Моноклональное антитело r6-5-d6, взаимодействующее с производным гликопротеина клеточной адгезии 1сам-1

 

Использование: разработка биотехнологических методов для профилактики и лечения аллергии, онкологических заболеваний, создание препаратов, используемых при трансплантации тканей. Сущность: получение моноклонального антитела R6-5-D6, ингибирующего взаимодействие лимфоцитов с гликопротеином клеточной адгезии ICAM-1. Антитело продуцируется штаммом гибридомой мыши ATCC HB 8580 и относится к изотипу IgG_2a. Они способны ингибировать пролиферацию моноядерных клеток периферической крови человека в системах, для которых требуется межклеточная адгезия. 4 ил.

Изобретение относится к моноклональным антителам, взаимодействующим с протеинами, в частности к моноклональному антителу R6-5-D6, взаимодействующему с производным гликопротеина клеточной адгезии ICAM-1.

Производные гликопротеина ICAM-1 представляют собой межклеточные адгезионные молекулы, которые участвуют в процессе, в котором популяции лимфоцитов распознают и прилипают к клеточным субстратам так, что они могут мигрировать к сайтам воспаления и взаимодействовать с клетками в процессе воспалительных реакций.

Производное гликопротеина ICAM-1 в смысле изобретения представляет собой гликопротеин поверхности клеток, экспрессия которого имеет место на некроветворных клетках, таких как сосудистые эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки вилочковой железы, некоторые другие эпителиальные клетки и фибропласты, и таких кроветворных клетках, как макрофаги клеток, Т-лимфобластах, стимулированных митогеном, и герминально центрифугированных B-клетках, и дендритных клетках миндалин, лимфатических узлов. Сильная экспрессия ICAM-1 имеет место на васкулярных эндотелиальных клетках на участках Т-клеток в лимфатических узлах и миндалинах, демонстрируя реакционную гиперплазию. ICAM-1 экспримируется в небольших количествах на периферических лимфоцитах крови. Стимулированное сложным форбольным эфиром дифференцирование некоторых миеломоноцитных клеточных линий существенно повышает экспрессию ICAM-1. Так, ICAM-1 предпочтительно экспримируется в сайтах воспаления и обычно не экспримируется находящимися в состоянии покоя клетками. Экспрессия ICAM-1 на фибробластах кожи повышается от трех до пяти раз как интерлейкином 1, так и гамма-интерфероном, используемым в количестве порядка 10 ед./мл, в течение от 4 до 10 ч соответственно. Индукция зависит от протеина и синтеза мРНК и является обратимой.

В зависимости от типа клетки ICAM-1 имеет различный молекулярный вес. Так, например, молекулярный вес составляет 97 кДа на фибробластах, 114 кДа на миеломоноцитных клетках линии U 937 и 90 кДа на B-лимфобластоидных клетках JY. В результате биосинтеза ICAM-1 был обнаружен межклеточный предшественник с молекулярным весом приблизительно 73 кДа. He-N-гликозилированная форма, полученная после обработки туникамицином (который ингибирует гликозилирование), имеет молекулярный вес 55 кДа.

ICAM-1, выделенный из U937 клеток, стимулированных сложным эфиром форбола, или из фибробластных клеток, дает идентичный основной продукт с молекулярным весом 60 кДа после химического дегликозилирования. Моноклональные антитела ICAM-1 мешают адгезии бластов фитогемагглютинина к клеточной линии, лишенной LFA-1 (LFA связанный с функцией лимфоцитов антиген-1). Предварительная обработка фибробластов, но не лимфоцитов, моноклональными антителами, способными связываться с ICAM-1, ингибируют адгезию лимфоцита к фибробласту. Предварительная обработка лимфоцитов, но не фибробластов, антителами против LFA-1 также ингибирует адгезию лимфоцитов к фибробластам.

Вот почему ICAM-1 является клеточным субстратом, с которым могут связываться лимфоциты, так что лимфоциты могут мигрировать к центрам воспаления и/или выполнять различные эффекторные функции, связанные с этим воспалением.

В литературе еще не описаны моноклональные антитела, взаимодействующие c производным гликопротеина, полезные в областях трансплантации органов, прививки ткани, онкологии и для лечения аллергии.

Задачей изобретения является предоставление моноклонального антитела, взаимодействующего с производным гликопротеина, полезного в областях трансплантации органов, прививки ткани, онкологии и для лечения аллергии.

Поставленная задача решается предлагаемым антителом R6-5-L6, взаимодействующим с производным гликопротеина клеточной адгезии ICAM-1, характеризующимся следующими признаками: продуцируется штаммом гибридомных клеток мыши ATCC HB 8580; относится к изотипу IgG_2a; ингибирует в культуре периферических моноядерных клеток крови человека пролиферативный ответ по отношению к конканавалину А, антигену ОКТЗ Т-клеток, гемоцианину моллюска фиссуреллы и столбнячному анатоксину.

Штамм гибридомных клеток мыши ATCC HB 9580 депонирован 30-го октября 1987 г.

Пример 1 Иммунизация Мышей Balb/C подвергают иммунизации (внутрибрюшинно) 0,5 мл 2·10⁷ клеток JY в среде RPMI за 103 дня и 24 дня до слияния. На 4-й и 3-й день до слияния мышей подвергают иммунизации (внутрибрюшинно) 10⁷ клеток U937, дифференцированных ацетатом фоброл-12-миристата (далее "ФМА"), в 0,5 мл среды RPMI.

Дифференцирование клеток 5·10⁵/мл клеток U937 (ATCC CRL 1593) дифференцируют инкубацией в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 1% глутамина, 50 мкг/мл гентамина и 2 нг/мл ФМА, в стерильных полипропиленовых контейнерах. На третий день инкубации половину объема среды отбирают и заменяют свежей полной средой, содержащей ФМА. На четвертый день клетки удаляют, промывают и подготавливают к иммунизации.

Слияние Клетки селезенки от иммунизованных мышей подвергают слиянию с миеломными клетками P3 x 63 Ag 8.653 в соотношении 4:1. После слияния клетки переносят в плоскодонные микротитровальные пластины с 96 углублениями при концентрации 10⁵ клеток селезенки/углубление.

Отбор положительных клеток, взаимодействующих с ICAM-1 Спустя неделю 50 мкл надосадочной жидкости подвергают скринингу следующим образом. Клеточные линии JY и SKW-3 два раза промывают средой RPMI 1640, содержащей 5 мМ буфера Hepes, и повторно суспендируют до концентрации 2·10⁶ клеток/мл. 50 мкл надосадочного моноклонального антитела добавляют к 50 мкл полной среды RPMI, содержащей 200 нг/мл ФМА и 100 мкл клеток в концентрации 2·10⁶ клеток/мл среды. При этом получают конечную концентрацию 50 нг/мл ФМА и 2·10⁵ клеток на углубление. Клеткам дают осаждаться и определяют степень агрегации в различные моменты времени. Отбирают клетки из надосадочных жидкостей, инкубирующих агрегацию клеток JY, но не агрегацию клеток SKW-3, и клонируют дважды, используя метод ограниченного разведения. В результате этих экспериментов идентифицируют и клонируют три отдельные гибридомные линии, которые продуцируют моноклональные антитела против ICAM-1. Антитела, продуцируемые этими гибридомными линиями, обозначают IgG_2a, IgG_2b и IgМ соответственно. Гибридомную клеточную линию, которую продуцирует предлагаемое антитело IgG_2a (обозначаемое R6-5-D6), обозначают R6'5'D6'E9'В2.

Для получения антител на живом организме мышам BaIb/с внутрибрюшино инокулируют 3 10·10⁶ клеток штамма гибридомы ATCC HB 9580. За 2 - 3 дня до инокуляции внутрибрюшинно инъецируют 0,5 мл неполного состава адъюванта Фройда или же за 7 10 дней до инокуляции 0,5 мл пристана. По истечении 7 21 дня собирают образовавшуюся асцитную жидкость. Содержащееся в ней антитело обогащают до степени чистоты выше 90% путем осаждения 50%-ным сульфатом аммония и афинной хроматографии на связанном с носителем протеине A. На 1 мл асцитной жидкости получают приблизительно 2 5 мг чистого антитела.

Пример 2 Влияние взаимодействующего с ICAM-1 антитела на пролиферацию человеческих периферических моноядерных клеток крови
Человеческие периферические моноядерные клетки крови индуцируются для пролиферации присутствием антигенов или митогенов и их распознаванием. Некоторые молекулы, такие как митоген, конканавалин A или связывающее Т-клетки антитело ОКТЗ, вызывают неспецифическую пролиферацию периферических моноядерных клеток крови. Человеческие периферические моноядерные клетки крови являются гетерогенными, так как они состоят из субпопуляций клеток, которые способны распознавать специфические антигены. Когда периферическая моноядерная клетка крови, которая способна распознавать конкретный специфический антиген, встречается с антигеном, возникает пролиферация такой субпопуляции моноядерных клеток. Столбнячный анатоксин и гемоцианин моллюска фиссуреллы являются примерами антигенов, которые распознаются субпопуляциями периферических моноядерных клеток, но не распознаются всеми периферическими клетками у сенсибилизированных индивидуумов.

Исследуют способность взаимодействующего с ICAM-1 моноклонального антитела R6-5-D6 к ингибированию пролиферации человеческих периферических моноядерных клеток крови в системах, для которых требуется межклеточная адгезия. После очистки периферических моноядерных клеток крови промывают три раза средой RPMI 1640 и культивируют в плоскодонных микронитровальных пластинках с 96 углублениями при концентрации 10⁶ клеток/мл в среде RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глутамина и 50 мкг/мл гептамицина.

Антиген либо Т-клеточный митоген, конканавалин A (0,25 мкг/мл), связывающее Т-клетки антитело ОКТЗ (0,001 мкг/мл); гемоцианин моллюска фиссуреллы (10 г/мл) либо столбнячный анатоксин (в виде 1:100 разбавления) добавляют к клеткам, которые культивируют, как описано выше в присутствии или в отсутствии антитела R6-5-D6 (конечная концентрация 5 г/мл). Клетки культивируют 3,5 дня (эксперимент с конканавалином A), 2,5 дня (эксперимент с ОКТЗ) или 5,5 дня (эксперименты с гемоцианином моллюска фиссуреллы и столбнячным анатоксином).

18 ч до окончания эксперимента к культурам прибавляют 2,5 мкCi ³Н-тимидина. Определяют клеточную пролиферацию путем измерения включения периферическими моноядерными клетками крови тимидина ДНК. Собирают включенный тимидин и подсчитывают с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Результаты экспериментов представлены на фиг. 1 (эксперимент с конканавалином A), фиг. 2 (эксперимент с ОКТЗ), фиг. 3 (эксперимент с гемоцианином моллюска фиссуреллы) и фиг. 4 (эксперимент со столбнячным анатоксином). Указанное на фиг. 1 4 условное сокращение "СРМ" означает "число отсчетов в минуту".

Фиг. 1 изображает действие анти-адгезионного антитела на способность периферических кровяных моноядерных клеток к пролиферации в ответ на распознавание неспецифичесного T-клеточного митогена, конканавалина A. "CONA" указывает на добавление конканавалина A.

Фиг. 2 изображает влияние антиадгезионного антитела на способность периферических моноядерных клеток к периферации в ответ на распознавание связанного с Т-клетками антигена ОКТЗ. "ОКТЗ" означает добавление антигена.

Фиг. 3 изображает действие антиадгезионного антитела на способность периферических кровяных моноядерных клеток к пролиферации в ответ на распознавание антигена гемоцианина моллюска фиссуреллы. Добавление гемоцианина к клеткам указано как "KLH".

Фиг. 4 изображает действие антиадгезионного антитела на способность периферических кровяных моноядерных клеток к пролиферации в ответ на распознавание столбнячного анатоксина. Добавление столбнячного анатоксина к клеткам указано как "ACN".

Было обнаружено, что взаимодействующее с ICAM-1 антитело ингибирует в моноядерных клетках пролиферативные ответы к неспецифическому митогену Т-клеток, конканавалину А, неспецифическому антителу Т-клеток, ОКТ-3 и специфическим антигенам, гемоцианину моллюска фиссуреллы и столбнячному анатоксину. Ингибирование взаимодействующим с ICAM-1 антителом сравнимо с ингибированием антителом, взаимодействующим с LFA-1, если предполагать, что ICAM-1 является функциональным лигандом LFA-1, и что антагонизм ICAM-1 будет ингибировать ответы специфических защитных систем.

Формула изобретения

Моноклональное антитело R6-5-D6, взаимодействующее с производным гликопротеина клеточной адгезии 1CAM-1, характеризующееся следующими признаками: продуцируется штаммом гибридомных клеток мыши АТСС HB 9580; относится к изотипу Ig_2а; ингибирует в культуре периферических моноядерных клеток крови человека, пролиферативный ответ по отношению к конканавалину A, антигену ОКТЗ Т-клеток, гемоцианину моллюска фиссуреллы и столбнячному анатоксину.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3