Способ направленного биосинтеза лимонной кислоты

 

Использование: биотехнология, биосинтез лимонной кислоты. Сущность изобретения: способ заключается в выращивании на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в условиях аэрации и перемешивания консорциума штаммов грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем дрожжи засевают по достижении концентрации грибов 5-10 г/л, остаточного сахара 10-40% от исходного неинвертированного сахара, вносят биокатализатор N-трис-/гидроксиэтил/ аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5-10^-7 г/л, при этом засевная концентрация дрожжей составляет 10-80% от текущей концентрации грибов. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения лимонной кислоты.

Лимонная кислота используется в фармацевтической, пищевой и кондитерской промышленностях, ее потребность возрастает.

Лимонную кислоту синтезируют микроорганизмы различных родов и видов, в основном, в промышленности культивируют грибы Aspergillus niger, потребляющие углеводсодержащие субстраты (Biotechnol. Lett, 1985, 7, N11) и дрожжи Candida lipolytica (заявка ФРГ 2002028, заявка Японии 55-1039), утилизирующие непищевые источники углерода, такие как углеводороды, спирты.

При этом основным недостатком способов выращивания грибов Aspergillus niger является то, что процесс синтеза лимонной кислоты длителен 5-7 суток. Использование же дрожжевых культур p. Candida ограничено сырьевой базой, так большинство штаммов дрожжей p. Candida не способны инвертировать сахар, потреблять пивную дробину, необработанное зерно и др. к тому же при потреблении углеводородов и этилового спирта дрожжи синтезируют смесь лимонной и изолимонных кислот, что вызывает дополнительные сложности при выделении лимонной кислоты, в связи с чем повышается ее себестоимость.

Наиболее близким является способ получения лимонной кислоты при глубинном выращивании грибов Aspergillus niger на сахаре (Смирнов В.А. Пищевые кислоты. М. Лесная и пищевая промышленность, 1983 г. стр.94-97( грибы Aspergillus niger предлагается выращивать на питательной среде, содержащей источники Fe, Mg, Mn, Zn, Cu, K, в лимите по азоту, фосфору при избытке углеродсодержащего субстрата, при перемешивании, аэрации. Выращивание проводили в течение 7-9 суток, при этом выход лимонной кислоты от поданного субстрата составлял 100% Недостатком выше описанного способа является то, что процесс длительный, себестоимость продукции высокая из-за больших энергозатрат на стадии выращивания.

Предлагаемое изобретение решает следующую научно-техническую задачу: снизить себестоимость лимонной кислоты.

Технический результат предлагаемого способа заключается в сокращении времени биосинтеза.

Данный технический результат достигается тем, что биосинтез лимонной кислоты осуществляется на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в условиях аэрации и перемешивания, в качестве продуцентов используют консорциум штаммов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем дрожжи засевают по достижении концентрации грибов 5-10 г/л, остаточного неинвертированного сахара 10-40% от исходного содержания сахара, вносят биокатализатор N-трис-(гидроксиэтил)аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5-10^-7г/л, при этом засевная концентрация дрожжей составляет 10-80% от текущей концентрации грибов.

Перечисленные признаки в совокупности обеспечивают более полное потребление субстратов, уменьшение сроков выращивания до 4-х суток за счет более высокой скорости синтеза лимонной кислоты консорциумом микроорганизмов при внесении биокатализатора.

Сущность способа направленного биосинтеза лимонной кислоты заключается в том, что на питательную среду, содержащую хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый цинк, водный 0,02 г/л, сахар 5% засевали консорциум грибов Aspergillus niger выращивали при перемешивании и аэрации в аппарате V 3 л до концентрации сухих грибных клеток 5-10 г/л, остаточного неинвертированного сахара 10-40% от исходного сахара в среде при Т-32С, pH 5,5, pH поддерживали внесением 10-ного NaOH, далее вносили биокатализатор N-трис-гидроксиэтил-аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5-10^-7 г/л, засевали культуру дрожжей Candida lipolytica в количестве 10-80% от текущей концентрации грибов и вели выращивание до окончания процесса синтеза лимонной кислоты. В культуральной жидкости определяли в процессе выращивания содержание лимонной кислоты спектрофотометрическим методом, концентрацию биомассы - весовым методом.

Выбранный диапазон концентраций биокатализатора определялся тем, что при концентрации меньше 10 г/л активация дыхания в клетках не происходила, а внесение более высоких концентраций более 10 г/л оказывало воздействие значительно, но при этом резко повышалась себестоимость процесса.

Использование консорциума штаммов обусловлено комменсализмом грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica: дрожжи Candida lipolytica не способны синтезировать ферменты, инвертирующие сахар, гидролизующие зерно, муку, также штаммы дрожжей p.Candida являются биотин и тиаминзависимыми, в то время как штаммы Aspergillus niger способны синтезировать перечисленные выше ферменты и обладают способностью синтезировать тиамин. При этом дрожжи Candida lipolytica, так и грибы Aspergillus niger способны синтезировать лимонную кислоту, а скорость синтеза лимонной кислоты у дрожжей Candida lipolytica выше, чем у грибов и это присуще всем штаммам грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica.

Нами была проведено исследование возможности совместного существования исследуемых культур. Для чего была оценена протеолитическая активность грибов Aspergillus niger. Были рассмотрены шесть пар гриб. Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica. Выращивали грибы и дрожжи совместно в колбах на качалке при оптимальных температурах, pH, составе питательной среды, источнике углерода. Биомассу отделяли от культуральной жидкости и определяли содержание протеолитических ферментов в культуральной жидкости. Для этого в две пробирки с буфером и мертиолатом добавляли по 1 мл суспензии дрожжей Candida lipolytica, затем в одну из пробирок (контроль) вносили 1 мл воды, а в другую (опыт) 1 мл культуральной жидкости. Измеряли исходную оптическую плотность суспензий в обеих пробирках, затем помещали их на водяную баню при 40^oC на 1 ч, после чего опять измеряли оптическую плотность. В случае уменьшения оптической плотности считали, что протеолитическая активность проявляется. Во всех исследуемых вариантах сочетания грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica отсутствовал лизис как грибных, так и дрожжевых культур.

Таким образом использование консорциума позволяет ускорить процесс синтеза лимонной кислоты на таких субстратах как сахар, зерно, мука.

В табл. 1 приведена зависимость выхода лимонной кислоты от величины засевной биомассы дрожжей Candida lipolytica ВКПМ Y-2206 при концентрации грибов Aspergillus niger ВКПМF-710 в момент засева 7 г/л.

При засеве дрожжей в количестве меньшем, чем 10% от концентрации грибов, через 4-ро суток выход был на уровне контрольного варианта культивирование одной грибной культуры. При увеличении величины засевного материала дрожжей от 10 до 80% культивирование консорциума обеспечивает активный синтез лимонной кислоты: выход 98-102% в прототипе выход 100% через 168 ч ферментации. Увеличение засевной биомассы дрожжей до 90% от концентрации грибов приводит к некоторому снижению выхода лимонной кислоты, что связано с увеличением концентрации изолимонной кислоты. Штамм Candida lipolytica /опыт 7/ не способен синтезировать лимонную кислоту на сахаре выход 10% В табл. 2 показано, как влияет концентрация грибной культуры в аппарате в момент засева дрожжевой культуры на выход лимонной кислоты. Концентрация засевной биомассы дрожжей составляла во всех случаях 60% от концентрации грибов.

При концентрации грибов меньше 5 г/л, выход через 4-ро суток составил 75% что связано с низкой концентрацией инвертированного сахара в момент засева дрожжей, при увеличении концентрации грибов в момент засева дрожжей до 12 г/л снижается выход вследствие увеличения вязкости суспензии, ухудшения массообмена в аппарате.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Выращивали грибы Aspergillus niger ВКПМ F-710 в ферментере V 3 л, Т выращивания 32^oC на питательной среде при перемешивании n 350 об/мин, аэрации. В исходную питательную смесь вносили 5% сахара, хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый цинк, водный 0,05 г/л. В процессе выращивания измеряли АСВ 8г/л при значении АСВ= 5 г/л, остаточном содержании неинвертированного сахара 30% в среду выращивания добавляли N-трис-/гидроксиэтил/аммониевую соль метилфенилсульфонил-уксусной кислоты в количестве 10 г/л, засевали дрожжи Candida lipolytica ВКПМ Y-2206 в количестве 80% от текущей концентрации грибов. Через 4 суток после начала выращивания выход лимонной кислоты от поданных субстратов составил 100% Пример 2. Выращивание проводили также, как в примере 1, но в качестве грибов использовали штамм Aspergillus niger ВКМF-228, дрожжей Candida lipolytica ВКПМ Y-2206, вносили в количестве 60% от текущей концентрации грибов, при концентрации грибов 10 г/л и содержании неинвертированного сахара 10% Выход лимонной кислоты от поданных субстратов составил 102% через 4 суток после начала выращивания.

Пример 3. Выращивание вели также как в примере 1, но в качестве продуцентов использовали штамм Aspergillus niger ВКПМF-710 и штамм Candida lipolytica ВКМ Y-912. Выход лимонной кислоты на 4-е сутки составил 105% Пример 4 /по прототипу/. Выращивали грибы Aspergillus niger F-710 также, как в примере 1, но без добавления дрожжевой культуры и биокатализатора. Выход лимонной кислоты от поданного сахара составил 90% через дней до начала выращивания.

Пример 5. Выращивание проводили так же, как в примере 1, но качестве грибов использовали штамм Aspergillus niger ВКПМ F-722, дрожжи Candida lipolytica ВКПМ Y-2206 вносили в количестве 60% от текущей концентрации грибов, при концентрации грибов 10 г/л и содержании неинвертированного сахара 10% Выход составил 108% через 4 суток после начала выращивания.

Таким образом, реализация процесса по предлагаемому способу позволяет сократить время выращивания с 7 до 4-х суток, что значительно снижает энергозатраты на стадии выращивания, тем самым снижает себестоимость лимонной кислоты.

Формула изобретения

Способ направленного биосинтеза лимонной кислоты путем культивирования микроорганизмов на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в условиях перемешивания и при аэрации, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют консорциум культур гриба Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем сначала в питательную среду вносят культуру гриба, а дрожжи засевают по достижении концентрации гриба 5 10 г/л и достижении концентрации остаточного инвертированного сахара 10 40% от исходного при засевной дозе дрожжей 10 80% от текущей концентрации гриба и на стадии засева дрожжей вносят биокатализатор -N-трис(гидроксиэтил)аммониевую соль метилфенилсульфонилуксусной кислоты в количестве 10^-5 - 10^-7 г/л.

РИСУНКИ

Рисунок 1