГ+ клеток в результате задания и поддержания необходимой температуры в процессе очистки; полная автоматизация процесса очистки, в результате чего уменьшается время очистки;
единый технологический процесс при позитивной селекции, включающий сцепление АГ+ клеток с иммуномагнитным сорбентом, очистка их от АГ- клеток, дальнейшее разделение АГ+ клеток от иммуномагнитного сорбента, проводимое в автоматическом режиме, приводит к повышению стерильности и уменьшению повреждения АГ+ клеток. На фиг. 1 приведена блок-схема предлагаемого устройства;на фиг.2- циклограмма.

Устройство магнитной сепарации клеток состоит из контейнера с физраствором 1, контейнера АГ+ клетками 2, контейнера с АГ- клетками 3, эластичных трубок 4 и 5, блока термоэлементов 6 с блоком регулирования и поддержания температуры физраствора 7, блока электромагнитных клапанов 8, контейнера с ферментом 9, блока дозированной подачи фермента 10, блока магнитной системы 11, контейнера с суспензией клеток и иммуномагнитного сорбента 12, блока перемешивания 13, блока термоэлементов 14 с блоком регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента 15, блока управления 16.

В качестве контейнеров 1, 2, 3 и 12 могут использоваться пластмассовые стерильные мешки (пакеты) для хранения препаратов крови, выпускаемые заводом "Синтез" г. Курган или фирмы Hambro. В качестве эластичных трубок 4, 5 для соединения контейнеров используются выпускаемые серийно полихлорвиниловые трубки. Термоэлементы 6, 14 в зависимости от задаваемой температуры нагрева могут быть выполнены в виде обычного нагревательного элемента (например, спирали) или с использованием термоэлектрических элементов типа "Пельтье". Питание термоэлементов осуществляется от интегрального стабилизатора, выполненного, например, на микросхемах серии 142 и двух- составных транзисторов.

Устройство блоков 7 и 15 регулирования и поддержание температуры физраствора, суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента аналогично, собраны на двух операционных усилителях и формируют пропорциональный закон изменения регулирующего воздействия. На первом операционном усилителе собран формирователь сигнала ошибки регулирования, на втором суммирующий усилитель.

Данная схема регулирования имеет две особенности: первая формирователь ошибки регулирования собран по мостовой схеме на операционном усилителе с демпфирующим звеном, вторая управление температурой осуществляется через цепь обратной связи интегрально-стабилизированного источника питания. В качестве термодатчиков применен транзистор, включенный по диодной схеме. Термодатчики располагаются на контейнерах с суспензией и физраствором.

Блок электромагнитных клапанов состоит из четырех идентичных электромагнитов, подвижные сердечники которых по командам с блока управления открывают или закрывают эластичные трубки, по которым поступает соответствующий состав. В качестве контейнера 9 с ферментом используется, например, одноразовый стерильный шприц.

Блок дозированной подачи фермента 10 представляет управляемый привод, выполненный, например, на шаговом двигателе, который по команде с блока управления перемещает с помощью штока поршень шприца.

Блок для перемешивания 13 представляет собой поворотное основание с закрепленным на ней контейнером с суспензией клеток и иммуномагнитным сорбентом. Основание блока перемешивания имеет опоры, относительно которых контейнер может прокачиваться по командам с блока управления 16 и приводимым в движение управляемым приводом, выполненным, например, на шаговом двигателе.

Блок управления 16 представляет из себя программное устройство, выполненное с применением однокристального процессора, обеспечивающее цикличность работы всех входящих в устройство блоков согласно циклограмме.Кроме того, в блоке управления размещен блок питания, обеспечивающий необходимыми условиями напряжений все электронные и электромеханические узлы.

Устройство магнитной сепарации клеток работает следующим образом. Работу устройства рассмотрим на примере очистки костного мозга путем выделения из него с помощью метода позитивной селекции стволовых клеток, являющихся предшественниками клеток кроветворной системы (СД34+), осуществляемой в соответствии с циклограммой, приведенной на фиг. 2. Определенное количество костного мозга (100-300 мл в зависимости от массы тела больного) помещают в контейнер 12, разбавляют с использованием физиологического раствора и противосвертывающих препаратов (например, гепарин). Далее в приготовленный раствор помещают иммуномагнитный сорбент, состоящий из магнитоуправляемых капсул (частицы железа, покрытие полистиролом), связанных с моноклональными антителами, специфичных к стволовым клеткам костного мозга (СД34+). Соединяют контейнер 12 с контейнерами 1, 2, 3 и 9 с помощью эластичных трубок с соблюдением требований стерильности. При этом эластичные трубки 4 и 5 пережаты пружинами электроклапанов 8. Контейнер 1 устанавливают на блок термоэлементов 6, а контейнер 12 на блок перемешивания 13 с закрепленным на нем также блоком термоэлементов 14. Соединяют контейнер с ферментом 9 с блоком дозированной подачи фермента 10. После включения напряжения питания начинается работа устройства в автоматическом режиме в соответствии с циклограммой (фиг. 2). Система перемешивания (прокачка контейнера) 18 начинает функционировать одновременно с включением системы нагрева суспензии и физраствора 17 для уменьшения времени выхода на режим стабилизации и исключения локальных перегревов суспензии. Таким образом происходит процесс инкубации, т.е. магнитоуправляемые капсулы с моноклональными антителами в силу специфичности сцепляются только со ствольными клетками костного мозга (СД34+).

На 20-й минуте включается магнитная система, в результате чего сорбент с СД34+ клетками притягивается. Через 20 мин (на 40-й минуте) открывается электроклапан слива отстоя 20 и в течение 2 мин происходит слив жидкости с СД34- клетками в контейнер 3. На 42-й минуте открывается клапан долива физиологического раствора 21 с закрытием клапана слива отстоя 20 и происходит наполнение контейнера 12 физиологическим раствором из контейнера 1.

Далее происходит перемешивание суспензии в контейнере 12 в течение 1-й минуты с последующим включением магнитной системы 19 и сливом жидкости с СД34- клетками в контейнер 3. Эта процедура происходит три раза с целью повышения степени очистки костного мозга.

После этого на 63-й минуте происходит долив физиологического раствора через открывающийся на 0,2 мин клапан долива физраствора 21 с одновременным включением прокачки контейнера 18. На 64-й минуте открывается электроклапан долива фермента 22 в контейнер с суспензией 12 с необходимым количеством фермента. С началом введения фермента происходит перемешивание (прокачка) контейнера 18, при этом происходит отделение под воздействием фермента СД34+ клеток от иммуномагнитного сорбента. Далее включается электроклапан долива физраствора 21 и в контейнер с суспензией добавляется еще физиологический раствор для прекращения действия фермента с одновременным включением магнитной системы для притяжения магнитоуправляемых капсул.

Таким образом, отделение от магнитоуправляемых капсул СД34+ клетки через открывающийся электроклапан 23 слива чистого продукта помещаются в контейнер для чистого продукта. Полученные в результате очистки СД34+ клетки при необходимости могут быть сразу использованы для аутотрансплантации или помещены на длительное хранение в камеру глубокого охлаждения.

Работа устройства для разделения клеток в случае негативной селекции происходит аналогичным образом, только в этом случае подача фермента в суспензию с клетками не производится, а специфичные антитела с магнитоуправляемыми капсулами сцепляются с АГ- клетками.

ЦНИИТОЧМАШ, ОНЦ РАМН и ГНИИХТЭОС в соответствии с договором с Минздравмедпром РФ разработан и изготовлен экспериментальный образец устройства магнитной сепарации клеток (ОКР "Сортер") и лабораторные образцы иммуномагнитного сорбента. В процессе экспериментальных исследований и предварительных испытаний было показано, что система обеспечивает высокую степень очистки аутотрансплантата костного мозга (до 99,9%),что практически исключит рецидив заболевания при трансплантации.

Формула изобретения

Устройство магнитной сепарации клеток, содержащее контейнер с суспензией клеток кроветворной системы и иммуномагнитным сорбентом, контейнер с физраствором, контейнер для сбора антиген-позитивных клеток и контейнер для сбора физраствора с антиген-негативными клетками, соединенные с помощью эластичных трубок, блок магнитной системы и блок управления, отличающееся тем, что в него введены блок для перемешивания суспензии клеток с иммуномагнитным сорбентом, блок термоэлементов с блоком регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента, блок электромагнитных клапанов, контейнер с ферментом, блок дозированной подачи фермента, блок термоэлементов с блоком регулирования и поддержания температуры физраствора, при этом выходы блока управления соединены с входами блока электромагнитных клапанов, блока перемешивания с закрепленным на нем контейнером с суспензией клеток и иммуномагнитным сорбентом, блока дозированной подачи ферментов, блока магнитной системы, блока регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента и блока регулирования и поддержания температуры физраствора, выход блока регулирования и поддержания температуры суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента соединен с входом блока термоэлементов суспензии клеток и иммуномагнитного сорбента, закрепленного на блоке перемешивания, выход блока регулирования и поддержания температуры физраствора соединен с входом блока термоэлементов физраствора, с закрепленным на нем контейнером с физраствором, выход блока дозированной подачи ферментов соединен с входом контейнера с ферментом, выход которого соединен посредством эластичной трубки с контейнером с суспензией клеток и иммуномагнитным сорбентом.

РИСУНКИ

Рисунок 1