Применение креатинфосфата для лечения опухолей и фармацевтические препараты, обладающие противоопухолевой активностью

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается применения креатинфосфата и его фармацевтически приемлемых солей и фармацевтических композиций на их основе. Изобретение особенно пригодно для лечения опухолей, не поддающихся лечению химиотерапией. 2 с. и 2 з. п. ф-лы. 7 табл.

Изобретение относится к применению соединений, имеющих фосфамидную связь или фосфатную связь энола, для получения фармацевтических препаратов, предназначенных для лечения опухолей.

В настоящем описании под соединением, имеющим фосфамидную связь, подразумевается любое соединение, химическая структура которого содержит группу Предпочтительным примером такого соединения является фосфокреатин (называется также фосфатом креатина) широко распространенное вещество в организме позвоночных животных. Он присутствует в частности в поперечно-полосатых мышцах, но отсутствует в крови и внеклеточной жидкости. Другим примером такого соединения является фосфоаргин, который найден в мышцах беспозвоночных животных.

Подобным образом, под соединением, имеющим фосфатную связь энола, подразумевается любое соединение, химическая структура которого содержит группу Предпочтительным примером таких соединений является фосфоенолпировиноградная кислота, которая является промежуточным эндогенным метаболитом, вовлеченным в гликолиз, и которая поэтому в физиологических условиях локализована в клетках и отсутствует в крови.

Фосфамидная связь или фосфатная связь энола указанных выше соединений относится к семейству так называемых обогащенных энергий связей.

Документы EP-A-0199117 и EP-A-0222257 описывают в общих выражениях применения фосфокреатина и его натриевой соли в кристаллической форме для лечения заболеваний сердца, в частности инфаркта миокарда.

В документе WO 83/02391 описаны в общих выражениях фармацевтические препараты, содержащие соль фосфоенолпировиноградной кислоты в смеси с аденозинтрифосфорной кислотой (АТФ). Эти препараты предназначены для лечения и профилактики повреждения, вызванного ишемией клеток.

Документ US-4769318 относится к растворам, содержащим различные производные фосфоенолпировиноградной кислоты. Эти растворы предназначены для консервирования крови.

Наконец, в документе EP-A-239-357 описано применение мононатриевой соли фосфоенолпировиноградной кислоты для лечения заболевания сердца и почек, связанного с ишемией.

Было обнаружено и это является основой настоящего изобретения, что соединения, имеющие фосфамидную связь или фосфатную связь энола, обладают ценными, неизвестными формакологическими свойствами, в частности заметно проявляемой противоопухолевой активностью.

Таким образом, настоящее изобретение относится в основном к применению по меньшей мере одного соединения, имеющего обогащенную энергией связь (фосфамидную связь или фосфатную связь энола), для получения фармацевтических препаратов, предназначенных для лечения опухолей.

В одном типичном предпочтительном примере осуществления изобретения в качестве соединения, имеющего обогащенную энергией связь, применяют фосфатокреатин и его фармацевтически пригодные соли, в частности натриевые соли.

В другом примере соединением, имеющим обогащенную энергией связь, является фосфоенолпировиноградная кислота и ее фармацевтически пригодные соли, в частности натриевые соли.

Фармацевтические препараты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, особенно пригодны для лечения свежих опухолей или опухолей, которые оказались устойчивыми к химиотерапии, например, аденокарцином (ободочной кишки, поджелудочной железы, желудка, бронхов, почек, молочной железы, матки, яичников), эпидермоидных карцином (верхнего дыхательного - пищеварительного тракта, бронхов, мочевых путей, заднего прохода, кожи), злокачественной меланомы, саркомы мягких тканей, лейкемии, лимфомы и множественной миеломы.

Эти фармацевтические препараты будут приготовлять обычными способами и вводить внутривенно, в форме пилюли или препарата для прерывистой или непрерывной перфузии, внутриартериально, внутрибрюшинно или внутримышечно в дозах от 50 мг до 5 г/кг тела на 24 ч.

В соответствии с одной из характеристик настоящего изобретения фармацевтический препарат выпускается в виде доз на один прием.

Предпочтительная дозированная единица содержит 0,1-50 г активного компонента.

В предпочтительном варианте препарат выпускают в виде инъецируемого препарата, содержащего 0,1-50 г активного компонента.

В одном предпочтительном примере осуществления изобретения активный компонент разбавлен наполнителем, совместимым со способом введения препарата. Применяют хорошо известные наполнители, примерами которых являются: маннит; сорбит; фосфатный буфер, содержащий безводный вторичный кислый фосфат натрия/первичный кислый фосфат натрия; цитратный буфер, содержащий цитрат натрия/лимонную кислоту; лактатный буфер, содержащий лактат натрия/молочную кислоту;
хлористый натрий.

В нашем предпочтительном примере осуществления изобретения активный компонент можно разбавить реконструирующим растворителем, совместимым со способом введения препарата.

Применяют хорошо известные реконструирующие растворители, примерами которых являются:
вода для инъецируемых препаратов;
0,9%-ный раствор NaCl;
5-15%-ный раствор глюкозы;
10-30%-ный раствор маннита;
20-30%-ный раствор сорбита;
раствор тринатриевой соли лимонной кислоты.

Целью настоящего изобретения является также способ лечения опухолей у людей путем введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, имеющего фосфамидную связь или фосфатную связь энола.

Фармакологические свойства соединений, имеющих фосфамидную связь или фосфатную связь энола, были показаны на примере проведения различных исследований для оценки действия фосфокреатина на различные опухолевые клетки. Действие это неоспоримо обусловлено присутствием фосфамидной связи в его молекуле.

Дополнительные опыты с фосфоенолпировиноградной кислотой показывают, что аналогичные фармакологические свойства можно достичь при применении соединений, имеющих фосфатную связь энола.

Экспериментальные протоколы и результаты, позволившие показать формакологические свойства соединений, имеющих фосфамидную связь или фосфатную связь энола, приведены ниже.

1. Способ.

1.1. Принцип изобретения.

Образование опухолей у "голой" мыши вызывали подкожным инокулированием раковых клеток. Через неделю после инокулирования внутрибрюшной инъекцией вводили фосфокреатин, обозначенный далее как UP-999-247, или NaCl. В процессе лечения животных взвешивали и размер опухоли измеряли каждую неделю.

1.2. Методика.

1.2.1. Развитие рака человека у "голых" мышей.

Четырехнедельных "голых" мышей штамма Swiss выращивали в изоляторе (стерильная среда) под давлением.

Линии раковых клеток человека, а именно Сасо2 (ободочной кишки), SK-MEL5 (меланомы), Capan-1 (поджелудочной железы) и NCI-H69 (мелкоклеточного рака легких), культивировали в различных средах, содержащих 10-20% сыворотки плода теленка и 1% неосновных аминокислот.

5·10⁶ (SK-MEL5), 9·10⁶ (Caco2), 2·10⁵ (Capan-1) и 2,3·10⁶ (NCI-H69) клеток в забуференном фосфатном физиологическом растворе инокулировали в правый бок каждой мыши. Операцию проводили в камере в стерильных условиях.

Каждую неделю после инокулирования животных взвешивали и измеряли у них опухоль штангенциркулем.

Объем опухоли (полуэллипсоидной) подсчитывали при помощи следующей формулы (DETHLEFSENL.A. PRNITT I.M.S. MENDELSOHN M.L. Анализ кривых роста опухолей. J. Natl. Cancer Institute, 1968.40, 368-408, RADULOVIC S. MILLER G. SCHALLY A.V. Ингибирование роста ксенотрасплантантантов рака ободочной кишки человека HT-29 в "голых" мышах лечением антагонистом пептида, высвобождающего бомбезин/гастрин (RC-3095). Cancer Res. 1991, 51, 6006-6009:

1.2.2. Изучение влияния UP 999-247 на рост опухоли.

Лечение начинают через 7 дн после инокулирования путем внутрибрюшинной инъекции UP 999-247 (группа, подвергнутая лечению) или изотонического раствора (контрольная группа). Каждая группа содержит 10-15 мышей. Животные, индивидуально идентифицированные татуировкой на спине, разделяют по макролоновым камерам.

Продолжительность лечения зависит от цели лечения для каждой изучаемой серии.

После окончания лечения опухоли удаляют и закрепляют в фиксаторе Bouin для патологоанатомического анализа.

1.2.3. Схема введения.

Изучаемый продукт применяют в 0,9%-ном растворе NaCl. Его стерилизуют при помощи 0,2 мкм фильтра. Раствор вводят внутрибрюшинно в количестве 1 мл/мышь. Контрольным животным вводят 1 мм 0,9%-ного раствора хлористого натрия.

Схема дозирования предусматривает инъецирование 0,04; 0,1; 0,2 и 0,4 ммоля UP 999-247 каждой мыши. Эти дозы выбраны соответственно максимальной дозе, которую можно вводить внутрибрюшинно, и соответственно концентрации плазмы, определенной заранее в фармококинетических исследованиях.

1.2.4. Выражение результатов.

Из полученных измерением отдельных величин рассчитаны следующие параметры:
масса тела в г, (среднее значение ± стандартное отклонение), измеряемая каждую неделю;
объем опухоли в мм³ (среднее значение ± стандартное отклонение), измеряемый каждую неделю.

2. Результаты.

Результаты представлены в помещенных ниже табл. 1-7.

Полученные результаты указывают на ингибирование роста опухоли после введения фосфокреатина "голым" мышам с различными установленными опухолями человека. Ингибирование зависит от дозы соединения.

Изменение массы и поведение животных соответствовали экспериментальному периоду. Биохимические и гематологические измерения проводили на плазме и крови, отобранных после надреза животных.

В описанных экспериментальных условиях фосфокреатин не вызывал летального исхода.

Наблюдаемое отклонение относится к группе животных, которым ввели самые высокие дозы, вызывающие умеренное повышение содержания трансаминазы и натрия и понижение содержания щелочных фосфатов и элементов крови. Другие изменения находятся в соответствии с колебаниями, обычно наблюдаемыми у крыс.

Фосфокреатин проявляет прекрасную биологическую толетарность при дозах до 2400 мг/кг, введенных внутривенно. Подобным образом, фосфоенолпировиноградная кислота имеет хорошую биологическую толерантность при введении крысам в дозах до 50 мг/кг и не индуцирует летальный исход.

Некоторые примеры фармацевтических препаратов на основе соединения, имеющего фосфамидную связь или фосфатную связь энола, будут приведены ниже.

Фосфокреатин может быть в виде готового к применению стерильного раствора или в виде стерильного порошка или лиофилизатора. В этом случае можно применять наполнитель без фармакологической активности. В качестве наполнителя применяют лактозу, маннит, фосфатный буфер, содержащий безводный первичный кислый фосфат натрия/вторичный кислый фосфат натрия, цитратный буфер, содержащий цитрат натрия/лимонную кислоту, молочный буфер, содержащий лактат натрия/молочную кислоту, хлористый натрий или смесь этих наполнителей в любых пропорциях. Наполнитель применяют хорошо известным способом.

В качестве реконструирующего растворителя используют либо инъекционные растворители для обычного применения (0,9%-ный раствор NaCl, 5%-ный или 15% -ный раствор глюкозы, 20-30%-ный раствор сорбита, раствор тринатриевой соли лимонной кислоты или инъецируемый препарат) или любой другой обычно применяемый растворитель для перфузии.

Фармацевтический препарат рекомендуется применять в виде стерильного лиофилизатора, содержащего 25 г фосфокреатина, реконструированного 100 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия.

Пример 1
Цитратный буфер pH 7
Лимонная кислота, 0,0329
Na₂HPO₄·2H₂O, 0,253
Глюкоза, 5
Вода для инъецируемого препарата, gsg 100
Если применяют лиофилизат, то для инъецируемых препаратов растворителем служит вода.

Пример 2
Фосфатный буфер pH 7,2
Na₂HPO₄·2H₂O, 0,758
Na₂HPO₄, 0,184
NaCl, 0,44
Вода для инъецируемого препарата, gsg 100
Пример 3
Маннит
Вода для инъецируемого препарата, gsg 100
Если применяют лиофилизат, то растворителем для инъецируемых препаратов служит вода.

Пример 4
Глюкоза, 5
Вода для инъецируемого препарата, gsg 100
Если применяют лиофилизат, то растворителем для инъецируемых препаратов служит вода.

Пример 5
KH₂PO₄, 0,178
Na₂HPO₄·2H₂O, 0,953
Глюкоза, 2
Вода для инъецируемого препарата, gsg 100
Если применяют лиофилизат, то растворителем для инъецируемых препаратов служит вода.

Пример 6
Стерильный порошок для внутривенных или внутримышечных инъекций, который содержит: креатинфосфат, двунатриевая соль, 4H₂O 10 г.

Пример 7
Стерильный лиофилизат для внутривенных или внутримышечных инъекций, который содержит: креатинфосфат, двунатриевая соль, 4H₂O 10 г; маннит 1 г.

Пример 8
Стерильный лиофилизат для внутривенных или внутримышечных инъекций, который содержит: креатинфосфат, двунатриевая соль, 4H₂O 10 г; глюкоза 1 г.

Формула изобретения

1. Применение по меньшей мере одного соединения, выбранного из креатинфосфата и его фармацевтически приемлемых солей, для ингибирования или снижения роста опухоли у млекопитающих.

2. Применение по п.1, в котором фармацевтически приемлемой солью является натриевая соль.

3. Фармацевтическая композиция для ингибирования или снижения роста опухоли у млекопитающих, содержащая активное начало и фармацевтический приемлемый носитель, отличающаяся тем, что активное начало выбрано из креатинфосфата и его фармацевтически приемлемых солей, в частности натриевой соли, в количестве 0,1 50 г на композицию.

4. Композиция по п.3 в инъекционной форме.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7