Производное пиранона, способ его получения и фармацевтическая композиция

 

Новое соединение, которые мы назвали Лейстродуксин H, имеет формулу (I) и его фармацевтически приемлемые соли. Это соединение может быть приготовлено путем гидролиза встречающихся в природе лейстродуксинов и может применяться для лечения и профилактики тромбоцитопении. 3 с. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение обеспечивает новое соединение, которое мы назвали лейстродуксин H (Leustroducsin H) и которое имеет формулу (I), приведенную в описании. Изобретение обеспечивает также способ получения этого соединения, а также композицию и способы лечения с использованием этого соединения.

Соединения изобретения являются новым соединением, которое стимулирует образование лимфоцитов и, следовательно, является полезным для лечения тромбоцитопении. Тромбопения может быть вызвана различными причинами, такими как иммунные нарушения или неблагоприятные реакции на химиотерапию или радиотерапию опухолей. Это тяжелое заболевание, которое, будучи отягощено, вызывает кровотечения во всем теле и иногда может служить причиной смерти. В настоящее время единственным надежным способом лечения тромбопении является симптоматическое, включающее трансфузию тромбоцитов.

Известны различные типы цитокинов, обладающих гемопоэтической (кроветворной) активностью. Они включают определенные интерлейкины, например, интерлейкин 6 (в настоящем документе используется сокращение ИЛ-6), интерлейкин II (ИЛ-II) и фактор, ингибирующий лейкемию (ФИЛ). Среди прочих свойств известно, что эти соединения стимулируют выработку тромбоцитов и в качестве таковых предположительно являются полезными в клинике (Ishibashi и др. Blood 74, 1241-1244 (1989), Asano и др. Blood 75, 1602-1605 (1990); Okada др. Blood' Tumor 22, 23-31, (1991). Было обнаружено, что введение этих соединений людям различными путями приводит к отчетливым фармакологическим эффектам, что влечет за собой возможное применение этих соединений в терапии. Однако думается, что эти соединения в значительной степени вырабатываются in vivo определенными видами клеток (например, лимфоцитами, моноцитами, фибробластами, клетками индотелия сосудов и клетками стромы) посредством сложной регуляторной системы и что они играют гомеостатическую роль в выработке различных видов клеток крови. Соответственно если эти соединения применять без оглядки на тонкий баланс этого регуляторного механизма, могут наблюдаться побочные эффекты, вызванные разбалансировкой этого регуляторного механизма; примеры таких побочных эффектов включают повреждения печеночной ткани, потери веса, лихорадку и озноб.

Известно также, что различные виды низкомолекулярных иммуноактиваторов, таких как мурамилдипептиды (МДП), способны повышать общее количество тромбоцитов (R. Nakajima и др. Arzneimittel-Forsch/Drug Research 41, 60-65 (1989). Предполагают, что эти соединения стимулируют выработку ИЛ-6 косвенно, посредством активирования моноцитов и макрофагов. Выработанный ИЛ-6 затем вызывает повышение количества тромбоцитов. Однако известно также, что одновременно наблюдаются другие, возможно, менее желательные, физиологические эффекты, основанные на активации макрофагов, например, образование монокинов, таких как интерлейкин 1 (ИЛ-1) и фактор некроза опухоли (ФНО). Также наблюдаются неблагоприятные реакции, такие как лихорадка (Jap. J. Radiotherapy 48 (4), 514 (1988).

Таким образом, очевидно, что остается потребность в агенте, который способен стимулировать образование тромбоцитов и который, следовательно, может применяться для лечения тромбоцитопении, но который не вызывает разбалансировки внутреннего регуляторного механизма и не приводит к неприятным эффектам, подобным описанным выше.

Опубликованная заявка на Европейский пат. N 506 463 раскрывает некоторые новые производные пиранона, названные лейстродуксинами A, B и C, имеющие следующую формулу (X): где R представляет метилгексаноил, 6-метилоктаноил или 7-метилоксаноил соответственно.

Эти соединения, выделенные из штамма Streptomyces platensis, обладают активностью в отношении уменьшения неблагоприятных реакций на химиотерапию или радиотерапию рака, эащиты от инфекций, активации макрофагов, улучшения церебральной функции, а также противогрибковой активностью. Японская патентная заявка Hei 5-213 758, опубликованная 24 августа 1993 г. описывает применение лейстродуксинов A, B и C для воздействия на тромбоцитопоэз.

Европейская патентная публикация N 329 361 раскрывает некоторые новые производные 2-пиранона (Pyranone), которые напоминают соединения изобретения, за исключением того, что они замещены сходным образом с соединениями Европейской патентной публикации N 506 463, выше. Более того, эти соединения-прототипы заявлены в качестве сельскохозяйственных биоцидов, а в опубликованной литературе нет данных о том, что они обладают полезными терапевтическими и профилактическими свойствами, присущими соединению настоящего изобретения.

Некоторые другие соединения, очень схожие с описанными в Европейской патентной публикации N 329 361 и применяемые главным образом также описаны в японской патентной заявке Kokai Hei 2-186.

Journal of Antibiotics, 42 (1989) 1331-1343 раскрывает новое противоопухолевое соединение, которое авторы называют "фосфолином" (phospholine) и которое вырабатывается микроорганизмом рода Streptomyces. Это соединение, подобно соединению изобретения, имеет аминогруппу и остаток фосфорной кислоты, но его молекулярная формула другая. Это соединение, следовательно, совершенно очевидно отличается от такового изобретения.

Целью изобретения является создание нового лейстродуксина, обладающего полезной фармакологической активностью.

В частности, полагают, что соединение настоящего изобретения обладает огромным потенциалом в лечении тромбопении, особенно вызванной химиотерапией и радиотерапией рака и иммунными нарушениями.

Таким образом, изобретение обеспечивает соединение формулы (I): и его фармацевтически приемлемые соли. Это соединение мы назвали "лейстродуксин H".

Изобретение обеспечивает также способ получения лейстродуксина H, который будет описан более подробно ниже.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую лейстродуксин H или его фармацевтически приемлемую соль, в смеси с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Изобретение в дальнейшем обеспечивает также способ лечения или профилактики тромбопении, особенно вызванной лечением рака химиотерапией или радиотерапией, включающий введение эффективного количества лейстродуксина H или его фармацевтически эффективной соли млекопитающему, которое может быть также человеком, страдающему от тромбопении, или подверженному этому заболеванию.

Как видно из приведенной выше формулы, лейстродуксин настоящего изобретения содержит ряд асимметричных углеродных атомов и несколько двойных связей. Следовательно, он может образовать различные оптические и геометрические изомеры. Хотя все они представлены в настоящем документе одной молекулярной формулой, изобретение включает как отдельные изомеры, так и их смеси, включая рацематы. В случае применения методик стереоспецифичного синтеза или в случае использования в качестве исходных материалов оптически активных соединений отдельные изомеры могут быть приготовлены прямым путем; с другой стороны, если приготовлена смесь изомеров, индивидуальные изомеры можно получить с помощью стандартных методик разделения.

Лейстродуксин настоящего изобретения содержит как кислотную группу (остаток фосфорной кислоты), так и основную группу (аминогруппу) и может, следовательно, образовать соли. Не существует каких-либо особенных ограничений в том, что касается природы этих солей; если они предназначены для терапевтического применения, они должны быть фармацевтически приемлемыми. Когда они предназначены не для терапевтических целей, например, служат промежуточными веществами при приготовлении других, возможно, более активных, соединений, не применяют даже это ограничение. Соединения изобретения могут образовать соли с основаниями. Примеры таких солей включают: соли щелочных металлов, таких как натрий, калий или литий; соли щелочноземельных металлов, таких как кальций или барий; соли других металлов, таких как магний или алюминий; соли органических оснований, такие как соли дициклогексиламина; и соли основных аминокислот, таких как лизин или аргинин. Соединения изобретения могут также образовать соли с кислотами. Примеры таких солей включают: соли неорганических кислот, особенно галогеноводородных кислот (таких как бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота или хлористоводородная кислота), соли азотной кислоты, соли хлорной кислоты, соли угольной кислоты, соли серной кислоты или соли фосфорной кислоты; соли низших алкилсульфокислот, таких как метансульфокислота, трифторметансульфокислота или этансульфокислота; соли арилсульфокислот, таких как бензолсульфокислота или p-толуолсульфокислота; соли органических карбоновых кислот, таких как уксусная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота или лимонная кислота; и соли аминокислот, таких как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота.

Лейстродуксин изобретения можно получить путем гидролиза соединения формулы (II) или его соли где Z является ацильной группой с последующим (необязательным) образованием соли полученного соединения.

Реакция гидролиза может быть произведена с использованием гидролизущего агента, обычно используемого в реакциях такого типа, например, с гидролитическим ферментом или основанием.

В формуле (II), выше, Z является ацильной группой. Точная природа ацильной группы не существенна для изобретения, поскольку эту группу можно удалить путем гидролиза для получения соединения формулы (I). В целом мы обнаружили, что соединения, в которых Z является алифатической ацильной группой с прямой или разветвленной цепью или циклической алифатической группой, имеющей от 2 до 16 атомов углерода, являются подходящими исходными продуктами. Эта ацильная группа в таком случае может быть, например, одной из следующих групп: бутирил, изобутирил, изовалерил, 2-метилбутирил, 4-метилвалерил, циклогексан-карбонил, 4-метилгексаноил, 5-метилгексаноил, 6-метилгептаноил, циклогексилэтилкарбонил, октаноил, 6-метилоктаноил, или 7-метилоктаноил.

Соединения формулы (II) для использования в качестве исходных материалов в процессе изобретения, в которых Z представляет изобутирил, изовалерил, 4-метилвалерил, циклогексанкарбонил или 4-метилгексаноил, известны и описаны, например, в Journal of antibiotics 42, 1019-1036 (1989).

Соединения формулы (II) для использования в качестве исходных материалов в процессе изобретения, в которых Z представляет бутирил, изобутирил, изовалерил, 2-метилбутирил, циклогексанкарбонил, 4-метиленгексаноил, 6-метилгептаноил, циклогексилэтилкарбонил или октаноил, известны и раскрыты, например, в Европейской патентной публикации N 329 361. Исходные материалы, в которых Z является одной из этих групп, могут быть получены культивированием штамма микроорганизма Streptomyces platensis SAM 0654 и выделением желаемого соединения из культурной жидкости. Streptomyces platensis SAM 0654 хранится под номером FERM BP-1668 в связи с Европейской патентной публикацией N 329 361 в Fermentation Rearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology от 22 января 1988 г. Соответствующие методики культивирования этого микроорганизма и выделения желаемого соединения приводятся в Европейской патентной публикации N 329 361.

Соединения формулы (II), в которых Z представляет 5-метилгексаноил, 6-метилоктаноил или 7-метилоктаноил, также известны и описаны, например, в Европейской патентной публикации N 506 403.

Соединения формулы (II) для использования в качестве исходных материалов в процессе изобретения, в которых Z представляет 4-метилгексаноил, 5-метилгексаноил, 6-метилгептаноил, циклогексилэтилкарбонил, октаноил, 6-метилоктаноил или 7-метилоктаноил, известны и могут быть приготовлены, например, путем культивирования Streptomyces platensis SANK 60191 с последующим выделением из культуральной жидкости. Соответствующие условия для культивирования этого микроорганизма, приводятся, например, в Европейской патентной публикации N 506 463. Streptomyces platensis SANK 60191 хранится под номером FERM BP-3288 в Fermentation Rearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology, от 20 февраля 1991 г. в связи с Европейской патентной публикацией N 506 463.

Способ 1. Использование гидролитического фермента.

В этом способе соединение формулы (I) приготавливают путем реакции соединения формулы (II) с гидролитическим ферментом.

Точная природа этого фермента не является существенной для изобретения, и в равной степени можно использовать любой гидролитический фермент, который обычно применяют в реакциях подобного типа. В целом мы предпочитаем использовать такие ферменты, как эстераза свиной печени (ЭСП), липаза, ацетилэстераза, Takadiastase (отсутствует в Номенклатуре ферментов: Рекомендации Международного биохимического союза) или холестеролэстераза.

Эта реакция обычно и предпочтительно протекает в присутствии растворителя. Каких-либо особых ограничений в отношении природы применяемого растворителя не существует, достаточно, если он не будет оказывать неблагоприятного влияния на реакцию или на реагенты и будет способен растворять реагенты, по крайней мере, частично. Примеры подходящих растворителей включают: смесь спирта, такого как метанол, или этанол с буферным раствором, предпочтительно с фосфатным буфером, с pH приблизительно от 6 до 8, или смесь кетона, такого как ацетон или метилэтилкетон с буферным раствором, предпочтительно с фосфатным буфером с pH приблизительно от 6 до 8.

Мы, в частности, предпочитаем осуществлять эту реакцию с применением ЭСП или липазы в качестве гидролитического фермента, в растворителе, включающем смесь фосфатного буфера pH от 6 до 8 с ацетоном и метанолом.

Реакция может протекать в широком интервале температур, и точная температура реакции не существенна для изобретения, хотя предпочтительная температура может варьироватьcя в зависимости от природы исходного соединения и фермента, а также от природы растворителя. В целом мы находим удобным выполнять эту реакцию при температуре приблизительно от 10 до 40^oC, предпочтительно приблизительно от 20 до 40^oC.

Время, необходимое для реакции, также может широко варьировать в зависимости от множества факторов, особенно от температуры реакции и природы исходного соединения, фермента и растворителя. Однако обычно для реакции, протекающей при предпочтительных условиях, перечисленных выше, достаточно периода времени от 12 ч до 30 дней, предпочтительно от 3 до 15 дней.

По завершении реакции соединение формулы (I) может быть выделено из реакционной смеси и очищено стандартными способами. Один пример подходящей методики включает удаление смешивающегося с водой растворителя, такого как ацетон, дистилляцией в условиях пониженного давления, с последующей экстракцией полученного водного слоя с помощью органического растворителя, такого как этилацетат. Затем может последовать фракционирование и очистка водного слоя, например, с применением открытой колонки Cosmosil (зарегистрированная торговая марка).

Способ 2. Применение основания.

В этом способе соединение формулы (I) получают путем реакции соединения формулы (II) с основанием.

В том, что касается природы используемого основания, существенных ограничений не существует; можно использовать любое основание, которое обычно применяют в реакциях такого типа, при условии, что оно не оказывает неблагоприятного влияния на какую-либо часть молекулы или на реагенты. Примеры предпочтительных оснований включают: неорганическое основание, например, карбонат щелочного металла, такой как карбонат натрия, карбонат калия, карбонат церия или карбонат лития; гидрокарбонат щелочного металла, такой как гидрокарбонат натрия, гидрокарбонат калия или гидрокарбонат лития; гидроксид щелочного металла, такой как гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид лития; или гидроксид щелочноземельного металла, такой как гидроксид бария, гидроксид магния или гидроксид кальция. Среди этих реагентов мы предпочитаем использовать карбонат щелочного металла или гидрокарбонат щелочного металла, наиболее предпочтительно карбонат натрия, карбонат калия или гидрокарбонат натрия.

Эта реакция обычно и предпочтительно протекает в присутствии растворителя. Не существует особых ограничений в том, что касается природы этого растворителя, достаточно, если он не оказывает неблагоприятного влияния на реагенты и способен их растворять, по крайней мере, частично. Примеры подходящих растворителей включают: смесь спирта, такого как метанол или этанол, с водой; или смесь кетона, такого как ацетон или метилэтилкетон, с водой.

Реакция может протекать при широком диапазоне температур, и точная температура реакции не является существенной для изобретения, однако предпочтительная температура может варьироваться в зависимости от природы исходного соединения и основания, а также от природы растворителя. В целом мы находим адекватным протекание реакции при температуре приблизительно от 0 до 40^oC, предпочтительно приблизительно от 5 до 30^oC.

Время, необходимое для завершения реакции, также может широко варьировать в зависимости от множества факторов, а именно от температуры реакции и от природы исходного соединения, основания и растворителя. Однако в случае, если реакция протекает при оптимальных условиях, перечисленных выше, обычно достаточно периода времени приблизительно от 3 ч до 5 дней, предпочтительно от 3 ч до 2 дней.

По завершении реакции соединение формулы (I) может быть экстрагировано из реакционной смеси и очищено с помощью стандартных методик. Один из примеров подходящей методики включает удаление смешивающегося с водой растворителя, такого как ацетон, путем дистилляции в условиях пониженного давления, с последующей экстракцией полученного водного слоя с помощью органического растворителя, такого как этилацетат. Затем можно предпринять фракционирование и очистку водного слоя, например, используя открытую колонку Cosmosil (зарегистрированная торговая марка).

Биологическая активность.

Следующее исследование демонстрирует активность соединения изобретения как тромбопоэтического агента. Мы используем термин "тромбопоэтический агент" для обозначения агента, который, будучи введен в организм, индуцирует выработку тромбоцитов in vivo, а также агента, который может быть применен для лечения тромбоцитопении, вызванной различными причинами, такими как иммунные нарушения и неблагоприятные реакции на радиотерапию или химиотерапию рака.

Эксперимент 1.

Усиление тромбоцитопоэза у мышей после внутривенного введения лейстродуксина H.

Тромбопоэтическую активность соединения изобретения можно изучить, используя методику Ishibashi и др. описанную в Blood 74, 1241-1244 (1989).

Более подробно испытуемое соединение изобретения растворяли в физиологическом растворе, содержащем 1,25 об. водного этанола. Образец этой смеси внутривенно вводили 7-недельным самкам мышей линии C57BL с 24-часовым интервалом в течение 5 дней. Контрольные мыши получали только физиологический раствор, содержащий 1,25 об. водного этанола. Спустя 72 ч после последнего введения брали образцы крови из орбиты глаза подопытных животных и подсчитывали количество тромбоцитов. Исследование проводили методом электрического сопротивления с применением автоматического счетчика крови (K-1000, Toa-Iyo Denshi Co.) Результаты приведены в табл. 1.

Точные условия эксперимента, перечисленные выше, не являются существенными для определения количества тромбоцитов, и могут существовать варианты касательно животных для эксперимента, способа введения, общего времени эксперимента и интервалов времени между введениями препарата. Так, например, подопытными животными могут быть мыши, крысы, собаки или обезьяны, а испытуемое соединение можно вводить парентерально, интраперитонеально, внутримышечно или подкожно.

Эксперимент 4.

Изучение токсичности.

Мышам BALBIC внутривенно вводили 4 мг/кг лейстроцуксина H. Спустя 10 дней не было отмечено ни одного летального исхода.

Из приведенных выше данных очевидно, что лейстродуксин H изобретения демонстрирует отличную тромбопоэтическую активность in vivo и низкую токсичность и поэтому полезен в качестве терапевтического агента для лечения тромбоцитопении, вызванной различными причинами, в частности, иммунными нарушениями и неблагоприятными реакциями после химиотерапии или радиотерапии рака.

Для целей такого лечения соединения формулы (I) могут вводиться орально в форме таблеток, капсул, гранул, порошков или сиропов, или парентерально путем внутривенных, подкожных или внутримышечных инъекций, с помощью суппозиториев и т. п. Эти фармацевтические композиции можно приготавливать путем смешивания соединений изобретения с одним или более адъювантов, таких как наполнители (например, органические наполнители, такие как сахара, например, лактоза, сахароза, глюкоза, а также маннитол или сорбитол; производные крахмала, такие как крахмал зерновых культур, картофельное пюре, α -крахмал, декстрин или карбоксиметил-крахмал; производные целлюлозы, такие как кристаллическая целлюлоза, целлюлоза с гидроксипропильным заместителем, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, соединение карбоксиметилцеллюлозы с кальцием, соединение карбоксиметилцеллюлозы с натрием; аравийская камедь; декстран; Pullulan; неорганические наполнители, включая силикаты, такие как легкий ангидрид кремниевой кислоты, синтетический алюмосиликат или силикат магния/алюминат магния; фосфаты, такие как фосфат кальция; карбонаты, такие как карбонат кальция; сульфаты, такие как сульфат кальция); лубриканты (например, стеараты металлов, такие как стеарат кальция или стеарат магния; тальк; коллоидная двуокись кремния; воски, такие как пчелиный воск или спермацет; борная кислота; адипиновая кислота; сульфаты, такие как сульфат натрия; гликоль; фумаровая кислота; бензоат натрия; DL-лейцин; натриевые соли алифатических кислот; лаурилсульфаты, такие как лаурилсульфат натрия или лаурилсульфат магния; силикаты, такие как двуокись кремния или гидроксид кремния; и упомянутые выше производные крахмала); связующие вещества (например, поливинилпиридон, Macrodol, и вещества, подобные перечисленным выше наполнителям); дезинтегрирующие агенты (например, вещества, подобные описанным выше наполнителям и химически модифицированные крахмал-целлюлозы, такие как кросскармелоза-натрий, натрий-карбоксиметилкрахмал или поливинилпирролидон с мостиковой связью), стабилизаторы (например, p-гидроксибензоаты, такие как метилпарабен или пропилпарабен; спирты, такие как хлорбутанол, бензиловый спирт или фенилэтиловый спирт; хлорбензиловый спирт; фенолы, такие как фенол или крезол; дегидрацетовая кислота и сорбиновая кислота); кооригенты (например, подслащивающие вещества, уксус или отдушки, которые обычно применяют для подобных целей); растворители и т.п.

Дозы варьируют в зависимости от состояния и возраста пациента, а также от способа и типа введения препарата, однако, например, соединения изобретения могут вводиться в суточной дозе от 0,01 до 10 мг/кг (предпочтительно от 0,01 до 1 мг/кг) как в виде разовой дозы, так и в виде разделенной дозы.

Получение некоторых соединений изобретения далее иллюстрируется примерами. В разделе "Приготовление" описывается получение некоторых исходных материалов, применяемых далее в примерах.

Пример 1. 5,61 г сырого маслянистого вещества, полученного на стадии B приготовления 1 (см. ниже), растворяли в 130 мл ацетона. Затем добавляли 1400 мл 0,05 М раствора фосфатного буфера (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 6,7) и полученную смесь перемешивали. Затем добавляли 807 мг эстеразы свиной печени (ЭСП, продукт компании Amano Pharm. Co. Ltd.) и смесь перемешивали при температуре 35^oC. Исходный материал имел время удерживания 8,8 мин при жидкостной хроматографии высокого разрешения, и протекание реакции, таким образом, контролировалось с помощью этой методики. ЭСП добавляли в количестве 0,82 г, 1,52 г, 1,02 г и 0,9 г смеси в течение периода времени в две недели при 35^oC и полученную смесь перемешивали в течение двух недель. По окончании этого времени реакционный раствор фильтровали с помощью фильтрующей системы Celite (зарегистрированная торговая марка) для удаления ЭСП. Фильтрат затем экстрагировали этилацетатом, а водный слой фракционировали и очищали колоночной хроматографией посредством 400 г Cosmosil 75C18-OPN (зарегистрированная торговая марка для продукта компании Nakaraitesque, Inc. ), используя водный метанол в качестве элюента, для получения 1,73 г лейстродуксина H.

Жидкостную хроматографию высокого разрешения выполняли при следующих условиях.

Колонка: Cosmosil 5C18-AR^IM 4.6·250 мм (продукт компании Nakaraitesque, Inc.); элюент: 20% (об.) ацетонитрил: 0,5 об. триэтиламин; 79,5 об. фосфатный буфер (pH 3.0);
скорость потока: 1,0 мл/мин;
длина волны: 230 нм.

Масс-спектроскопия при бомбардировке быстрыми атомами:
m/z 530 (м + 1), 528 (м 1).

ЯМР: (270 МГц, D₂O) d частей на миллион (ppm): 7,02 (1H, дублет дублетов, J 5,4 и 9,6 Гц); 6,21 (1H, дублет дублетов, J 11,7 и 20,5 Гц); 6,12 (1H, дублет дублетов, J 12,2 и 20,5 Гц); 5,93-5,84 (2H, мультиплет); 5,71 (1H, дублет, J 16,6 Гц); 5,32-5,25 (2H, мультиплет); 3,94 (1H, дублет триплетов, J 3,4 и 10,3 Гц); 3,48 (1H, мультиплет); 2,93 (2H, триплет, J 7,8 Гц); 2,53-2,40 (2H, мультиплет); 2,03 (1H, мультиплет); 1,80-0,73 (13H, мультиплет); 0,73 (3H, триплет, J 7,8 Гц).

Пример 2. 20 мг соединения формулы (II) (см. выше), в котором представляет 4-метилгексаноил (приготовленного, как описано на стадии B приготовления 1, см. ниже) растворяли в небольшом количестве метанола. Полученный раствор разводили фосфатным буфером (pH 6,7), после чего добавляли 10 мг ЭСП (продукт компании Amano Pharm. Co. Ltd.) и смесь перемешивали в течение 6 дней при 30^oC. По истечении этого времени реакционный раствор фильтровали. Оставшийся метанол удаляли из фильтрата путем дистилляции в условиях пониженного давления, а полученный водный раствор фракционировали и очищали на колонке C18-Cosmosil, используя водный метанол в качестве элюента. Фракцию элюировали 20 об. водного метанола и получили 13 мг соединения с теми же физическими свойствами, что и у соединения, полученного в примере 1, см. выше.

Пример 3. Была выполнена та же процедура, что описана в вышеприведенном примере 2, но с использованием 50 мг соединения формулы (II), см. выше, где Z представляет 5-метилгексаноил (полученный, как описано на стадии 3 приготовления 1, см. ниже), и было получено 30 мг лейстродуксина H. Следуя процедуре, подобной той, что описана в примере 2, см. выше, лейстродуксин H с теми же свойствами, что приведены в примере 1, см. выше, также приготавливали из соединения формулы (II), в котором Z представляло следующие группы. Количества исходного материала и полученного соединения изобретения приведены ниже.

Пример 8. 20 мг соединения формулы (II), в котором Z представляет 6-метилгептаноил (полученный, как описано на стадии B приготовления 1, см. ниже) растворяли в небольшом количестве водного метанола. Затем к смеси добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученный раствор перемешивали в течение одного дня. По истечении этого времени pH реакционного раствора доводили до 2 добавлением соответствующего количества водной хлористоводородной кислоты, а полученную смесь фракционировали и очищали на колонке Cosmosil C18, в результате чего получали 3 мг лейстродуксина H.

Приготовление 1. Культура и выделение исходных соединений.

1 (A) Культура. Одну платиновую петлю спор Streptomyces platensis SANK 60191 инокулировали в 500 мл флакон Эрленмейера, снабженный разделительной перегородкой и содержащий 100 мл предварительно простерилизованной культуральной среды (состав описан ниже), и микроорганизм культивировали в течение 3 дней при 28^oC и вращении 200 об/мин (радиус вращения 7 см), при использовании ротационного шейкера.

Культуральная среда
Растворимый крахмал 30 г
Сырые дрожжи 10 г
Порошок соевых бобов 7 г
Рыбная мука 5 г
Настойка кукурузы 2 г
Мясной экстракт 1 г
Карбонат кальция 1 г
Вода До 1000 мл
pH 7 (перед стерилизацией)
По 15 л той же среды, которая использовалась для культивирования, загружалось в четыре 30-литровых ферментера из нержавеющей стали и стерилизовались нагреванием до 120^oC в течение 30 мин. Затем добавляли по 150 мл культуральной среды, приготовленной, как описано выше. Смесь культивировали 3 дня при 28^oC с аэрацией при скорости воздушного потока 15 л/мин при постоянном перемешивании. Чтобы поддерживать концентрацию кислорода в жидкости, равную 5 частям на миллион (ppm), скорость перемешивания автоматически контролировалась и оставалась в пределах от 100 до 300 об/мин.

1 (B) Выделение. К 60 л культуральной жидкости, полученной, как описано выше в пункте 1 (A), добавляли в качестве фильтрующей системы 2,4 кг Celite 545 (торговое наименование продукта компании Johns and Manville Project Corporation USA) и смесь фильтровали. После фильтрации культуральной жидкости получили 7,2 кг бактериальных клеток. Клетки однократно экстрагировали 30 л 50 об. водного ацетона, и дважды 20 л 80 об. водного ацетона. Эти экстракты объединяли, а органический растворитель выпаривали с помощью вращающегося выпарного аппарата. К остатку добавляли водный раствор хлористоводородной кислоты в количестве, достаточном для получения pH 2,0, а затем смесь дважды экстрагировали, каждый раз 10 л этилацетата. Экстракты объединяли и добавляли 10 л 1% (вес/объем) водного раствора гидрокарбоната натрия. Активные фракции переходили в водный слой, а слой этилацетата удаляли. Этот слой этилацетата еще раз экстрагировали 5 л 1% (вес/объем) водного раствора гидрокарбоната натрия. Растворы гидрокарбоната натрия объединяли и pH объединенного раствора доводили до 2 добавлением водного раствора хлористоводородной кислоты. Этот раствор дважды экстрагировали, каждый раз 10 л этилацетата. Органические экстракты объединяли, отмывали водой, а затем насыщенным водным раствором хлорида натрия; затем высушивали над безводным сульфатом натрия. После постепенного добавления метанола полученный раствор конденсировали выпариванием в условиях пониженного давления с использованием вращающегося выпарного аппарата, в результате чего получали 10 мл маслянистого вещества. Это маслянистое вещество растворяли в 100 мл 60 об. водного метанола и полученный раствор адсорбировали на Sep-Pack Vac 20 cc C₁₈) (торговое наименование продукта компании Water Co. USA). Загрязнения элюировали 30 мл 60 об. водного метанола. Затем элюировали лейстродуксины 15 мл 100% метанола, а элюат конденсировали, в результате чего получали 600 мг маслянистого вещества. Это маслянистое вещество непосредственно, без дальнейшей очистки использовали в примере 1 (см. выше). С тем чтобы очистить этот материал, его растворяли в 10 мл метанола и подвергали жидкостной хроматографии высокого разрешения. Фракции с пиками около 13 мин, 19 мин и 24 мин собирали и обозначали как "сырая фракция A", "сырая фракция B" и "сырая фракция C" соответственно. Условия хроматографии приведены ниже.

Препаративная жидкостная хроматография.

Колонка: Radial-Pak 25·10 (Waters, USA);
элюирующий раствор: 50% по объему водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатного буфера, pH 3,0;
скорость потока: 9 мл/мин;
длина волны: 230 нм.

После конденсации всех этих пиков полученные фракции подвергали препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешения. Сырая фракция A подвергалась препаративной хроматографии для сбора пиков около 53 и 56 мин при нижеприведенных условиях; затем она была обессолена и сконденсирована с помощью Sep-Pak, в результате чего получили 22,03 мг соединения формулы (II), в котором Z представляет 4-метилгексаноил, и 11,66 мг лейстродуксина A.

Препаративные условия для сырой фракции A.

Колонка: Cosmosil 5C 18-AR 20·250 мм (Nakaraitesque, Inc.);
элюирующий раствор: 42 об. водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатного буфера, pH 3,0;
cкорость потока: 9 мл/мин;
длина волны: 230 нм.

Сырая фракция B подвергалась препаративной хроматографии для сбора пиков около 74 мин, 79 мин и 82 мин при нижеприведенных условиях, затем ее обессоливали и конденсировали с помощью Sep-Pak, в результате чего получили 26,16 мг соединения формулы (II), в котором Z представляет циклогексилэтилкарбонил, и 3,24 мг соединения формулы (II), в котором представляет октаноил.

Препаративные условия для сырой фракции B.

Колонка: Cosmosil 5C 18-AR 20·250 мм (Nakaraitesque, Inc.);
элюирующий раствор: 47 об. водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатный буфер, pH 3,0;
скорость потока: 9 мл/мин;
длина волны: 230 нм.

Сырая фракция C подвергалась препаративной хроматографии для сбора пиков около 47 мин и 51 мин при нижеперечисленных условиях; затем ее обессоливали и конденсировали с помощью Sep-Pak, в результате чего получали 9,83 мг лейстродуксина B и 5,22 мг лейстродуксина C.

Препаративные условия для сырой фракции C.

Колонка: Cosmosil 5C 18-AR 20·250 мм (Nakaraitesque, Inc.);
элюирующий раствор: 47 об. водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатный буфер, pH 3,0;
cкорость потока: 9 мл/мин;
длина волны: 230 нм.

Приготовление 2. Культура и выделение исходных соединений. Streptomyces platensis SAN-0654 (FERM BP-1668) культивировали и соединения формулы (II), в которых Z представляет бутирил, изобутирил, изовалерил, 2-метилбутирил, циклогексанкарбонил, 4-метилгексаноил, 6-метилгептаноил, циклогексилэтилкарбонил и октаноил, выделяли из культуральной жидкости в соответствии со способами, описанными в Европейской патентной публикации N 329 361.

Рецептура 1.

Приготовление капсул
Лейстродуксин H 100 мг
Лактоза 100 мг
Кукурузный крахмал 148,8 мг
Стеарат магния 1,2 мг
Общее количество 350 мг
Вышеперечисленные ингредиенты смешивали, полученный порошок пропустили через просеивающую машину меш 20 (Tyles standard) и затем наполняли им капсулы.

Формула изобретения

1. Производное пиранона общей формулы I

или его фармацевтически приемлемые соли.

2. Фармацевтическая композиция, проявляющая тромбопоэтическую активность, содержащая активный компонент и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента используют соединение формулы I по п.1, в эффективном количестве.

3. Соединение формулы I по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, проявляющее тромбопоэтическую активность.

4. Способ получения соединения формулы I, отличающийся тем, что осуществляют гидролиз соединения формулы II

где Z ацильная группа,
или его соли с последующим необязательным образованием соли полученного соединения.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролиз проводят с использованием основания или гидролитического фермента.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что Z алифатическая ацильная группа с прямой или разветвленной цепью или циклическая алифатическая ацильная группа с 2 16 атомами углерода.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что Z бутирил, изобутирил, изовалерил, 2-метилбутирил, 4-метилвалерил, циклогексанкарбонил, 4-метилгексаноил, 5-метилгексаноил, 6-метилгептаноил, циклогексилэтилкарбонил, октаноил, 6-метилоктаноил или 7-метилоктаноил.

РИСУНКИ

Рисунок 1