Способ экспресс-диагностики врожденных инфекций у детей

 

Использование: в медицине, в частности в педиатрии. Сущность изобретения: проводят ферментативное определение антигенов возбудителя герпеса, цитомегалии, токсоплазмоза, краснухи и антител к ним, при этом берут коммерческие диагностикумы для РСК и соединяют в равных объемах с исследуемым материалом, затем добавляют 4 дозы комплемента, а наличие антител и антигена определяют по несвязанному комплементу, выявляемому по каталазной активности лизированных бараньих эритроцитов. Удаление собственного комплемента из исследуемого материала осуществляют сорбцией его на нейтральный комплемент гемолизина и бараньих эритроцитов, обработанных 7,5-15%-ной перекисью водорода с последующим центрифугированием. Способ позволяет в течение 3-4 ч определить антитела или антиген в обследуемом материале количественно по цифровому показателю ферментной реакции. 3 табл.

Способ относится к вирусологии, в частности к экспресс-диагностике вирусных инфекций у детей.

Известны различные способы диагностики вирусных инфекций связанные как с выделением вирусов на различных системах (культуре ткани, куриных эмбрионах, лабораторных животных), так и по выявлению в крови больных нарастания титра антител в ходе инфекционного процесса (Общая и частная вирусология под ред. Жданова В.М. и Гайдамович С.Я. 1982, с.437-462).

Для острых вирусных инфекций характерно как выделение вирусных агентов, так и методы определения антител. Для врожденных и особенно персистирующих инфекций методы выделения вирусов чрезвычайно сложны и поэтому не приемлемы в клинической и диагностической практике. Основными направлениями диагностики врожденных инфекций цитомегалии, герпеса, краснухи, токоплазмоза являются определение антител к данным возбудителям в реакции связывания комплемента, гемагглютинации и иммунофлюоресценции (Hohne-Reich I.Doerr H.W. Die Komlementbindungreaction (KBR) in der Virusregologie: Vergleich mit moderne Immunoassays and ausgewahlten Faeebeispielen. Arzl.Lab. 1984, 30, 5-133-140).

Недостатком данных методов является использование раститровочного способа определения концентрации антител, что снижает уровень и точность методов, а также увеличивает объем и время их проведения. Недостатков также является использование в различных диагностических лабораториях разноплановых реакций, что затрудняет трактовку результатов и возможность одновременной постановки опытов с различными антигенами в одной системе реакций.

В последние годы широко используются реакции иммуноферментного анализа (N go T.T. Lenhoff H.M. Enzyme-mediated Immunoassay, N, γ, 1987). Недостатками этих методов являются отсутствие стандартных диагностикумов для ряда инфекционных форм, а имеющиеся в зарубежных странах диагностикумы достаточно дороги и используются для ограниченного числа материалов. Кроме того, иммуноферментный и радиоиммунные методы имеют ограниченную чувствительность при выполнении метода без разделения компонентов реакции, что вызвано наличием неспецифических веществ в биологических пробах. Для избавления от неспецифики реакции используют дорогостоящие химические реактивы, проводят отмывку матриц, так как при недостаточной обработке выявляется большой процент ложноположительных результатов. Также следует отметить сложность и частую невоспроизводимость этих реакций, что приводит к необходимости контролировать их стандартными диагностическими методами.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ, заключающийся в том, что для диагностики антител к вирусу краснухи используется реакция связывания комплемента (Морган-Капнер, Дж.Паттисон. Методы клинической вирусологии. В кн. Вирусология, ред.Б.Мейхи, с.317-327, 1988). Стандартная реакция состоит из следующих этапов: титрование комплемент и гемолитической сыворотки; титрование связывающего комплемент антигена вируса краснухи с положительной контрольной сывороткой; титрование сыворотки больного (основной опыт), визуальный учет полученных результатов. Способ не отличается от стандартных реакций типа Барде-Жангу, Вассермана и других, однако способ достаточно трудоемкий, и результат зависит от очень точного подбора дозы используемого комплемента и краснушного антигена.

Основным недостатком данного способа является отсутствие количественного учета результатов, так как метод титрования и визуальный учет реакции не дает точную оценку полученных результатов. Кроме того, титрование сывороток в разведении с 1:10 до 1:160 или 1:640 дает достаточный процент ошибок, трудоемок особенно при массовом обследовании значительного числа материала от больных.

Устранению указанных недостатков может помочь предлагаемый способ экспресс-диагностики врожденных инфекций у детей с целью упрощения способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе с помощью ферментативного определения антигенов возбудитителя герпеса, цитомегалии, краснухи и токсоплазмоза и антител к ним предлагаются коммерческие диагностикумы для РСК соединять в равных объемах с исследуемым материалом, затем добавлять 4 дозы комплемента, а наличие антител или антигена определять по несвязанному комплементу выявляемому по каталитической активности лизированных бараньих эритроцитов. Способ по пункту 2 отличается тем, что собственный комплемент удаляется из исследуемого материала сорбцией его на нейтральный комплемент гемолизина и бараньих эритроцитов, обработанных 7,5-15%-ной перекиси водорода с последующим удалением центрифугированием.

Определение уровня антител производят на основе реакции связывания комплемента в сыворотке больного, соединяя ее в разведении 1:10 с равным объемом стандартного производственного или экспериментального антигена с добавлением 4 гемолизирующих доз комплемента. После одночасового контакта при 37^oС на 10 мин. Пробы после этого центрифугируют 1-2 мин при 3000 об/мин и надосадочную жидкость сливают в специальные пробирки для аппарата Abbott, в которых проводят ферментативное определение вышедшего из разрушенных эритроцитов гемоглобина с помощью реактива 3%-ной перекиси водорода и 0,4%-ного раствора ортофенилендиамина, с остановкой реакции 1N H₂SO₄ и учетом интенсивности окраски на аппарате Abbott или спектрофотометре любого класса при длине волны 492 н/м.

Отличительной особенностью данного способа является достижение цели тем, что удаление комплемента в испытуемых сыворотках достигается не прогреванием, где частично может разрушаться структура антител, а с помощью специально приготовленной смеси бараньих эритроцитов, обработанных перекисью водорода и 8-16 доз антибараньей гемолитической сыворотки, что дает возможность удалять комплемент в испытуемой сыворотке без температурного воздействия на присутствующие в ней антитела к врожденной инфекции.

Способ осуществляется следующим образом. Предварительно готовят специальные бараньи эритроциты, обработанные перекисью водорода. Для этого к 20 мл 1,5%-ного раствора эритроцитов в мединалово-вероналовом буфере (МВБ) добавляют равный объем 15%-ного раствора перекиси водорода в МВБ. Смесь выдерживают 10 мин при 37^oС, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-4 мин и осадок взвешивают в исходном (20 мл) объеме МВБ. Далее к 0,5 мл испытуемой сыворотки добавляют 0,5 мл смеси приготовленных эритроцитов с равным объемом 8-16 гемолизирующих доз гемолитической сыворотки (по 0,25 мл каждого ингредиента). Сыворотку с добавленной смесью выдерживают 12-15 мин при 37^oС, затем центрифугируют 2-4 мин при 3000 об/мин, надосадок, не содержащий комплемента, отсасывают (сыворотка при этом считается разведенной 1:2).

Приготовленную таким образом сыворотку, разведенную 1:10, соединяют в объеме 0,05 мл с равным объемом антигена (краснухи, герпеса, цитомегалии, токсоплазмоза и др.), добавляют 0,1 мл раствора комплемента (сыворотка морской свинки, содержащая комплемент в дозе 2 ГД для используемой гемолитической системы). После добавления комплемента пробы выдерживают 60 мин при 37^oС, затем добавляют гемолитическую систему в объеме 0,2 мл, состоящую из 0,1 мл 0,7% нативных бараньих эритроцитов и 0,1 мл гемолитической сыворотки, содержащей 8 ГД, разведенной на МВБ. Контролями к данному опыту являются аналогичное разведение (1: 10) испытуемой сыворотки без добавления антигена (замена его на МВБ), контроль, где антиген присутствует без сыворотки (в аналогичном разведении), и контроль комплемента, где сыворотка и антиген заменены МВБ. Во все контроли также добавляют гемолитическую систему. Добавочно ставится дополнительный контроль комплемента, где его концентрация в 1,5 раза выше, чем в основном опыте 3 ГД в объеме 0,15 мл. Пробы и контроли ставят в термостат или водяную баню при 37^oС на 10-12 мин, до времени полного гемолиза в дополнительном контроле комплемента с увеличенной его дозой. Затем пробы центрифугируют при 3000 об/мин 2-4 мин до оседания эритроцитов и надосадок сливают в специальные пробирки.

Следующий этап способа количественный учет визуально нерегистрируемого гемолиза. Для этого в пробирки с надосадком добавляют 0,5 мл раствора, состоящего из равного количества 3%-ной перекиси водорода и 0,4%-ного раствора ортофенилендиамина в МВБ. Появляющееся через 2-3 мин окрашивание усиливают и фиксируют 1,0 мл 1N H₂SО₄ в дистиллированной воде. Интенсивность полученного розово-коричневого окрашивания измеряют спектрофотометрически при длине волны 492 н/м или на различных аппаратах для иммуноферментного анализа (Abbott, Diaplus и др. ) или на стандартных спектрофотометрах типа СФ-4, СФ-4С, СФ-16, СФ-26 или других марок.Наличие антител считают при 50- и более процентном снижении показателей экстинции в сравнении с контролем исследуемой сыворотки без антигена, или антигена без сыворотки (от меньшего показателя из этих двух контролей). Если необходимо определение титра антител, предварительно титруют сыворотку с известным исходным титром и расчет титра испытуемой сыворотки проводят по сравнению с показателем экстинции этой сыворотки и контрольной (иммунной) в соответствующем разведении 1:10.

Пример 1. Больной Ш.С. 4 мес, история болезни N 1564. Поступил в клинику ЛНИИДИ с диагнозом ОРВИ, ОТИТ, подозрение на врожденную инфекцию. При обследовании больного на наличие антител к вирусу краснухи базовым методом в реакции связывания комплемента выявлен титр антител к краснухе 1:20. При обследовании больного заявляемым способом получены следующие результаты, приведенные в табл.1. Из представленных данных очевидно, что у больного выявлены антитела к вирусу краснухи, которые при калибровочном пересчете по отношению к стандартной иммунной сыворотке к краснухе соответствует титру 1: 160. При дополнительном обследовании матери ребенка была подтверждена врожденная инфекция титр антител к краснухе в крови матери соответствовал 1:320.

Пример 2. Больная Г.Д. 3 года, обследовалась амбулаторно в ЛНИИДИ, с диагнозом хроническая сочетанная вирусно-бактериальная инфекция. При обследовании базовым методом выявлены следующие результаты, приведенные в табл.2.

В реакции непрямой иммунофлюоресценции к токсоплазмозу выявлено слабо-положительной свечение (+).

При обследовании больной предлагаемым способом выявлены следующие показатели, приведенные в табл.3.

У больной обнаружены антитела к антигену токсоплазмоза в титре 1:320, к другим антигенам антитела не выявлены. При дополнительном обследовании матери были выявлены антитела к токсоплазмозу в титре 1:40. Окончательный вирусологический диагноз токсоплазменная инфекция.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества.

1. На первом этапе удаление комплемента из испытуемых сывороток осуществляется не прогреванием при 56^oС 30 мин, когда происходит иногда не обнаруживаемое разрушение структур антител, особенно некоторых фракций IgJ. Этот факт очень важен при врожденных инфекциях, особенно у детей раннего возраста до года, где устойчивость антител к температурному фактору может быть снижена. Введение такого иммунного комплекса эритроциты, обработанные Н₂О₂ + гемолизин, в сыворотку приводит к сорбции на себя комплемента, при этом лизиса эритроцитов не происходит, и поэтому комплемент легко удаляется из сыворотки центрифугированием.

2. Постановка реакции связывания комплемента с использованием одного разведения испытуемой сыворотки и одного разведения антигена с дальнейшей количественной оценкой гемолиза облегчает массовое обследование, так как не нужно титровать сыворотки, уточняет данные испытания, исключая ошибку разведения при титровании, а также дает возможность использования в одной реакции нескольких антигенов вирусов.

3. Способ основан на использовании минимальных доз комплемента и, что важно, субгемолитических эффектax комплемента, что повышает чувствительность метода. Эти субгемолитические эффекты комплемента невозможно определить визуально, и поэтом в предлагаемом способе использовали каталазный эффект гемоглобина. С помощью ферментного перекисного теста определяется гемоглобин по взаимодействию атомарного кислорода с ортофенилендиамином, цвет которого усиливает и закрепляется 1N H₂SO₄. Таким образом, уровень гемоглобина, вышедшего из гемолизированной части эритроцитов, не имеет окраски, или она очень слаба и составляет не более 0,100 ОЕ при 410 н/м. С помощью ферментного теста усиливаются числовые показатели до 0,250-0,500 ОЕ и более для 492 н/м. Этот метод позволяет выявить снижение показателя цветности под действием специфических (несколько молей) антител в иммунном комплексе с антигеном в пределах титра антител от 1:10 до 1:640, что невозможно при визуальном или прямом инструментальном выявлении гемоглобина при таких используемых дозах комплемента.

По сравнению с базовыми аналогами (иммуноферментным или радиоиммунным тестами) способ обладает равной с ИФМ чувствительностью, но обладает рядом преимуществ. Во-первых он более стабилен, не нуждается в длительных отмывках при постановке этапов исследования. Во-вторых, он универсален для различных антигенов. На последующих этапах способ может быть унифицирован с использованием стандартных общих ингредиентов (комплемент, гемолизин, перекись водорода, ортофенилдиамин Харьковского производства завода химических препаратов). И в третьих, для этого способа может быть использован любой производственный антиген возбудителя вирусных инфекций, приготовленный для РСК, РТГА, реакции нейтрализации и других реакций после соответствующей проверки. Так, в частности, был использован в таком способе стандартный антиген вируса краснухи, предназначенный для постановки РТГА, который использовали в рабочем разведении 1:8.

Экономический расчет предлагаемого способа показал его значительную эффективность.

Формула изобретения

1. Способ экспресс-диагностики врожденных инфекций у детей путем ферментативного определения антигенов возбудителя герпеса, цитомегалии, токсоплазмоза, краснухи и антител к ним, отличающийся тем, что коммерческие диагностикумы для РСК соединяют в равных объемах с исследуемым материалом, затем добавляют 4 дозы комплемента, а наличие антител и антигена определяют по несвязанному комплементу, выявляемому по каталазной активности лизированных бараньих эритроцитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что собственный комплемент удаляется из исследуемого материала сорбцией его на нейтральный комплемент гемолизина и бараньих эритроцитов, обработанных 7,5 15%-ной перекисью водорода с последующим удалением центрифугированием.

РИСУНКИ

Рисунок 1