Циклические пептиды или их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция

 

Назначение: в медицине в качестве соединений, обладающих противотромбозной активностью. Сущность изобретения - циклические пептиды общей формулы I, приведенной в тексте описания, или их фармацевтически приемлемые соли, где R₁ - водород, (C₁-C₄) алкил, фенил, бензил; R₂ - водород, низший алкил; R₁₀ - водород, галоген; n=1, n'=0; j=D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Met, D-Pro, β -Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексил Gly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D - 2 - аминомасляная кислота, D-2-аминопентановая кислота Gly, Nε -р-азидобензоил-D-Lys, Nε -р-бензоилбензоил-D-Lys, Nε р-ацетобензоил-D-Lys, Nε -дансил-D-Lys, Nε t-бутоксикарбонил глицил-D-Lys, Nε -глицил-D-Lys, Nε -p-бензоилбензоилглицил-D-Lys, Nε -р-фенилбензоил-D-Lys, Nε -m-бензоилбензоил-D-Lys или Nε -o-бензоилбензоил-D-Lys; K = αNMeArg , Nδ, Nα -диме-Nδ-гуанидинил Orn, Nα MeLys или Nε,Nα -диMeLys, L=Gly; M=Asp, β MeAsp или NMeAsp и фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать действие тромбоцитов, содержащая в качестве активного начала эффективное количество циклического пептида формулы I. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 8 табл.

Настоящее изобретение относится к новым циклическим пептидам, содержащим аминометилбензойную кислоту и используемым в качестве антагонистов тромбоцитарного гликопротеинового комплекса IIb/IIIa и к лекарственным композициям, содержащим эти циклические пептиды.

Активация тромбоцитов и, как результат, их агрегация и секреция ими факторов связаны с различными патофизиологическими состояниями, включая сердечно-сосудистые и церебрососудистые тромбоэмболические осложнения, например тромбоэмболические осложнения, связанные с неустойчивой стенокардией, инфарктом миокарда, преходящим нарушением мозгового кровообращения, параличом, атеросклерозом и диабетом. Роль тромбоцитов в этих процессах определяется их способностью образовывать агрегаты или тромбы, особенно на стенках артерий после повреждений.

Известно, что тромбоциты играют важную роль в обеспечении гемостаза и в патогенезе артериального тромбоза. Было показано, что активация тромбоцитов усиливается при коронарном тромболизе, что может привести к задержанной реперфузии и реокклюзии. Клинические исследования с использованием аспирина, тиклопидина и моноклонального антитела на тромбоцитарный гликопротеин IIb/IIIa позволили получить биохимические доказательства того, что тромбоциты играют активную роль при неустойчивой стенокардии, на ранней стадии инфаркта миокарда, при преходящем нарушении мозгового кровообращения, церебральной ишемии и параличе.

Тромбоциты активируются большим количеством разнообразных веществ, обладающих сродством к рецепторам, что приводит к изменению формы тромбоцитов, секреции гранулярных компонентов и агрегации. Агрегация тромбоцитов способствует образованию сгустка благодаря сосредоточению активированных факторов свертывающей системы крови в одном месте. Было идентифицировано несколько эндогенных веществ, обладающих сродством к рецепторам, включая аденозиндифосфат (АДФ), серотонин, арахидоновую кислоту, тромбин и коллаген. Поскольку в процессы активации и агрегации тромбоцитов вовлечены несколько эндогенных веществ, обладающих сродством к рецепторам, ингибитор, который эффективен в отношении всех этих веществ, должен представлять собой более действенный противотромбоцитный агент, чем известные в настоящее время противотромбоцитные лекарства, каждое из которых является специфическим только для определенного вещества, обладающего сродством к рецепторам.

Современные противотромбоцитные лекарства эффективны только в отношении какого-то одного типа таких веществ; примеры включают аспирин, противодействующий арахидоновый кислоте; тиклопидин, противодействующий АДФ; ингибиторы тромбоксана A₂-синтетазы или рецепторные антагонисты, противодействующие тромбоксану A₂; и гирудин, противодействующий тромбину.

Недавно был обнаружен общий для всех известных веществ, обладающих сродством к рецепторам, механизм действия, в котором ключевую роль играет тромбоцитарный гликопротеиновый комплекс IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), который является мембранным белком, опосредующим агрегацию тромбоцитов. Один из последних обзоров исследований GPIIb/IIIa был сделан Phillips et al. (1991) Cell 65: 359-362. Создание антагониста для GPIIb/IIIa представляет собой новый, многообещающий подход к проблеме противотромбоцитной терапии. Последние исследования, проведенные на людях с применением моноклонального антитела на GPIIb/IIIa показывают, что антагонист GPIIb/IIIa должен являться эффективным противотромботическим агентом.

В настоящее время существует потребность в специфическом для GPIIb/IIIa противотромбоцитном агенте, способном ингибировать активацию и агрегацию тромбоцитов в ответ на воздействие любого вещества, обладающего сродством к рецепторам. Такой агент должен являться более эффективным противотромбоцитным терапевтическим средством, чем известные в настоящее время ингибиторы тромбоцитов, которые специфичны только в отношении какого -либо одного вещества, обладающего сродством к рецепторам.

GPIIb/IIIa не связывает растворимые белки на неактивированных тромбоцитах, но известно, что в случае активированных тромбоцитов GPIIb/IIIa связывает четыре растворимых адгезивных белка, а именно: фибриноген, фактор фон Виллебранда, фибронектин и витронектин. Связывание фибриногена и фактора фон Виллебранда с GPIIb/IIIa вызывает агрегацию тромбоцитов. Связывание фибриногена частично опосредуется опознавательной последовательностью Arg-Gly-Asp (RGD), которая является общей для адгезивных белков, связываемых GPIIb/IIIa.

Было описано несколько RGD -содержащих пептидов и родственных им соединений, которые блокируют связывание фибриногена и предотвращают образование тромбов. См. например, Cadroy et al. (1989). J. Clin. Invest. 84: 939- 944; Klein et al. патент США 4952562, опубл. 8/28/90; Европейскую патентную заявку ЕР 0319506 А; Европейскую патентную заявку ЕР 0422938 А1; Европейскую патентную заявку ЕР 0422937 А1; Европейскую патентную заявку ЕР 0341915 А2; РСТ патентную заявку WO 89/07609; РСТ патентную заявку WO 90/02751; РСТ патентную заявку WO 91/04247; и Европейскую патентную заявку ЕР 0343085 А1.

В настоящем изобретении нами использованы сдерживающие жесткую конформацию аминокислоты (изомеры аминометилбензойной кислоты) в качестве шаблонов для циклизации пептидов таким образом, чтобы они обладали высоким сродством и селективностью в отношении GPIIb/IIIa.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к циклическим пептидам формулы (I): или их фармацевтически приемлемым солям, где R¹ представляет H, (C₁-C₄)алкил, фенил, бензил; R² представляет H или низш.алкил; R¹⁰ представляет H, галоген; n 1; n'-0; J представляет D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Met, D-Pro, β-Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляную кислоту, D-2-аминопентановую кислоту Gly, N^e-р-азидобензоил-D-Lys, Nε-p-бензоилбензоил-D-Lys, Nε-p-ацетобензоил-D-Lys, Nε-дансил-D-Lys, Nε-t-бутоксикарбонилглицил-D-Lys, Nε-глицил-D-Lys, Nε-p- бензоилбензоилглицил-D-Lys, Nε-p-фенилбензоил-D-Lys, Nε-m-бензоилбензоил-D-Lys или Nε-o-бензоилбензоил-D-Lys;
K представляет αNMeArg, Nδ, Nα -ди-Me Nδ гуанидинилOrn, Nα MeLys или Nε, Nα -диMeLys;
L представляет Gly;
M выбирается из Asp, β -MeAsp или NMeAsp.

Предпочтительными соединениями настоящего изобретения являются:
Соединение формулы (I), где:
R¹ представляет H, (C₁-C₄)алкил, фенил, бензил;
R² представляет H или метил;
R¹⁰ представляет H, галоген;
J представляет D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Met, D-Pro, b -Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляную кислоту, D-2-аминопентановую кислотуGly, N^e-р-азидобензоил-D-Lys, Nε-p-бензоилбензоил-D-Lys, Nε-p-ацетобензоил-D-Lys, Nε-дансил-D-Lys, Nε-t-бутоксикарбонилглицил-D-Lys, Nε-глицил-D-Lys, Nε-p- бензоилбензоилглицил-D-Lys, Nε-p-фенилбензоил-D-Lys, Nε-m- бензоилбензоил-D-Lys или Nε-o-бензоилбензоил-D-Lys;
K представляет αNMeArg, Nδ, Nα - ди Me-Nδ -гуанидинилOrn, Να MeLys или N^e, Nα -диMeLys;
L представляет Gly;
M выбирается из Asp, β -MeAsp или NMeAsp.

Соединение формулы (I), где:
R¹ представляет H, (C₁-C₄)алкил, фенил, бензил;
R² представляет H или метил;
R¹⁰ представляет H, галоген;
J представляет D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Met, D-Pro, b -Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляную кислоту, N^e-p-азидобензоил-D-Lys, Nε-p-бензоилбензоил-D-Lys, Nε- p-ацетобензоил-D-Lys, Nε-дансил-D-Lys, Nε-t-бутоксикарбонилглицил- D-Lys, Nε-глицил-D-Lys, Nε-p-бензоилбензоилглицил-D-Lys, Nε-p-фенилбензоил-D-Lys, Nε-m-бензоилбензиол-D-Lys или Nε-о-бензоилбензоил-D-Lys;
K представляет α NMeArg;
L представляет Gly; а
M выбирается из Asp, b -MeAsp или NMeAsp.

Соединение формулы (I), где:
R¹ и R² независимо выбираются из H или метила;
R¹⁰ представляет H;
J выбирается из D-Val, D-2-аминомасляной кислоты, D-Leu, D-Ala, D-Pro, D-Ser, D-Lys, b -Ala, NMeGly, D-Nle, D-фенилGly, D-Ile, D-Phe, D-Tyr;
К представляет a NMeArg;
L представляет Gly;
M выбирается из Asp, b -MeAsp или NMeAsp.

А также циклические пептиды, которые выбираются из группы соединений у которых R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-2-аминомасляную кислоту; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Leu; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Ala; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Pro; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Lys; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ представляет метил (изомер 1), R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ представляет метил (изомер 2), R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ представляет фенил (изомер 1), R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J D-Met; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J D-2- аминомасляную кислоту; K N^d, N^a -ди Me-N^d гуанидинилOrn; L - Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J D-2- аминомасляную кислоту; K Nε Nα ди Me Lys; L - Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-p-азидобензоил-D-Lys; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет N-п-бензоилбензоил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-триптофанил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M - Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-o-бензилбензоил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-р-ацетилбензоил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-дансил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-глицил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-р-бензоилбензоилглицил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-p-фенилбензоил-D-Lys; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-m-бензоилбензоил-D-Lys; K NMeArg; L - Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-o-бензоилбензоил-D-Lys; K NMeArg; L - Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Nle; K NMeArg; L Gly; M Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-фенилGly; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Phe; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Ile; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-Cl; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-I; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Cly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-I; J представляет D-2-аминомасляную кислоту; K представляет NMeArg; L I представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-Me; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 6-Cl; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 6-метокси; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 6-Me; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-Cl; J представляет D-2-аминомасляную кислоту; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-I; J представляет D-2-аминомасляную кислоту; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R² представляют H; R¹⁰ представляет 4-Me; J представляет D-2-аминомасляную кислоту; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Tyr; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹ и R¹⁰ представляют H; R² представляет CH₃; J представляет D-Val; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-циклогексилGly; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет Nε-t-бутоксикарбонилглицил-D-Lys; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp;
соединения формулы (I), где R¹, R² и R¹⁰ представляют H; J представляет D-Ser; K представляет NMeArg; L представляет Gly; M представляет Asp.

Циклические пептиды формулы (I), где
R¹ представляет H, (С₁-С₄)алкил, фенил;
R² представляет H или метил;
R¹⁰ представляет H, галоген;
J представляет D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Met, D-Pro, β -Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляную кислоту, D-2-аминопентановую кислотуGly, N^e, Nα -p-азидобензоил-D-Lys;
K представляет Nδ - ди Me-Nδ -гуанидинилOrn, Nε-диMeLys; L представляет Gly; а
M выбирается из Asp, β -MeAsp или NMeAsp;
И соединение, где
J означает D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Pro, D-Ser или D-Lys.

В настоящем изобретении было обнаружено, что вышеприведенные соединения могут быть использованы как ингибиторы гликопротеина IIb/IIIa (GPIIb/IIIa). Как уже говорилось выше, GPIIb/IIIa является медиатором процесса активации и агрегации тромбоцитов.

Соединения согласно настоящему изобретению ингибируют активацию и агрегацию тромбоцитов, вызываемую любыми известными эндогенными веществами, обладающими сродством к рецепторам тромбоцитов.

Настоящее изобретение обеспечивает также способы терапевтического лечения болезней, связанных с активацией и агрегацией тромбоцитов, включая сердечно -сосудистые и церебрососудистые тромбоэмболические осложнения, например тромбоэмболические осложнения, связанные с неустойчивой стенокардией, инфарктом миокарда, преходящим нарушением мозгового кровообращения, параличом, атеросклерозом и диабетом, путем введения реципиенту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества соединений вышеприведенной формулы (I).

Известно, что в метастатических опухолевых клетках уровень экспрессии GPIIb/IIIa является повышенным. Соединения согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения метастатического рака.

Описанные здесь соединения могут иметь асимметрические центры. Если не оговорено обратное, то настоящее изобретение охватывает все хиральные, диастереомерные и рацемические формы. Известно, что существуют два разных изомера (цис и транс) относительно пептидной связи; оба этих изомера могут иметь место в случае описанных соединений, и все такие стабильные изомеры также включаются в объем настоящего изобретения. Если особо не оговорено обратное, то используется L-изомер аминокислоты. D- и L-изомеры конкретной аминокислоты обозначаются в данном описании с использованием стандартного трехбуквенного сокращения, принятого для этой аминокислоты, например, d-Leu, D-Leu, l-Leu или L-Leu.

Если какой-либо переменный, то есть могущий принимать разные значения, символ (например, R¹-R⁸, m, n, p, Q, W, X, Y, Z и т.д.) встречается в каком-либо фрагменте или в какой-либо формуле больше одного раза, то его значение в каждой из занимаемых им позиций не зависит от его значений в любой другой из занимаемых им позиций. Сочетания заместителей и/или переменных символов считаются допустимыми только в тех случаях, когда такие сочетания приводят к устойчивому соединению.

В контексте настоящего описания термин "алкильный" ("алкильная") охватывает насыщенные алифатические углеводородные группы как с прямой, так и с разветвленной цепью, имеющие указанное количество атомов углерода; термин "алкокси" охватывает алкильные группы с указанным числом атомов углерода, соединенные через мастиковый атом кислорода; термин "циклоалкильный" ("циклоалкильная") охватывает насыщенные циклические группы, такие как циклопропильная, циклобутильная, циклопентильная, циклогептильная и циклооктильная. Термин "алкенильный" ("алкенильная") охватывает углеводородные цепи как разветвленного, так и неразветвленного строения, содержащие одну или несколько двойных углерод-углеродных связей, которые могут занимать любое устойчивое положение вдоль цепи, такие как этенильная, пропенильная и аналогичные группы; термин "алкинильный" ("алкинильная") охватывает углеводородные цепи как разветвленного, так и неразветвленного строения, содержащие одну или несколько тройных углерод- углеродных связей, которые могут занимать любое устойчивое положение вдоль цепи, такие как этинильная, пропинильная и аналогичные группы. Термин "галоген" в контексте настоящего описания относится к атомам фтора, хлора, брома и йода; термин "контерион" используется для обозначения небольшой отрицательно заряженной частицы, например, хлорид, бромид, гидроксил, ацетат, сульфат и аналогичных.

Под "устойчивым соединением" или "устойчивой структурой" в настоящем описании подразумевается соединение, достаточно прочное для того, чтобы оно могло быть выделено с требуемой степенью чистоты из реакционной смеси, и превращено в эффективный терапевтический агент.

Термин "фармацевтически приемлемые соли и пролекарства" относится к производным раскрываемых соединений, которые получены переводом этих соединений в кислые или основные соли, или модификацией функциональных групп, имеющихся в этих соединениях таким образом, чтобы эти модификации при обычных процедурах или in vivo превращались в родительские соединения. Примеры включают, но не ограничиваются, следующими вариантами: соли основных остатков органических или неорганических кислот, таких как амины, соли кислых остатков щелочных или органических кислот, таких как карбоновые кислоты; сложные эфиры карбоксилатов; ацетатные, формиатные и бензоатные производные спиртов и аминов; и аналогичные.

Фармацевтически приемлемые соли соединений настоящего изобретения могут быть получены реакцией этих соединений в виде свободных кислот или оснований со стехиометрическими количествами соответствующих оснований или кислот в воде или в органическом растворителе, или в их смеси; как правило, предпочтительными являются среды, не содержащие воды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечни подходящих солей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p.1418.

Термин "аминокислота" в контексте настоящего описания означает органическое соединение, содержащее основную аминогруппу, и кислую карбоксильную группу. Этот термин охватывает также модифицированные и необычные аминокислоты.

Термин "аминокислотный остаток" в рамках настоящего описания означает ту часть аминокислоты (термин определен выше), которая присутствует в пептиде или в псевдопептиде. Термин "пептид" в контексте настоящего описания означает линейное соединение, состоящее из двух или нескольких аминокислот (определение термина см. Выше), связанных друг с другом пептидными или псевдопептидными связями.

Соединения настоящего изобретения могут быть получены рядом способов, хорошо известных специалистам в области органического синтеза. Предпочтительные способы включают описанные ниже, но не ограничиваются ими.

В описании использованы следующие сокращения:
D-Abu D-2-аминомасляная кислота
b -Ala или bAla 3-аминопропионовая кислота
Boc t-бутоксикарбонил
Boc-Mamb t-бутоксикарбонил-З-аминометилбензойная кислота
Boc-ON 2-(трет-бутоксикарбонилоксилимино)-2-фенилацетонитрил
DCC дициклогексилкарбодиимид
DIEA диизопропилэтиламин
ОМАР 4-диметиламинопиридин
HBTU 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат
NMeArg или MeArg a -N-метиларгинин
NMeGly или MeGly N-метилглицин
NMM N-метилморфолин
OcHex O-циклогексил
OBzl О-бензил
Tos тозил
В описании использованы следующие стандартные трехбуквенные сокращения названий аминокислот:
Ala аланин
Arg аргинин
Asn аспарагин
Asp аспарагиновая кислота
Cys цистеин
Gln глютамин
Glu глютаминовая кислота
Gly глицин
His гистидин
Ile изолейцин
Leu лейцин
Lys лизин
Met метионин
Phe фенилаланин
Pro пролин
Ser серин
Thr треонин
Trp триптофан
Tyr тирозин
Val валин.

Синтез пептидов
Соединения настоящего изобретения могут быть синтезированы стандартными синтетическими способами, известными специалистам в данной области техники. Как правило, наращивание пептидной цепи осуществляют, снимая защиту с a -аминогруппы С-концевого остатка и присоединяя следующую, соответствующим образом защищенную, аминокислоту пептидной связью, используя описанные в литературе методы. Эти операции снятия защиты (депротектирования) и присоединения повторяют до тех пор, пока не получат требуемую последовательность. Присоединение может быть осуществлено или постадийным добавлением составляющих последовательность аминокислот, или конденсацией фрагментов (двух или нескольких аминокислот), или сочетанием обоих методов, или твердофазным пептидным синтезом согласно способу, впервые описанному Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).

Соединения настоящего изобретения можно также синтезировать, используя автоматическое оборудование для синтеза пептидов, описанное Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd ed. Pierce Chemical Co. Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Eds. "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", vol. l, 2, 3, 5 and 9, Academic Press, New York, (1980-1987); Bodanszky, "Peptide Chemistry: A Practical Textbook", Springer- Verlag, New York (1988); и Bodanszky et al. "The Practice of Peptide Synthesis" Springer-Verlag, New York (1984).

Соединение двух аминокислотных производных, аминокислоты и пептида, двух пептидных фрагментов или циклизация пептида могут быть осуществлены с использованием стандартных методик сдваивания, таких как азидный метод, метод со смешанным ангидридом карболовой кислоты (изобутилхлороформиатный), карбодиимидный (дициклогексилкарбодиимидный, диизопропилкарбодиимидный или водорастворимый карбодиимидный) метод, метод с использованием активного сложного эфира (п-нитрофенильного эфира, эфира N-гидроксисукцинимида), метод с использованием реагента K Вудворда, карбонилдиимидазольный метод, метод с использованием фосфорных реагентов, например, BOP-Cl, или окислительно-восстановительный метод. Некоторые из этих методов (особенно карбодиимидный) могут быть улучшены добавлением 1- гидроксибензотриазола. Эти реакции сдваивания можно проводить или в растворе (в жидкой фазе), или в твердой фазе.

Во избежание образования нежелательных связей, во время реакций сдваивания функциональные группы составляющих аминокислот должны быть защищены. Защитные группы, которые могут быть использованы, перечислены в следующих источниках: Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley Sons, New York (1981) и "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", vol.3, Academic Press, New York (1981).

a -карбоксильную группу С концевого остатка обычно защищают, получая сложноэфирную группу, которая может быть гидролизована до карболовой кислоты. Эти защитные группы включают: 1) алкиловые эфиры, такие как метиловый и трет-бутиловый, 2) ариловые эфиры, такие как бензиловый и замещенный бензиловый, или 3) эфиры, которые могут быть расщеплены щелочным гидролизом в мягких условиях или восстановлением в мягких условиях, такие как трихлорэтиловый или фенилациловый эфиры. В случае синтеза в твердой фазе С-концевую аминокислоту присоединяют к нерастворимому носителю (обычно к полистиролу). Эти нерастворимые носители содержат группу, реагирующую с карбоксильной группой с образованием связи, которая устойчива в условиях реакции наращивания пептидной цепи, но относительно легко расщепляется в дальнейшем. Примерами являются: оксимная смола (DeGrado and Kaiser (1980) J. Org. Chem. 45, 1295-1300), хлор- или бромметильная смола, гидроксиметильная смола и аминометильная смола. Многие из этих смол производятся в промышленном масштабе, причем в такой форме, что уже содержат требуемую С-концевую аминокислоту.

В каждой аминокислоте a -аминогруппа должна быть защищена. Для этого может быть использована любая из известных в данной области техники защитных групп. Примерами являются: 1) группы ацильного типа, такие как формильная, трифторацетильная, фталильная и п-толуолсульфонильная; 2) ароматические карбаматные группы, такие как бензилоксикарбонильная (Cbz) и замещенные бензилоксикарбонильные, 1-(п-бифенил)-1-метилэтоксикарбонильная и 9-фторметилоксикарбонильная (Fmoc); 3) алифатические карбаматные группы, такие как трет. -бутилоксикарбонильная (Boc), этоксикарбонильная, диизопропилметоксикарбонильная и аллилокси- карбонильная; 4) циклоалкилкарбаматные группы, такие как циклопентилоксикарбонильная и адамантилоксикарбонильная; 5) алкильные группы, такие как трифенилметильная и бензильная; 6) триалкилсилильные группы, такие как триметилсилильная; и 7) тиолосодержащие группы, такие как фенилтиокарбонильная и дитиасукциноильная. Предпочтительными защитными группами для a -аминогрупп являются Boc или Fmoc. Промышленностью производится множество производных аминокислот, надлежащим образом защищенных для проведения пептидного синтеза.

Защитную группу удаляют из a -аминогруппы перед присоединением следующей аминокислоты. При использовании группы Boc удаление осуществляют или с помощью трифторуксусной кислоты, взятой в чистом виде или в виде раствора в дихлорметане, или с помощью раствора HCl в диоксане. Полученную аммонийную соль затем нейтрализуют щелочными растворами, такими как водные буферные растворы или третичными аминами в дихлорметане, или диметилформамиде, перед сдваиванием или in situ. При использовании группы Fmoc применяют пиперидин или замещенные пиперидины в диметилформамиде, но могут быть использованы также любые вторичные амины или водные растворы оснований. Депротектирование проводят при температуре от 0^oC до комнатной.

Любые аминокислоты, содержащие функциональные группы в боковой цепи, при получении пептидов должны быть защищены с помощью любой из вышеуказанных групп. Специалисту в данной области техники понятно, что выбор и использование соответствующих защитных групп для этих функциональностей в боковых цепях зависит от аминокислоты и от наличия в пептиде других защитных групп. Важным требованием при выборе таких защитных групп является то, что они не должны отщепляться при депротектировании и сдваивании a -аминогруппы.

Например, в случае выбора Boc для защиты a -аминогруппы, подходящими являются следующие защитные группы: п-толуолсульфонильные (тозильные) остатки и нитрогруппа для аргинина; бензилоксикарбонильная, замещенные бензилоксикарбонильные и тозильная группы для лизина; сложные бензиловый или алкиловые эфиры, такие как циклопентиловый, для глютаминовой и аспарагиновой кислот; простые бензиловые эфиры для серина и треонина; простые бензиловые эфиры, замещенные простые бензиловые эфиры или 2-бромбензилоксикарбонильная группа для тирозина; п-метилбензильная, п-метоксибензильная, ацетамидометильная, бензильная или трет. бутилсульфонильная группы для цистеина; и, наконец, индол в триптофане может быть оставлен незащищенным, или защищен формильной группой.

При выборе Fmoc для защиты a -аминогруппы обычно подходящими являются защитные группы на основе трет.-бутила. Например, Boc может быть использован для лизина, простой трет.-бутиловый эфир для серина, треонина и тирозина, и сложный трет.-бутиловый эфир для глютаминовой и аспарагиновой кислот.

По окончании наращивания и циклизации пептида все защитные группы удаляют. При жидкофазном синтезе способ удаления определяется тем, какие именно группы были выбраны в качестве защитных. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области техники.

При твердофазном синтезе пептид должен быть удален со смолы без одновременного удаления защитных групп с тех функциональных групп, которые в дальнейшем могли бы мешать процессу циклизации. Так, если пептид намереваются циклизовать в растворе, то условия удаления защиты должны быть выбраны таким образом, чтобы получить свободную a -карбоксильную группу и свободную a -аминогруппу без одновременного удаления остальных защитных групп. С другой стороны, пептид может быть удален с поверхности смолы гидразинолизисом, и затем циклизован азидным способом. Другой очень удобный способ включает в себя синтез пентодов на оксимной смоле с последующим внутримолекулярным нуклеофильным вытеснением со смолы, что приводит к получению циклического пептида (Osapay, Profit and Taylor (1990), Tetrahedron Letters 43, 6121-6124). При использовании оксимной смолы, как правило, используется схема защиты на основе Boc. Далее, предпочтительный способ удаления защитных групп с боковых цепей обычно включает в себя обработку безводным HF, содержащим такие добавки, как диметилсульфид, анизол, тиоанизол или п-крезол, при 0^oC. Удаление защитных групп из пептида можно также осуществить с помощью кислотных реагентов, например, смесей трифторметансульфоновой и трифторуксусной кислот.

Использованные в настоящем изобретении необычные аминокислоты можно синтезировать стандартными методами, которые хорошо известны специалистам в данной области техники ("The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", vol.5, pp.342-349, Academic Press, New York (1981)). N-алкиламинокислоты можно получить ранее описанными методами (Cheung е1 а1. (1977) Can. J. Chem. 55, 906; Preidinger et al. (1982) J. Org. Chem. 48, 77).

Соединения настоящего изобретения можно получить способами, которые подробно описаны ниже.

Типичные материалы и методики, которые могут быть использованы при получении соединений настоящего изобретения, также описаны ниже.

Ручной твердофазный пептидный синтез проводили в полипропиленовых пробирках для фильтрации объемом 25 мл, купленных у BioRad Inc. Оксимную смолу (степень замещения 0,96 ммоль/г) приготавливали в соответствии с опубликованными методиками (DeGrado and Kaiser (1980) J. Org. Chem. 45, 1295). Все химические реактивы и растворители (марки "реактивные") использовали в том виде, в каком их получали от поставщиков, то есть без дополнительной очистки. Трет. -бутоксикарбонильные (Boc) аминокислоты и другие исходные аминокислоты могут быть куплены у Bachem Inc. Bachem Biosciences Inc. (Philadelphia, PA), Advanced ChemTech (Louisville, KY), Peninsula Laboratories (Belmont, CA.) или Sigma (St. Louis, MO). 2-(IH- бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU) был куплен у Advanced CheroTech. N-метилморфолин (NMM), м-крезол, D-2- аминомасляная кислота (Abu), триметилацетилхлорид, диизопропилэтиламин (DIEA), 3-цианобензойная кислота и 2-(трет-бутилоксикарбонилоксилимино)- фенилацетонитрил (Boc-ON) были приобретены у Aldrich Chemical Company. Диметилформамид (ДМФА), этилацетат, хлороформ (CHCl₃), метанол (MeOH), пиридин и соляная кислота (HCl) были приобретены у Baker. Ацетонитрил, дихлорметан (ДХМ), уксусная кислота (AcOH), трифторуксусная кислота (ТФУК), диэтиловый эфир, триэтиламин, ацетон и сульфат магния были куплены у ЕМ Science. Катализатор палладий на угле (10% палладия) был приобретен у Fluka Chemical Company. Абсолютный этанол был получен от Quantum Chemical Corporation. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках для ТСХ с покрытием из силикагеля 60 F₂₅₄ (толщина слоя 0,2 мм), купленных у ЕМ Separations. Визуализацию ТСХ-хроматограммы осуществляли, используя УФ-излучение и/или опрыскивание составом на основе нингидрина. Температуру плавления определяли с помощью прибора Thomas Hoover для определения температур плавления и другим методом не корректировали. Все ЖХВД -анализы проводили или на приборе Hewlett Packard 1090, Rainin, или на приборе DuPont 8800. ЯМР -спектры снимали на спектрометре General Electric QE-300 с частотой 300 МГц. Масс-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми атомами (МС-ББА) осуществляли на масс-спектрометре VG Zab-E с двойной фокусировкой, используя в качестве источника ионов пушку Xenon FAB.

Синтез 2, 3 и 4-Вос-аминометилзамещенных производных бензойной кислоты
2, 3 и 4-Вос-аминометилзамещенные производные бензойной кислоты, которые используются в качестве интермедиатов при синтезе соединений настоящего изобретения, получают, используя стандартные методики, описанные, например, в Tett. Lett, 4393 (1975); в "Modern Synthetic Reactions", Н.0. House (1972); или Harting et al. J. Am. Chem. Soc. 50: 3370 (1928), в соответствии с нижеприведенной схемой.

3 аминометилбензойная кислота ·HCl
3-цианобензойную кислоту (10,0 г, 68 ммоль) растворяют в 200 мл этанола при нагревании на водяной бане с температурой 35-50^oC. Добавляют концентрированную HCl (6,12 мл, 201 ммоль), и переносят полученный раствор в заполненную азотом круглодонную колбу объемом 500 мл, содержащую катализатор - палладий на угле (1,05 г, 10% Pd/C). Суспензию перемешивают в атмосфере водорода в течение 38 ч, фильтруют, тщательно промывают водой. При пониженном давлении удаляют этанол и оставшийся водный слой, содержащий твердое вещество белого цвета, разбавляют водой до 250 мл. Добавляют диэтиловый эфир (250 мл), и переносят суспензию в делительную воронку. При энергичном встряхивании все твердое вещество растворяется; затем водный слой дважды промывают эфиром, упаривают при пониженном давлении до объема 150 мл, и лиофилизуют, получая целевое соединение (3- аминометилбензойная кислота·HCl) (8,1 г, 64% ), в виде твердого вещества бежевого цвета. ¹Н-ЯМР (D₂O): 4,27 (s, 2Н), 7,60 (t, 1H), 7,72 (d, 1H), 8,06 (d, 2H).

Трет-бутоксикарбонил-З-аминометилбензойная кислота (Boc-Mamb)
Целевое соединение получают согласно видоизмененной стандартной методике, ранее описанной в литературе (Itoh, Hagiwara and Kamiya (1975) Tett. Lett, 4393). Солянокислую соль 3-аминометилбензойной кислоты (3,0 г, 16,0 ммоль) растворяют в 60 мл воды. К раствору добавляют раствор Boc-ON (4,33 г, 17,6 ммоль) в 60 мл ацетона, и затем триэтиламин (5,56 мл, 39,9 ммоль). Раствор приобретает желтую окраску; его pH доводят до 9 (определено по влажной индикаторной бумаге) добавлением еще 1,0 мл (7,2 ммоль) триэтиламина. Полученный раствор в течение ночи перемешивают при комнатной температуре, после чего при пониженном давлении удаляют ацетон, а оставшийся водный слой трижды промывают эфиром. Затем водный слой подкисляют до pH 2 добавлением 2N HCl, и трижды экстрагируют этилацетатом. Соединенные органические слои трижды промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и упаривают досуха при пониженном давлении. Полученное вещество перекристаллизовывают из смеси этилацетат/гексан, получая две порции целевого продукта (2,58 г, 64%) в виде беловатого твердого вещества. Т.пл. 123-125^oC. ¹Н-ЯМР (CDCI₃): 1,47 (s, 9Н), 4,38 (br.s, 2Н), 4,95 (br.s, 1Н), 7,45 (t, 1H), 7,55 (d, 1H), 8,02 (d, 2Н).

Трет-бутоксикарбонил-N-метил-3-аминометилбензойная кислота (Boc-Mamb)
Целевое соединение получают в соответствии со стандартными методиками, например, описанными Olsen, J. Org. Chem. (1970) 35, 1912), по нижеприведенной схеме.

Синтез аналогов аминометилбензойной кислоты
Интермедиаты, отвечающие нижеприведенной общей формуле, можно получить, используя стандартные синтетические методы, например, показанные на нижеследующих реакционных схемах

Для R CH₃, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₂CH₃, CH(CH₃)₂, C(CH₃)₃, CH(CH₃)CH₂CH₃, бензил, циклопентил, циклогексил см. схему 1.

Для R CH₃, CH₂CH₂CH₂CH₃, фенил см. схему 2.

Для R CH₃, фенил см. схемы 3 и 4.

Трет-бутоксикарбонил-D-2-аминомасляная кислота
Целевое соединение получают, видоизменяя ранее описанные в литературе методики (Itoh, Hagiwara and Kamiya (1975) Tett. Lett. 4393), по нижеприведенной схеме

D-2-аминомасляная кислота
D-2-аминомасляную кислоту (1,0 г, 9,70 ммоль) растворяют в 20 мл воды и добавляют раствор Boc-ON (2,62 г, 10,6 ммоль) в 20 мл ацетона. Образующийся белый осадок растворяется при добавлении триэтиламина (3,37 мл, 24,2 ммоль), давая раствор бледно-желтого цвета (pH 9, влажная индикаторная бумага). Этот раствор оставляют перемешиваться при комнатной температуре до утра, после чего при пониженном давлении удаляют ацетон. Оставшийся водный слой трижды экстрагируют эфиром, подкисляют до pH 2 добавлением концентрированной HCl, и трижды экстрагируют этилацетатом. Соединенные органические слои сушат над безводным сульфатом магния и упаривают при пониженном давлении, получая трет.-бутоксикарбонил-D-2- аминомасляную кислоту в виде масла (2,05 г, выход превышает количественный, содержит растворитель), которую далее используют без дополнительной очистки. ¹Н-ЯМР (CDCI₃): 0,98 (t, 3Н), 1,45 (s, 9Н), 1,73 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 4,29 (m, 1H), 5,05 (m, 1H).

Синтез циклических пептидов
Трет-бутоксикарбонил-З-аминометилбензойную кислоту (Boc-Mamb) химически закрепляют на оксимной смоле с помощью модифицированного метода DeGrado and Kaiser (1980) J. Org. Chem. 45,1295, используя 1 эквивалент 3-аминометилбензойной кислоты (в расчете на степень замещения смолы), 1 эквивалент HBTU и 3 эквивалента NMM. С другой стороны, Вос-Mamb (1 эквивалент) можно закрепить на оксимной смоле, используя по 1 эквиваленту DCC и ОМАР в среде хлористого метилена. Время реакции составляет от 15 до 96 ч. Затем определяют степень замещения, используя тест с пикриновой кислотой (Sarin, Kent, Tain and Merrifield, (1981) Anal. Biochem. 117, 145-157), или количественный нингидриновый анализ (Gisin (1972) Anal. Clum. Acta 58, 248-249). Непрореагировавшие оксимные группы блокируют, используя смесь 0,5 М триметилацетилхлорида/0.5 М диизопропилэтиламина в ДМФА в течение 2 ч. Удаление защитной группы Bос осуществляют, используя 25% ТФУК в дихлорметане, время гидролиза 30 мин. Остальные аминокислоты или производные аминокислот присоединяют, используя двух -десятикратный избыток (в расчете на загрузку первой аминокислоты или первого производного аминокислоты) соответствующих аминокислот или производных аминокислот и HBTU в приблизительно 8 мл ДМФА. Затем смолу нейтрализуют in situ тремя эквивалентами NMM (в расчете на использованное количество аминокислот); время синтеза составляет от 1 ч до времени, остающегося до утра. Полноту реакции определяют качественным нингидриновым анализом или тестом с пикриновой кислотой в тех случаях, когда аминокислота оказывается связанной с вторичной аминогруппой. Основываясь на этих результатах, при необходимости осуществляют повторное соединение аминокислот.

После сборки линейного пептида N концевую Boc-группу удаляют, обрабатывая 25% ТФУК в дихлорметане в течение 30 мин. Затем смолу нейтрализуют, обрабатывая ее 10% DIEA в дихлорметане. Циклизацию с одновременным отщеплением пептида от смолы осуществляют методом Osapay and Taylor (1990) J. Am, Chem. Soc. 112, 6046), суспендируя смолу примерно в 10 мл (на 1 г смолы) ДМФА, добавляя один эквивалент HOAc (в расчете на загрузку первой аминокислоты), и перемешивая при 50^oC в течение 60-72 ч. После фильтрования фильтрат (раствор в ДМФА) упаривают, остаток растворяют в HOAc или в смеси ацетонитрил-вода состава 1: 1, и лиофилизуют, получая защищенный циклический продукт. Для удаления защитных групп из боковых цепей этот продукт обрабатывают по стандартной методике безводным фтористым водородом (Stewart and Young (1984) "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd edition. Pierce Chemical Co. 85), содержащим I мл/г м-крезола в качестве поглотителя, при температуре 0^oC в течение 20-60 мин. Полученный неочищенный продукт может быть очищен методом ЖХВД с обращенными фазами с использованием препаративной 2,5-сантиметровой колонки Vydac C18 при линейном градиенте ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, с получением чистого циклизованного материала. Для синтезов по описанному способу могут быть использованы следующие аминокислоты, α -аминогруппы которых защищены Boc-группой: Boc-Atg(Tos), Boc-N- a -MeArg(Tos), Boc-Gly, Boc- Asp(OcHex), Boc-D-Leu, Boc-D-Val, Вос-D-2-аминомасляная кислота (Boc-D-Abu), Boc-Phe, Boc-D-Ser(Bzl), Boc-D-Ala, Boc-З-аминометилбензойная кислота (Boc-Mamb), Boc-D-Lys(2-ClZ), Boc- b -Ala, Boc-D-Pro, Boc- NMeGly.

Синтез соединений настоящего изобретения проиллюстрирован далее с помощью примеров. В табл. 1-6 представлены репрезентативные соединения настоящего изобретения.

Пример 1
Цикло- (Gly-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); J Gly, К NMeArg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
(Идентификация последовательности N 1)
Целевое соединение получают, используя общий способ, описанный ниже для цикло- (D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,336 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (218 мг, 84%). 200 мг пептида и 200 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный материал осаждают эфиром, повторно растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевое соединение в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (158 мг, выход превышает количественный, расчет сделан для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac С18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 2 до 11% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией полученного после хроматографии продукта. Получают целевой продукт в виде трифторацетата (пушистое твердое вещество белого цвета, выход при очистке 21% суммарный выход 16,3%). Масс-спектр: M+H 533,26.

Пример 2
Цикло-(D-Ala-NMeArg-Gly-Asp-Mamb);J D-Ala, К NMeArg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают, используя общий способ, описанный ниже для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Было найдено, что необходимо осуществить повторное присоединение остатка Boc-N-MeArg(Tos). Получают 0,244 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (117 мг, 61%). Этот пептид (110 мг) и 110 мл м-крезола обрабатывают при 0^oC в течение 1 ч безводным фтористым водородом. Неочищенный материал переосаждают из эфира, растворяют в водной HOAc, и лиофилизуют, получая целевое соединение в виде бледно-желтого твердого вещества. Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 2 до 11% при скорости 0,25% /мин, и лиофилизацией полученного после хроматографирования продукта. Получают целевое соединение в виде пушистого твердого вещества белого цвета (в форме трифторацетата). Масс-спектр: M+H 547,23.

Пример 3
Цикло-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb);J D-Abu, К NMeArg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают, используя общий способ, описанный ниже в примере 4. Получают 0,101 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (51 мг, 63%). Этот пептид (43 мг) и 50 мкл м-крезола обрабатывают при 0^oC в течение 30 мин безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт перекристаллизовывают из эфира, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевое соединение в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (23 мг, 68,7% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 7 до 14% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией полученного после хроматографирования продукта. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 31% суммарный выход 12,4% ). Масс-спектр: M+H 561,46.

Пример 4
Цикло- (D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); J D-Val, К NMeArg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
В полипропиленовую трубку объемом 25 мл, снабженную фритой, добавляют Boc-Mamb (0,126 г, 0,5 ммоль) и 6 мл ДМФА. Затем добавляют HBTU (0,194 г, 0,5 ммоль), оксимную смолу (0,52 г, степень замещения 0,96 ммоль/г) и N-метилморфолин (0,165 мл, 1,50 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем смолу тщательно промывают (объемами по 10-12 мл) ДМФА (трижды), MeOH (один раз), дихлорметаном (трижды), MeOH (дважды) и дихлорметаном (трижды). Степень замещения, определенная количественным нингидриновым анализом, составляет 0,389 ммоль/г. Непрореагировавшие оксимные группы блокируют обработкой смесью 0,5 М триметилацетилхлорида/0,5 М DIEA в ДМФА в течение 2 ч.

Затем проводят следующие стадии: (Стадия 1) Смолу промывают ДМФА (трижды), MeOH (1 раз), дихлорметаном (трижды), MeOH (дважды) и дихлорметаном (трижды). (Стадия 2) Удаляют защитную трет.-бутоксикарбонильную группу, используя 25% ТФУК. В дихлорметане в течение 30 мин. (Стадия 3) Смолу промывают дихлорметаном (трижды), MeOH (один раз), дихлорметаном (два раза), MeOH (два раза) и ДМФА (три раза). (Стадия 4) К смоле добавляют Boc -Asp(OcHex) (0,613 г, 1,94 ммоль), HBTU (0,753 г, 1,99 ммоль), 8 мл ДМФА и N-метилморфолин (0,642 мл, 5,84 ммоль), и ведут реакцию в течение 2,5 ч. (Стадия 5) Количественный нингидриновый анализ показывает, что реакция присоединения (сдваивания) прошла нацело. Стадии 1- 5 повторяют до тех пор, пока не получат требуемую последовательность. Присоединение Boc-D-Val к NMeArg контролируют, используя тест с пикриновой кислотой. После сборки линейного пептида трет. -Boc группу N-конца удаляют обработкой 25% ТФУК в дихлорметане (30 мин). Смолу тщательно промывают дихлорметаном (3 раза), MeOH (2 раза) и дихлорметаном (3 раза), и затем нейтрализуют с помощью 10% DIEA в дихлорметане (2 раза по 1 мин). Смолу тщательно промывают дихлорметаном (3 раза) и MeOH (Зраза), после чего сушат. Для циклизации берут половину смолы (0,101 ммоль); циклизацию осуществляют, обрабатывая 6 мл ДМФА, содержащего HOAc (5,8 мкл, 0,101 ммоль) и нагревая при 50^oC в течение 72 ч. Затем смолу отфильтровывают и тщательно промывают ДМФА. ДМФА-фильтрат упаривают до консистенции масла, растворяют его в смеси ацетонитрил/вода состава 1:1, и лиофилизуют, получая защищенный циклический пептид (49 мг, 69%). Этот пептид (42 мг) при 0^oC обрабатывают безводным фтористым водородом в присутствии м-крезола в качестве поглотителя в течение 30 мин, удаляя таким способом защитные группы из боковых цепей. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевое соединение в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (23 мг, 70% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 7 до 18% при скорости 0,23%/мин. Получают трифторацетат целевого соединения в виде твердого пушистого вещества белого цвета (выход при очистке 24% суммарный выход 9,4%). МС-ББА: M+H 575,45.

Пример 5
Цикло-(D-Leu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb);J D-Leu, К NMeArg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают, используя общий способ, описанный выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,115 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (92,4 мг, 98%). Пептид (92,4 мг) и 93 мкл м-крезола обрабатывают при 0^oC в течение 20 мин безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (45,7 мг, 63%), расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1 ТФУК, от 7 до 21% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией полученного при хроматографировании продукта. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 29% суммарный выход 16,5%). МС-ББА: M+H 589,48.

Пример 13f
Цикло-(D-Lys-NMeA-rg-Gly-Asp-Mamb); J D-Lys, К NMeArg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают, используя общий способ, описанный выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Для закрепления Boc-Mamb на смоле используют способ с применением DCC/DMAP. Получают 0,586 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (349 мг, 58,9%). Пептид (334 мг) и 334 мкл анизола при 0^oC в течение 30 мин обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водном ацетонитриле и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (168 мг, 79,1% расчет для дифторида). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac С18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 5,4 до 14,4% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 33,6% суммарный выход 12,1%). МС-ББА: M+H 604,32.

Пример 18
Цикло-(NMeGly-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); J NMeGly, К NMeArg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
(Идентификация последовательности N 6)
Целевое соединение получают, используя общий способ, описанный выше для цикла-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Для закрепления Boc-Mamb на оксимной смоле используют способ с применением DCC/DMAP. Получают 0,43 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (205 мг, 60%). Пептид (200 мг) и 200 мкл м-крезола при 0^oC в течение 30 мин обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный материал высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества желтого цвета (148 мг, 97% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 7 до 22% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 14,7% суммарный выход 7,9%). МС-ББА: M+H 547,34.

Пример 24
Цикло-(Pro-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); J Pro, К NMeArg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
(Идентификация последовательности N 3)
Целевое соединение получают по способу, описанному выше для цикло - (D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Для закрепления Boc-Mamb на оксимной смоле используют способ с DCC/DMAP. Получают 0,43 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (170 мг, 48,8%). Пептид (164 мг) и 164 ммоль м-крезола при 0^oC в течение 30 мин обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (101 мг, 79% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 7 до 22% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетатную соль целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 5,8% суммарный выход 2,1%). МС-ББА: M+H 573,46.

Пример 25
Цикло-(D-Pro-NMeArg-Gly-Asp-Mamb);J D-Pro, К NMeArg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по способу, описанному выше для цикло- (D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Для закрепления Boc-Mamb на оксимной смоле используют способ с DCC/DMAP. Получают 0,43 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (211 мг, 60,8%). Пептид (200 мг) и 200 мкл м-крезола при 0^oC в течение 30 мин обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный материал осаждают эфиром, растворяют в водном HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (145 мг, 93,3% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 7,0 до 22,0% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 6,4% суммарный выход 3,3%). МС-ББА: M+H 573,35.

Пример 28с
Цикло-(b-Ala-NMeArg-Gly-Asp-Mamb);J b-Ala, К NMeArg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
(Идентификация последовательности N 2)
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Для закрепления Boc-Mamb на оксимной смоле используют способ с DCC/DMAP. Получают 0,586 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (264 мг, 57,5%). Пептид (258 мг) и 258 мкл анизола при 0^oC в течение 30 мин обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный материал высаживают эфиром, растворяют в водном ацетонитриле и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (231 мг, выход превышает количественный, расчет для фторида). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac С18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 5,4 до 14,4% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают целевое вещество в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 53,2% суммарный выход 32,5% трифторацетат). МС-ББА: M+H 547,28.

Пример 29
Цикло-(Gly-Arg-Gly-Asp-Mamb); J Gly, К Arg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
(Идентификация последовательности N 5)
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,283 ммоль линейного пептида; половину этого количества циклизуют, получая защищенный циклический пептид (62 мг, 58% ). Пептид (60 мг) и 60 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (48 мг, выход превышает количественный, расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac С18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 0 до 9% при скорости 0,30%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 36% суммарный выход 19,9% ). МС-ББА: M+H 519,26.

Пример 30
Цикло-(D-Ala-Arg-Gly-Asp-Mamb);J D-Ala, К Arg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,189 ммоль линейного пептида, который циклизуют, получая защищенный циклический пептид (211 мг, выход превышает количественный). Пептид (195 мг) и 195 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (125 мг, 83% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 2 до 11% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 12,5% суммарный выход - 13,8%). МС-ББА: M+H 533,26.

Пример 31
Цикло-(Ala-Arg-Gly-Asp-Mamb); J Ala, К Arg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,324 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (191 мг, 76,4%). Пептид (100 мг) и 100 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевое соединение в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (75 мг, 97,4% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК. от 2 до 11% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 15,5% суммарный выход 10,5%). МС-ББА: M+H 533,25.

Пример 32
Цикло-(D-Val-Arg-Gly-Asp-Mamb); J D-Val, К. Arg, L Gly, M Asp R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,193 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (199 мг, выход превышает количественный). Пептид (193 мг) и 193 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт высаживают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (130 мг, 86% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 2 до 13% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 57% суммарный выход 58,1%). МС-ББА: M+H 561,22.

Пример 33
Цикло-(D-Leu-Arg-Gly-Asp-Mamb); J D-Leu, К Arg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,202 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (152 мг, 93%). Пептид (150 мг) и 150 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт осаждают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (78 мг, 66% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 5 до 18% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 26% суммарный выход 14,8%). МС-ББА: M+H 575,45.

Пример 34
Цикло-(D-Abu-Arg-Gly-Asp-Mamb); J D-Abu, К Arg, L Gly, M Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,193 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (210 мг, выход превышает количественный). Пептид (206 мг) и 206 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт осаждают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (158 мг, 99% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac С18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК. от 2 до 11% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 57% суммарный выход 72,2%).

МС-ББА: M+H 547,21.

Пример 35
Цикло-(D-Ser-Arg-Gly-Asp-Mamb); J D-Ser, К Arg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,193 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (224 мг, выход превышает количественный). Пентод (210 мг) и 210 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт осаждают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (145 мг, 89% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac С18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 2 до 13% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 22% суммарный выход 27%).

МС-ББА: M+H 549,31.

Пример 36
Цикло-(D-Phe-Arg-Gly-Asp-Mamb); J D-Phe, К Arg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,266 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (202 мг, 90%). Пептид (157 мг) и 157 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный продукт осаждают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно -желтого цвета (125 мг, выход превышает количественный, расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 7 до 23% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 35% суммарный выход - 29,3%).

МС-ББА: M+H 609,25.

Пример 37
Цикло-(Phe-Arg-Gly-Asp-Mamb); J Phe, К Arg, L Gly, М Asp, R¹ R² H
(Идентификация последовательности N 4)
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Получают 0,335 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (306 мг, выход превышает количественный). Пептид (275 мг) и 275 мкл м-крезола при 0^oC в течение 1 ч обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный материал осаждают эфиром, растворяют в водной HOAc и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (214 мг, 98% расчет для уксуснокислой соли). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУК, от 9 до 230/0 при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 32% суммарный выход 31,5%).

МС-ББА: M+H 609,26.

Пример 48а
Целевое соединение можно получить способом, описанным Mosher et al. Tett. Lett. 29, 3183-3186, в соответствии с приведенной ниже схемой. Этот же способ, как правило, используется для превращения первичной аминогруппы в гуанидиновую группу.

Примеры 42-45
Синтез соединений примеров 42-45 представлен на схеме 5.

Примеры 46 и 47
Соединения примеров 46 и 47 получают, используя стандартные способы, например, описанные в Tett. Lett. (1990) 31:1969-1972 или в патенте Канады 2008311, в соответствии со схемой 6. Во избежание побочных реакций аспарагиновая кислотная группа может быть защищена, например, фенацильной защитной группой.

Пример 54
Цикло-(D-Val-NMeArg- β -Ala-Asp-Mamb); J D-Val, К NMeArg, L b -Ala, M Asp, R¹ R² H
Целевое соединение получают по общему способу, описанному выше для цикло-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Для закрепления Boc-Mamb на оксимной смоле используют способ с DCC/DMAP. Получают 0,586 ммоль линейного пептида, который циклизуют в защищенный циклический пептид (227 мг, 46,9%). Пептид (219 мг) и 219 мкл анизола при 0^oC в течение 30 мин обрабатывают безводным фтористым водородом. Неочищенный материал высаживают эфиром, растворяют в водном ацетонитриле и лиофилизуют, получая целевой продукт в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (150 мг, 93,2% расчет для фторида). Очистка завершается ЖХВД с обращенными фазами на препаративной колонке Vydac C18 (2,5 см) с использованием градиента ацетонитрила, содержащего 0,1 ТФУК, от 7,2 до 16,2% при скорости 0,23%/мин, и лиофилизацией. Получают трифторацетат целевого соединения в виде пушистого твердого вещества белого цвета (выход при очистке 43,6% суммарный выход 16,5%
МС-ББА: М+H=589,32.

Примеры 55-58
Синтез соединений примеров 55-58 показан на схеме 7.

Испытание на агрегацию тромбоцитов: Венозную кровь берут из руки здорового человека (донора), не принимавшего лекарств и аспирина в течение как минимум двух недель перед взятием крови. Кровь отбирают в 10-мл нитратные пробирки Вакутайнера. Кровь центрифугируют в течение 15 мин при 150 x g при комнатной температуре, после чего отбирают богатую тромбоцитами плазму (БТП). Оставшуюся кровь центрифугируют в течение 15 мин при 1500 x g, после чего отбирают бедную тромбоцитами плазму (БдТП). Образцы испытывают на арегометре (PAP-4 Platelet Aggregation Profiler), используя БдТП в качестве нулевой точки отсчета (100% пропускания). В каждую микропробирку для испытаний добавляют 200 мкл БТП, и принимают пропускание за 0% В каждую пробирку добавляют по 20 мкл различных веществ, обладающих сродством к рецепторам (АДФ, коллаген, арахидонат, эпинефрин, тромбин), и регистрируют кривые агрегации (зависимость% пропускания от времени). Результаты представлены как% ингибирования агрегации тромбоцитов, вызванной веществами, обладающими сродством к рецепторам. Для определения IC₅₀ тестируемые соединения добавляют в разных концентрациях перед активацией тромбоцитов.

Испытание на связывание Фибриногена с тромбоцитами: Связывание ¹²⁵I фибриногена с тромбоцитами проводят в соответствии с методом, описанным Bennett et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2417-2422, внося в него некоторые модификации, которые описаны ниже. БТП человека (ч-БТП) пропускают через колонку с Sepharose для очистки фракций тромбоцитов. Аликвоты тромбоцитов (5·10⁸ клеток) вместе с 1 мМ хлорида кальция добавляют в чашки, содержащие 96 удаляемых ячеек, перед активацией гель-очищенных тромбоцитов человека (ч-ГОТ). Активацию ч-ТОТ осуществляют с помощью АДФ, коллагена, арахидоната, эпинефрина и/или тромбина в присутствии лиганда - ¹²⁵I-фибриногена. Связанный с активированными тромбоцитами фибриноген отделяют от несвязанного фибриногена центрифугированием и определяют радиоактивность гамма-счетчиками. Для определения IC₅₀ тестируемые соединения добавляют в разных концентрациях перед активацией тромбоцитов.

Дозировки и лекарственные формы
Соединения настоящего изобретения можно вводить в организм любыми способами, которые могут создать контакт между активным агентом и местом его действия, то есть гликопротеином IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), в организме млекопитающего. Они могут быть введены любым известным способом, доступным для применения лекарственных средств, в виде индивидуальных терапевтических агентов или в сочетании с другими терапевтическими агентами, такими как, например, второй противотромбоцитный агент, например аспирин или тиклопидин, которые являются специфическими в отношении отдельных веществ, обладающих сродством к рецепторам. Они могут быть введены в чистом виде, но, как правило, вводятся вместе с фармацевтическим носителем, который определяют, исходя из выбранного пути введения и общепринятой фармацевтической практики.

Вводимая доза, разумеется, меняется в зависимости от ряда факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного агента и путь и способ его введения; возраст, состояние здоровья и вес реципиента; природы и выраженности симптомов; вида сопутствующего терапевтического лечения; частоты терапевтического воздействия и от желаемого эффекта. Дневная доза активного ингредиента может составлять от около 0,01 до около 10 мг на килограмм веса тела.

Дозировочные формы (композиции, пригодные для введения) содержат от около 1 мг до около 100 мг активного ингредиента на дозировочную единицу. В этих лекарственных композициях активный ингредиент обычно присутствует в количестве от около 0,5 до около 95% от общего веса композиции.

Активный ингредиент можно вводить оральным путем в виде твердых дозировочных форм, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в виде жидких дозировочных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Их можно также вводить парентерально, в форме стерильных жидких дозировок.

Желатиновые капсулы содержат активный ингредиент и порошкообразные носители, такие как лактоза, крахмал, производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота и т.д. Аналогичные разбавители могут быть использованы для изготовления прессованных таблеток. И таблетки, и капсулы могут быть выполнены как системы пролонгированного выделения, обеспечивающие продолжительное выделение активного ингредиента на протяжении часов. Прессованные таблетки могут быть покрыты сахаром или пленкой для маскировки неприятного вкуса и предохранения таблеток от атмосферного воздействия, или покрыты энтросолюбильной оболочкой, которая селективно разрушается в желудочно -кишечном тракте.

Жидкие дозировочные формы для орального введения могут содержать цветовые и ароматические добавки для придания большей привлекательности.

Как правило, подходящими носителями для парентеральных растворов являются вода, приемлемые масла, физиологический раствор, водный раствор глюкозы (декстрозы) и растворы родственных сахаров, а также гликоли, такие как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Растворы для парентерального введения предпочтительно содержат водорастворимую соль активного ингредиента, подходящие стабилизаторы и, если необходимо, буферные соединения. Подходящими стабилизирующими соединениями являются антиоксиданты, такие как бисульфит натрия, сульфит натрия, или аскорбиновая кислота, в индивидуальном виде или в сочетании друг с другом. Используются также лимонная кислота и ее соли и натрия-ЭДТА. Кроме того, парентеральные растворы могут содержать консерванты, такие как бензальконийхлорид, метил- или пропил-парабен и хлорбутанол.

Подходящие фармацевтические носители указаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, который является повсеместно цитируемым источником в данной области техники.

Предпочтительные лекарственные дозировочные формы для введения соединений настоящего изобретения иллюстрируются ниже.

Капсулы
Приготавливают большое количество капсул, наполняя стандартные, состоящие из двух частей, жесткие желатиновые капсулы 100 мг порошкообразного активного ингредиента, 150 мл лактозы, 50 мг целлюлозы и 6 мг стеарата магния.

Мягкие желатиновые капсулы
Приготавливают смесь активного ингредиента с усваиваемым организмом млекопитающего маслом, таким как соевое масло, масло хлопчатника или оливковое масло. Эту смесь вводят с помощью нагнетательного насоса в желатин, получая мягкие желатиновые капсулы, содержащие 100 мг активного ингредиента. Капсулы промывают и сушат.

Таблетки
Стандартными методами готовят большое число таблеток, каждая из которых содержит 100 мг активного ингредиента, 0,2 мг коллоидной двуокиси кремния, 5 мг стеарата магния, 275 мг микрокристаллической целлюлозы, 11 мг крахмала и 98,8 мг лактозы. На таблетки можно нанести покрытие, служащее для улучшения вкуса или для замедления поглощения активного ингредиента.

В нижеследующих табл. 1-8 приведены характерные представители соединений настоящего изобретения.

Биологическая активность всех соединений указана как определение IC₅₀ в испытании на агрегацию тромбоцитов. Определения IC₅₀ выражены как + + + <1 мкМ, + + 1 мкМ и + 10 мкМ до 100 мкМ, где мкМ означает микромолекулярный.

Формула изобретения

1. Циклические пептиды формулы I

или их фармацевтически приемлемые соли,
где R¹ H, C₁ C₄-алкил, фенил, бензил;
R² H или низший алкил;
R¹⁰ H, галоген; n 1, n^, 0;
j D-Ala, D-Yal, D-Ile, D-Leu, DNle, D-фенилGly, D-bhe, D-Lys, D-Orn, D-Met, D- Pro, β-Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D циклогексил; Gly D - циклогексилметилGly, D-норвалин, D- 2-аминомасляная кислота, D- 2-аминопенатновая кислотаGly, Nε-p-азидобензоил-D-Lys, Nε- p-бензоилбензоил-D -Lys, Nε-p-ацетобензоил-D-Lys, Nε- дансил-D-Lys, Nε-t-бутоксикарбонилглицил-D-Lys, Nε-глицил-D-Lys, Nε-p-бензоилбензоилглицил-D-Lys, Nε-p-фенилбензоил-D-Lys, Nε-m-бензоилбензоил-D-Lys или Nε-o-бензоилбензоил-D-Lys;
K αNMeArg, Nδ, Nα-диМе-Nδ-гуанидинилOrn, Nα-MeLys или Nε, Nα-диМеLys;
L Gly;
M выбирают из Asp, β- MeAsp или NMeAsp.

2. Пептиды по п.1,
где R¹ H, C₁ C₄-алкил, фенил, бензил;
R² H или метил;
R¹⁰ H, галоген;
j D-Ala, D-Val, D- Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-Lys, D-Orn, D- Met, D-Pro, β-Ala,, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D- циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляная кислота, D-2-аминопентановая кислотаGly, Nε-p-азидобензоил-D-Lys, Nε-p -бензоилбензоил-D-Lys, Nε-p-ацетобензоил-D-Lys, Nε-дансил-D-Lys, Nε-t-бутоксикарбонил-глицил-D-Lys, Nε-глицил-D-Lys, Nε- p-бензоилбензоил-глицил-D-Lys, Nε-p-фенилбензоил-D-Lys, Nε- m-бензоилбензоил-D-Lys или Nε-p-бензоилбензоил-D-Lys;
K αNMeArg, Nδ, Nα- диМе-Nδ-гуанилOrn, Nα-MeLys или Nε, Nα-диMeLys;
L GIy;
M выбирается из Asp, β-MeAsp или NMeAsp.

3. Пептиды по п.2,
где R¹ H, C₁ C₄-алкил, фенил, бензил;
R² H или метил;
R¹⁰ H, галоген;
j D Ala, D Val, D Ile, D Leu, D Nle, D фенилGly, D Phe, D Lys, D Orn, D Met, D Pro, β-Ala, D Tyr, D Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляную кислоту, Nε- p-азидобензоил-D-Lys, Nε-p-бензоилбензоил-D- Lys, Nε- p-ацетобензоил-D- Lys, Nε-дансил-D- Lys, Nε-t-бутоксикарбонил глицил-D -Lys, Nε-глицил-D -Lys, Nε-p-бензоилбензоилглицил-D-Lys, Nε- p-фенилбензоил-D-Lys, Nε-m-бензоилбензоил-D-Lys или Nε- O-бензоилбензоил-D-Lys;
K αNMeArg,
L GIy;
M выбирается из Asp, β- MeAsp или NMeAsp.

4. Пептиды по п.2,
где R¹ и R² независимо выбираются из H или метила;
R¹⁰ H;
j выбирается из D Val, D-2-аминомасляной кислоты, D Leu, D Ala, D - Pro, D Ser, D Lys, β-Ala, NMeGly, D Nle, D-фенилGly, D Ile, D Phe, D - Tyr;
K αNMeArg;
L представляет Gly;
M выбирается из Asp, β-MeAsp или NMeAsp.

5. Пептиды по п.2, которые выбирают из группы соединений, у которых R¹, R² и R¹⁰ H;
j D Val;
K представляет NMeArg;
L Gly;
M Asp,
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ представляют H;
j D-2-аминомасляная кислота;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D Leu;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D Ala;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D Pro;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ метил (изомер I);
R² и R¹⁰ H;
j D Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ метил (изомер 2);
R² и R¹⁰ H;
j D Yal;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I
где R¹ фенил (изомер I);
R² и R¹⁰ H;
j D Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D Met;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-2-аминомасляная кислота;
K Nδ, Nα-диМе-Nδ-гуанинидилOrn;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-2-аминомасляная кислота;
K Nε, Nα-диMeLys,
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε- p-азидобензоил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j N-n-бензоилбензоил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-триптофанил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-o-бензилбензоил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε- p-ацетилбензоил-D-LyS;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-дансил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-глицил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-p-бензоилбензоилглицил-D- Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε- p-фенилбензоил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-m-бензоилбензоил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε- o-бензоилбензоил-D-Lys;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения фрмулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-Nle;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-фенилGly;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-Ile;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-Phe;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-Cl;
j D Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-J;
j D-Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-J;
j D-2-аминомасляная кислота;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-Me;
j D-Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 6-Cl;
j D-Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соедиения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 6-метокси;
j D-Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 6-Me;
j представляет D Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-CI;
j D-2-аминомасляная кислота;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-J;
j D-2-аминомасляная кислота;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R² H;
R¹⁰ 4-Me;
j D-2-аминомасляная кислота;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-Tyr;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹ и R¹⁰ H;
R² CH₃;
j D-Val;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-циклогексилGly;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j Nε-t-бутоксикарбонилглицил-D-LyS;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp;
соединения формулы I,
где R¹, R² и R¹⁰ H;
j D-Ser;
K NMeArg;
L Gly;
M Asp.

6. Пептиды по п.1,
где R¹ H, C₁ C₄-алкил, фенил;
R² H или метил;
R¹⁰ H, галоген;
j D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Nle, D-фенилGly, D-Phe, D-LyS, D-Orn, D-Met, D-Pro, β-Ala, D-Tyr, D-Ser, NMeGly, D-циклогексилGly, D-циклогексилметилGly, D-норвалин, D-2-аминомасляная кислота, D-2-аминопентановая кислота Gly, Nε- p-азидобензоил-D-Lys;
K Nδ, Nα-диMe-Nδ-гуанидинилOrn, Nα- диMeLys;
L Gly;
M из Asp, β-MeAsp или NMeAsp.

7. Пептиды по п.6,
где j означает D- Ala, D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Pro, D-Ser или D-Lys.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью ингибировать действие тромбоцитов, включающая в качестве активного начала производное пептида, отличающаяся тем, что в качестве производного пептида она содержит эффективное количество циклического пептида по пп. 1 7.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26