Способ определения концентрации конъюгированного билирубина в сыворотке крови

 

Использование: аналитическая биохимия, клиническая биохимия, для определения концентрации конъюгированного билирубина в сыворотке крови. Сущность изобретения: исследуемую сыворотку крови инкубируют с диазореактивом в кислой среде, добавляют реагент, блокирующий реакцию диазотирования свободного билирубина, и измеряют оптическую плотность смеси, при этом в качестве реагента, блокирующего реакцию диазотирования свободного билирубина, добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,007 - 1,0 мас. %/об. Способ позволяет упростить процесс определения конъюгированного билирубина при сохранении высокой точности. 1 ил.

Изобретение относится к аналитической биохимии, конкретно к клинической биохимии, и может быть использовано в медицине для диагностики заболеваний различной этиологии.

Известно, что в сыворотке крови билирубин присутствует в виде двух основных форм: свободной и конъюгированной с глюкуронидом. Свободный билирубин (СБ) нерастворим в воде, его содержание в сыворотке крови (обычно в виде комплекса с альбумином) составляет в норме 6,5 15,5 мкмоль/л. Конъюгированный билирубин (КБ) является водорастворимым соединением, его содержание в сыворотке крови в норме составляет 2,2 5,1 мкмоль/л. Повышенное содержание СБ, КБ или обеих форм одновременно отражает различные патологические процессы в организме и является важным признаком для диагностики различных заболеваний. В связи с этим, разработка способа определения концентрации КБ является актуальной.

В настоящее время в клинической практике наиболее часто применяются колориметрические методы определения концентрации билирубина. Они основаны на реакции билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой (или другими диазосоединениями) с образованием продукта диазобилирубина, окрашенного в красный цвет в кислой среде и в голубой в щелочных растворах. Интенсивность окраски раствора пропорциональна содержанию билирубина. Непосредственно в водных растворах с диазореактивом достаточно быстро реагирует преимущественно КБ (т. н. "прямая реакция"), СБ в силу низкой водорастворимости в прямую реакцию не вступает (или реагирует довольно медленно). При добавлении к реакционной смеси некоторых веществ (кофеина, органических растворителей, детергентов и т. д.), увеличивающих растворимость СБ, последний реагирует с диазореактивами наравне с КБ (т. н. "непрямая реакция"). По разнице между содержанием общего билирубина и КБ вычисляют концентрацию СБ. Таким образом, точность способа определения концентрации КБ влияет и на точность определения концентрации СБ.

Известен способ [1] определения концентрации КБ, заключающийся в следующем: 1) тестируемый образец смешивают с физиологическим раствором; 2) к смеси добавляют диазосульфаниловую кислоту; 3) через 10 мин осуществляют фотометрирование пробы при длине волны 500 560 мм; 4) расчет концентрации КБ производят путем сопоставления измерения оптической плотности с градуировочным графиком, построенным с помощью калибровочных образцов билирубина.

Известный способ обладает рядом недостатков, наиболее существенным из которых является низкая точность определения концентрации КБ, обусловленная следующими причинами: a) в условиях реакции по известному способу за время, необходимое для количественного диазотирования КБ (10 мин), диазотируется также до 10 СБ, что дает завышение содержания КБ на 30 50 б) в условиях реакции по известному способу количество диазотированного СБ увеличивается пропорционально времени реакции, в связи с этим, несоблюдение фиксированной продолжительности реакции (10 мин), как правило наблюдаемое при анализе большого количества проб, приводит к невоспроизводимости результатов определения концентрации КБ, связанной с постоянным изменением концентрации суммарного диазобилирубина в реакционной смеси; в) в ряде случаев для увеличения чувствительности определения содержания билирубина после окончания реакции диазотирования к реакционной смеси добавляют раствор щелочного тартрата. В известном способе такой подход не может быть реализован, поскольку при добавлении щелочного реактива резко возрастает реакционноспособность СБ. В результате определение точной концентрации КБ становится невозможным.

Эти недостатки устранены в способе [2] наиболее близком к предлагаемому, заключающемся в следующем: 1) готовят 4-ный раствор аскорбиновой кислоты;
2) тестируемый образец смешивают с 50 мм соляной кислоты;
3) к смеси добавляют диазореактив;
4) точно через 10 мин к смеси добавляют 4-ный раствор аскорбиновой кислоты (до конечной концентрации 0,12) для блокирования реакции диазотирования СБ;
5) к смеси добавляют раствор щелочного тартрата;
6) измеряют оптическую плотность в реакционной смеси при 600 мм;
7) вычисляют концентрацию КБ по коэффициенту экстинкции диазобилирубина или сопоставляя измеренную оптическую плотность с градуировочным графиком. Ошибка при определении концентрации КБ не превышает 5
Недостатком прототипа является сложность способа, обусловленная тем, что для блокирования реакции диазотирования СБ используют нестойкий реагент 4-ный раствор аскорбиновой кислоты. Этот реагент плохо хранится и быстро теряет в растворе свои свойства под действием внешних факторов (кислорода воздуха, освещения и т. д.). В связи с этим, раствор аскорбиновой кислоты необходимо готовить ежедневно [2] что усложняет способ определения КБ.

Технической задачей изобретения являются упрощение способа определения концентрации КБ.

Решение поставленной задачи достигается за счет того, что в качестве реагента для блокирования реакции диазотирования СБ используется азид натрия, добавляемый к реакционной смеси до экспериментально подобранной оптимальной конечной концентрации 0,0005 0,1 Водные растворы азида натрия весьма стабильны [3] и являются распространенным консервантом, обеспечивающим длительное хранение различных биохимических препаратов [4]
Сущность предлагаемого способа определения концентрации КБ заключается в следующем:
1) тестируемый образец смешивают с 50 мМ соляной кислоты;
2) к смеси добавляют диазореактив;
3) точно через 10 мин к смеси добавляют раствор азида натрия (до конечной концентрации 0,005 1,0) для блокирования реакции диазотирования СБ.

Далее концентрацию КБ определяют известными стадиями:
измеряют оптическую плотность при 535 540 нм и вычисляют концентрацию КБ по коэффициенту экстинкции диазобилирубина в кислой среде или сопоставляя с градуировочным графиком;
добавляют раствор щелочного тартрата, измеряют оптическую плотность при 600 нм и вычисляют концентрацию КБ по коэффициенту экстинкции диазобилирубина в щелочной среде или сопоставляя с градуировчным графиком;
добавляют раствор других известных реактивов и определяют концентрацию КБ аналогично вышеизложенному.

При клинических исследованиях в зависимости от приборного обеспечения для обработки результатов анализа и расчета концентрации билирубина пользуются двумя подходами:
а) при работе на фотометрическом оборудовании с узкой спектральной щелью, дающей высокую степень монохроматичности светового пучка (спектрофотометры и спектрофотоколориметры), концентрацию билирубина рассчитывают непосредственно из результатов измерения оптической плотности, используя коэффициент экстинкции азобилирубина. Коэффициент экстинкции азобилирубина известен из информационных источников. В кислых и нейтральных средах (- 530 нм) коэффициент молярной экстинкции равен 53000 л/моль.см [5] В щелочных условиях (- 600 нм) он составляет 73500 л/моль.см [6] При одинаковых условиях измерения экстинкции диазотированных конъюгированного и свободного билирубина совпадают. Формула расчета концентрации конъюгированного билирубина приведена ниже в примере 1;
б) при работе на фотоколориметрическом оборудовании с широкой щелью (фотоколориметры) концентрацию билирубина рассчитывают, сопоставляя результаты измерения оптической плотности исследуемого образца с градуировочным графиком. Для построения градуировочного графика используют калибровочные образцы с известной концентрацией билирубина (см. например, кат. N 550-11 фирмы "Sigma", США). Измерения проводят в условиях выбранной методики проведения реакции определения билирубина. По оси абцисс откладывают значения концентрации билирубина в калибровочных образцах, по оси ординат - соответствующие им значения оптической плотности.

Принципиальным отличием предлагаемого способа от прототипа является использование для блокировки реакции диазотирования СБ стабильного реагента азида натрия в экспериментально подобранной оптимальной концентрации 0,005 - 1,0 Это позволяет упростить способ за счет устранения стадии ежедневного приготовления 4-ного раствора аскорбиновой кислоты при сохранении точности способа.

На чертеже представлена зависимость эффективности блокирования реакции диазотирования билирубина от концентрации азида натрия в реакционной смеси.

Из чертежа видно, что при концентрациях азида натрия, превышающих 0,005 диазотирование билирубина блокируется более, чем на 90 При уменьшении концентрации азида натрия менее 0,005 эффективность блокирования реакции снижается ниже 90 Увеличение концентрации азида натрия более 1,0 нецелесообразно, поскольку не приводит к увеличению эффективности блокирования реакции диазотирования билирубина.

Экспериментально установлено, что наличие в реакционной смеси азида натрия в концентрации 0,005 1,0 не влияет на оптическую плотность диазобилирубина. При этом оптическая плотность сохраняется неизменной, по крайней мере, в течение 1 ч после добавления к реакционной смеси азида натрия в концентрации 0,005 1,0 Исходный раствор азида натрия, используемый для добавления к реакционной смеси, весьма стабилен и сохраняет свои свойства, по крайней мере, в течение 1 года при хранении при комнатной температуре. Более длительные сроки хранения еще продолжают исследоваться.

В связи с тем, что использование существенных признаков предлагаемого способа в известных научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данное техническое решение обладает новизной и отвечает критерию "существенные отличия".

Пример 1. Для проверки точности предлагаемого способа в качестве анализируемого материала используют калибровочный образец билирубина производства фирмы "Сигма" (США) с аттестованным значением концентрации КБ, равным 43 мкмоль/г, и концентрации СБ, равным 43 мкмоль/л.

Готовят реагенты для определения концентрации КБ:
А) раствор, содержащий 50 мМ соляную кислоту;
Б) раствор, содержащий 29 мМ сульфаниловую кислоту и 47 м соляную кислоту;
В) раствор, содержащий 72 мМ нитрит натрия;
Г) раствор, содержащий 0,3-ный азид натрия (по массовой доле).

Все реагенты, за исключением В), стабильным в течение 1 года при комнатной температуре. Реагент В) стабилен в течение 1 месяца при температуре 2 10^oC.

Непосредственно перед проведением анализа готовят диазореактив, смешивая 10 мл реагента Б) и 0,25 мл реагента В).

Для проведения анализа готовят две пробы: тестовую и контрольную. Тест-пробу готовят следующим образом:
1) 0,1 мл анализируемого материала смешивают с 0,8 мл реагента "А";
в) добавляют 0,2 мл диазореактива;
3) точно через 10 мин добавляют 0,1 мл реагента Г) (до конечной концентрации азида натрия 0,025);
4) измеряют оптическую плотность при длине волны 535 нм.

Контрольную пробу готовят аналогичным образом, но вместо диазореатива в реакционную смесь добавляют 0,2 мл реагента Б).

Концентрацию КБ (С, мкмоль/л) вычисляют по формуле
,
где A разность оптических плотностей между тестовой и контрольной пробами (A 0,196);
V объем реакционной смеси (V 1,2), мл;
v объем аликвоты анализируемого материала (v 0,1), мл;
e коэффициент экстинкции диазобилирубина в кислой среде (e 0,053), л/мкмоль·см;
l толщина кюветы спектрофотометра (l 1,0), см.

Концентрация КБ, определенная с помощью предлагаемого способа, составляет 4463 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения концентрации КБ не превышает 3
Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что готовят реагент Г), содержащий 0,06 азида натрия, что соответствует 0,005-ной концентрации последнего в реакционной смеси.

A 0,200. Определенная концентрация КБ составляет 4562 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения не превышает 5
Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что готовят реагент Г), содержащий 12 азида натрия, что соответствует 1,0-ной концентрации последнего в реакционной смеси.

A 0,195. Определенная концентрация КБ составляет 44,1 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения не превышает 3
Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что дополнительно:
а) готовят реагент Д), содержащий 1,13 М калий, натрий виннокислый и 1,88 М гидроокись натрия;
б) после добавления реагента В) к реакционной смеси добавляют 0,5 мл реагента Д) для защелачивания реакционной смеси.

После этого измеряют оптическую плотность при 600 мм и вычисляют концентрацию КБ по формуле (1), используя значение V 1,8 и e 0,075.

A 0,185. Определенная концентрация КБ составляет 44,4 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения не превышает 3
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс определения концентрации КБ при сохранении высокой точности анализа.

Источники информации.

1. А. Я. Любина и др. Клинические лабораторные исследования. М. Медицина, 1984, с. 277 278.

2. Clinical chemistry/Ed. by R.J. Henry et al. 2 nd edition, 1974, p. 1061 1062.

3. Б. В. Некрасов. Основы общей химии. М. Химия. 1965, т. 1, с. 397.

4. Л. А. Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М. Наука, 1985, с. 49.

5. В. Хромы и др. Билирубин. Его клиническое значение и определение. Прага: Ла Хема. 1974, с. 26.

6. Doumas B. T. et al. Clin. chem. 1985. V. 8, p. 105 115.

Формула изобретения

Способ определения концентрации конъюгированного билирубина в сыворотке крови, включающий инкубирование тестируемого образца с диазореактивом в кислой среде, добавление реагента, блокирующего реакцию диазотирования свободного билирубина, и измерение оптической плотности смеси, отличающийся тем, что в качестве реагента, блокирующего реакцию диазотирования свободного билирубина, добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,007 1,0 мас. /об.

РИСУНКИ

Рисунок 1