Рекомбинантная плазмидная днк purvgf, определяющая синтез фактора роста вируса осповакцины штамма л-ивп совместно с бета - галактозидазой escherichia coli, и штамм бактерий escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк purvgf - продуцент фактора роста вируса осповакцины штамма л-ивп

 

Использование: биотехнология, разработка препаратов, вызывающих пролиферацию клеток, которые могут быть использованы для заживления ран. Сущность: конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, определяющей синтез фактора роста вируса осповакцины (ФРВО), и получение штамма, содержащего указанную плазмиду. Штамм используют в качестве продуцента ФРВО, слитого с бета-галактозидазой. Рекомбинантный ФРВО в перспективе может быть применен в качестве митогена клеток эпителиального происхождения. 2 с.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к биологически активным веществам и способам их получения методами генетической инженерии.

Как стало известно, фактор роста вируса осповакцины (VGF) отнесен к семейству EGF-подобных факторов [1] Зрелая молекула VGF имеет 35%-ную аминокислотную гомологию с эпидермальным фактором роста (EGF) и связывается с рецепторами EGF на поверхности клеток, вызывая пролиферацию клеток [2] В обычных условиях VGF продуцируется вирусом осповакцины при его репродукции в культурах клеток, причем количество этого белка в культурной среде чрезвычайно мало, а метод его очистки из культурной среды сложен и требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Создание бактериального продуцента VGF позволит получать его в препаративных количествах и очищать до гомогенного состояния, используя относительно простую методику очистки.

В литературе описан ген VGF штамма WR-вируса осповакцины, а также положительное влияние данного фактора, выделенного из культуральной среды клеток, инфицированных вирусом осповакцины, или синтезированного химическим путем, на пролиферацию клеток in vitro [4,6] Известен также ген, кодирующий в составе Hind III G-фрагмента ДНК вакционного штамма Л-ИВП вируса осповакцины фактор роста вируса осповакцины [3,5] Ген VGF выделен из клонового варианта (клон 4) штамма Л-ИВП вируса осповакцины отличается от гена VGF штамма WR, описанного в литературе [4] четырьмя нуклеотидными заменами в положениях 86, 319, 358, 359. что приводит к заменам аминокислот: в положении 29 серина на лейцин, в положении 107 метионина на валин и в положении 120 лейцина на серин [5, прототип] Однако сведений, касающихся создания рекомбинантных продуцентов VGF, пригодных для наработки данного белка в препаративных количествах, не имеется.

Целью изобретения является создание рекомбинантного штамма бактерий E. coli-продуцента VGF осповакцинного штамма Л-ИВП клона 4 в виде химерного белка.

Поставленная цель достигается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК pUR VGF, кодирующей синтез VGF, которая имеет размер 5,419 н.п. и состоит из следующих элементов (фиг. 1): векторной части в виде Hind III BamH I фрагмента плазмиды pUR 290 размером 5,186 н.п. содержащей ген LacZ с собственным промотором Иbla-ген.

BamHI Hind III-фрагмента, размером 233 н.п. содержащего последовательность открытой рамки трансляции (ОРТ) гена VGF-вируса осповакцины штамма Л-ИВП без последовательностей, кодирующих сигнальную и трансмембранную части гена VGF (фиг. 3) Плазмидная ДНК pUR VGF содержит уникальные сайты рестрикции для ферментов BamHI, Hind III, Tag I, Ava II, Alu I, Nla III, Cla I.

Для достижения поставленной цели используют способ конструирования плазмиды pUR VGF, заключающийся в том, что векторную часть, полученную расщеплением плазмидной ДНК pUR 290 эндонуклеазами рестрикции BamH I Hind III, сливают с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с фрагментом ДНК вируса осповакцины, обработанного этими же эндонуклеазами, который был предварительно амплифицирован методом полимеразной цепной реакции с использованием предварительно синтезированных праймеров, комплементарных терминальным последовательностям участка ДНК вируса осповакцины, кодирующим зрелый VGF. Дополнительно к этому в начало гена VGF вводят сайт, кодирующий кислотолабильную связь, и в конец гена стоп-кодон, а также вводят сайты рестрикции для эндонуклеаз Hind III BamH I.

Существенным достоинством предлагаемого способа является то, что с его помощью достигается экспрессия вирусспецифического белка VGF в клетках E.coli. Ген белка VGF находится в одной рамке считывания с геном LacZ, что обеспечивает синтез химерного полипептида с мол. м. 126 кДа, состоящего из бета-галактозидазы и белка VGF, соединенных кислотолабильной связью.

Плазмида pUR VGF в литературе не описана и впервые получена в настоящей работе.

Для получения штамма-продуцента E. coli компетентные клетки штамма ВМН7118 трансформируют рекомбинантной плазмидой ДНК. Штамм-продуцент ВМН7118 отличается от исходного только по признакам, передаваемым плазмидой, т.е. является устойчивым к ампициллину и синтезирует химерный белок 126кДа, состоящий из бета-галактозидазы E. coli и белка VGF и обладающий бета-галактозидазной активностью. Выход VGF составляет 6 мг/г бактериальных клеток. Полученный бактериальный штамм-продуцент зарегистрирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики под номером ВКП/М В-6566.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

1. Морфологические признаки Клетки прямые, палочковидной формы, 1,2х1,6х2,0-6,0 мкм, подвижные (с перитрихиальными жгутиками), грамотрицательные, неспороносные.

2. Культуральные признаки Клетки хорошо растут на простых питательных средах, оптимальная температура роста 30-37^oC, pH 6,8-7,5.

При росте на мясопептонном и рыбном агаре развиваются в виде гладких, круглых, блестящих, серых, мутных колоний с ровными краями. При работе в жидких средах вызывают равномерное помутнение с образованием осадка.

3. Физиолого-биологические признаки Оптимальная температура культивирования 37^oC, оптимум pH 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной или нитратной формах, так и органические соединения пептон, аминокислоты.

4. Устойчивость к антибиотикам Проявляет устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды pUR VGF при концентрации последнего 70 100 мг/л.

5. Стабильность плазмиды в штамме
При поддержании клеток штамма в течение 1,5 лет на рыбном агаре при +40^o C или в 30%-ном глицерине при -70^o C в присутствии ампициллина не наблюдается перестройка или потеря плазмидной ДНК.

Сущность изобретения заключается в том, что в результате клонирования гена VGF вируса осповакцины штамма E.coli ВМН 7118 рекомбинантной плазмидой ДНК pUR VGF получают штамм-продуцент ВМН pUR VGF, в котором проводят наработку химерного полипептида 126 кДа (бета-галактозидаза-VGF), положительно реагирующего с моноспецифической сывороткой на синтезированный пептид, соответствующий 20-33 аминокислотным остаткам N-конца молекулы зрелого VGF (фиг. 2).

На фиг. 1 показана физическая карта плазмиды pUR VGF; на фиг. 2 - иммуноблотинг лизата клеток штамма E.coli ВМН 7118 после трехчасовой индукции ИПТГ (изопропил-тио-бета-D-галактопиранозид) с моноспецифической антисывороткой кролика, полученной к синтезированному пептиду (20-33 аминокислотные остатки N-конца зрелого VGF).

Дорожки:
1 белки клеток E.coli, трансформированных плазмидой pUR VGF, разделенные электрофорезом в 8%-ном ПААГ;
2 белки клеток pUR 290, трансформированных плазмидой pUR 290, разделенные электрофорезом в 8%-ном ПААГ.

На фиг. 3 приведена нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый VGF.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pUR VGF.

Используя синтетические олигонуклеотиды-праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и вирусную ДНК (штамма Л-ИВП), получают фрагмент ДНК, кодирующий зрелый VGF. Параметры полноразмерной цепной реакции следующие: отжиг - 37^o, 1 мин; элонгация 72^o, 1 мин; денатурация 95^o, 1 мин; количество циклов 25; фермент-Tth-полимераза. Структура олигонуклеотидных праймеров:

В последовательности олигонуклеотидов заложены сайты для рестриктаз BamHI и HindIII, а также стоп-кодон.

После амплификации получают 5 мкг ДНК-фрагмента с подвижностью в ПААГ около 230 п.н. Указанный фрагмент ДНК обрабатывают ферментами BamHI и HindIII в стандартных условиях (50мМ NaCl, 10мМх2 меркаптоэтанола, 10мМ MgCl₂, 10мМ трис HCl, pH 7,5); реакцию останавливают добавлением 0,5 м ЭДТА (5 мкл на 100 мкл смеси), удаляют рестриктазы фенолом и из водной фазы осаждают ДНК, как описано в[7]
Вектор готовят следующим образом: 5 мкг ДНК pUR 290 разрезают в стандартных условиях BamHI и HindIII рестриктазами по методу, изложенному в [7] и наносят 5% ПААГ. Выделяют полосу ДНК и растворяют в 50 мкл ТЕ.

Векторную ДНК (0,05 мкг) и фрагмент (1 мкг) сшивают с Т4-ДНК-лигазой [7] Рекомбинантные клоны отбирают рестрикционным анализом. Компетентные клетки готовят из штамма E.coli JM109.

Пример 2. Получение штамма продуцента E.coli BMH 7118.

Бактериальные клетки E. coli JM109, содержащие плазмидную ДНК pUR VGF, выращивают в 4 мл L-бульона с ампициллином в концентрации 40 мкг/мл до титра 5х108 кл/мл. Плазмидную ДНК выделяют щелочным методом [3] и ретрансформируют в клетки E. coli штамма BMH 7118. Полученный штамм подвергают анализу на наличие плазмидных маркеров.

1. Резистентность к ампициллину.

Клетки штамма E. coli ВМН7118 высевают на агаризованную среду с содержанием антибиотика от 10 до 100 мкг/мл. Рост данных клеток не ингибируется до концентрации 100 мкг/мл.

2. Экспрессия химерного полипептида 126 кДа.

Клетки штамма E.coli ВМН7118 индуцируют ИПТ Г (IOE-3 M) и лизируют в 3% ДСН (50 мМ 2-меркаптоэтанола; 20 мМ Трис-HCl pH 6.8; 30% сахарозы 5 мл) при 95^oC. Денатурированные полипептиды разделяют диск-электрофорезом в 8% ПААГ и выявляют с помощью Кумасси R-250. Молекулярную массу химерного полипептида 126 кДа рассчитывают по электрофоретической подвижности.

3. Ферментальная активность химерного полипептида 126 кДа.

Клетки штамма высевают на агаризованную среду, содержащую 40 мкг/мл ампициллина, 0,1 мг/мл Х-gal, 0,1 мкг/мл ИПТ Г. Колонии штамма E.coli JM109 имеют синий цвет.

4. Формирование АГ-АТ-комплекса химерного белка 126 кДа с моноспецифической антисывороткой к синтезированному пептиду (20-33 аминокислотные остатки зрелой молекулы VGF) иммуногенные свойства химерного белка 126 кДа подтверждают в реакции иммуноблотинга (фиг.2), как описано ниже.

Пример 3. Иммунохимический анализ химерного полипептида 126 кДа.

Бактериальный штамм E. coli BMH pUR VGF подращивают до Д550 0,6 о.е. и после добавления ИПТ Г до 50 мкг/мл выращивают 3 ч при 37^oC, активно перемешивая. 1 мл культуры клеток центрифугируют 3 мин при 6000 осадок суспендируют в 100 мкл 3% ДСН; 5% мМ 2-меркаптоэтанола; 20 мМ Трис-HCl pH 6.8; 30% сахарозы и кипятят 1 мин; озвучивают; 1/10 часть полученного раствора разделяют в 8% ПААГ и проводят перенос полипептидов на нитроцеллюлозу. Фиксированный белковый препарат инкубируют в 1% растворе БСА, затем при комнатной температуре инкубируют с моноспецифической кроличьей антисывороткой против синтезированного пептида 1 ч в 150 мМ NaCl; 20 мМ Трис-HCl, pH 7,7; 0,2% тритон Х-100. Отмывают трижды в буфере этого состава и инкубируют 1 ч с пероксидазным конъюгатом белка А. После отмывания в буфере окрашивают АГ-АТ-комплекс с помощью 3,3-диаминобензинаидин HCl.

Изобретение позволяет получать VGF в миллиграммовых количествах и исследовать его иммунологические и биологические свойства.

Полученный продуцент рекомбинантного VGF может быть использован для изучения взаимодействия этого фактора роста с мембранными рецепторами, получения антител к VGF и в перспективе возможно использование рекомбинантного VGF, полученного в клетках E.coli как митогена, вызывающего пролиферацию клеток эпителиального происхождения in vivo и in vitro.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен штамм-продуцент E. coli, экспрессирующий фактор роста вируса осповакцины. Дальнейшие исследования этого белка позволят создать базу для использования его в лечении ожоговой болезни и для заживления трудно заживаемых трофических язв и ран.

Литература
Stroobant R. Rico A.P. Gullick W.J. et al,Cell,1985, V.42, P. 383-393.

Schulz G. White M. Mitchell N. Science. 1987, V. 235, N4786, P. 80-82.

Петров В.С. Хромых А.А. Дмитриев И.П. и др. Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии: Материалы всесоюзной конф. Тарту, 1989, т. I, c. 171-174.

Venkatesan S. Gershowitz A. Moss B.J. of Virology, 1982, V.44, P. 637-646.

Петров В.С. Чешенко Н.В. Белавин П.А. и др. Биотехнология, 1992, N5, с. 35-39.

Lin J. Caporaso C. Ke X. H.Tam.J. of Biol. Chemistry, 1990,V. 265, N.31, P. 1881-1890.

Маниатис Т. Фрич З. Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М. Мир, 1984.

Салганик Р. И. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск "Наука" 1990.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pURVGF, определяющая синтез фактора роста вируса осповакцины штамма Л-ИВП совместно с бета-галактозидазой Escherichia coli, размером 5419 п.о. содержащая Bam HI Hind III фрагмент ДНК плазмиды pUR 290 размером 5186 п.о. соответствующий гену устойчивости к ампициллину и гену бета-галактозидазы, Bam HI Hind III фрагмент генома вируса осповакцины размером 233 п.о. включающий участок гена фактора роста вируса осповакцины, кодирующий зрелый полипептид, один сайт расщепления для рестриктазы Bam HI, один сайт расщепления для рестриктазы Tag I, расположенный на расстоянии 17 п.о. от Bam HI-сайта, один сайт расщепления для рестриктазы Alu I, расположенный на расстоянии 64 п.о. от Bam HI-сайта, один сайт расщепления для рестриктазы Ava II, расположенный на расстоянии 79 п.о. от Bam HI-сайта, два сайта расщепления для рестриктазы Nla III, расположенные на расстоянии 160 п. о. и 187 п.о. от Bam HI-сайта, один сайт расщепления для рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 245 п.о. от Bam HI-сайта, один сайт расщепления для рестриктазы Cla I, расположенный на расстоянии 246 п. о. от Bam HI-сайта, генетический маркер: ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В 6566, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pURV6 F продуцент фактора роста вируса осповакцины штамма Л-ИВП.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3