Способ получения препарата вакцинного штамма вируса

 

Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой способ получения препарата вакцинного штамма вируса зеленой крапчатой мозаики огурца, который может быть использован для защиты растений от вирусных эпифитотий этого вируса. Вакцину получают, заражая растущие сеянцы огурца в стадии 1-3 настоящих листьев разбавленной суспензией вируса с концентрацией 10^-3-10^-4 мкг/мл, после чего растения выращивают, осуществляют отбор зараженных бессимптомных растений с помощью серологических тестов, получают из них сок, из которого после прогревания при 60^oC для коагуляции растительных белков выделяют препарат осаждением сернокислым аммонием, нанесением осадка на бумажный фильтр и вымыванием вируса.

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способам получения препаратов вакцинных штаммов вирусов, предназначенных для защиты растений от патогенных штаммов.

Проблема защиты растений от вирусных эпифитотий стоит особенно остро, т. к. химические способы защиты растений отсутствуют. Существуют селекционные методы, но они неприменимы для всех растений, в частности у огурца не обнаружены гены устойчивости к вирусу зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО).

Поэтому вакцинация растений слабопатогенными штаммами соответствующего вируса остается одним из действенных способов защиты от вирусных эпифитотий.

Известные способы получения препаратов вакцинных штаммов предусматривают стадии накопления вируса на растениях, его выделение и очистку.

В качестве прототипа можно рассматривать способ получения вакцинного штамма вируса табачной мозаики, который предусматривает последовательное заражение растений табака и томата однонекрозными изолятами слабопатогенного штамма вируса табачной мозаики, выращивание их, отбор зараженных бессимптомных растений, получение из них сока, выделение препарата путем осаждения вируса сернокислым аммонием с последующим нанесением осадка на бумажный фильтр и вымыванием вируса водой.

Известный способ неприменим для получения вакцины ВЗКМО, т.к. неизвестны растения, образующие некрозы на этот вирус. Поэтому задачей данного изобретения является создание способа получения вакцинного штамма ВЗКМО.

Сущность способа заключается в том, что заражение осуществляется суспензией ВЗКМО растущих сеянцев огурца в стадии 1-3 настоящих листьев, при этом используют очень разведенную суспензию, а именно 10^-3-10^-4 мкг/мл. Другой существенной особенностью способа является то, что отбор зараженных бессимптомных растений осуществляют с помощью серологических тестов со специфической антивирусной сывороткой. Выделение вируса проводят так же, как в известном способе: осаждением сульфатом аммония и фильтрованием через бумажный фильтр.

Пример. Растения огурца (Cucumis sativus), восприимчивого к ВЗКМО сорта или гибрида (Стелла), выращивают из здоровых семян в горшочках с питательной смесью на стеллажах в специальном инфекционном отсеке теплицы до 1-3 настоящих листьев. При достижении этой стадии производят инокуляцию растений вручную, с карборундом, исходным препаратом вакцины ВЗКМО, разбавленной (0,06 М фосфатным буфером pH 7,6) до концентрации 0,001 мкг/мл. Заражают как семядольные, так и настоящие листья.

Через неделю растения из горшочков пересаживают в грунт инфекционной теплицы по общепринятой системе выращивания, где выращивают в течение 6 нед. В растениях происходит размножение и накопление вируса.

Через две недели после пересадки в грунт растения просматривают, бракуя те, которые показывают симптомы излишне суровой мозаики. Одновременно растения пронумеровывают и с каждого берут срединную пробу листьев по ярусам (по части верхнего, среднего и нижнего ярусов). Затем каждую пробу анализируют серологическим методом (двойной диффузии в геле).

Еще через две недели все операции проводят повторно. Обычно на сотню растений не более 1-2 проявляют симптомы суровой мозаики. Большее количество растений имеет деформации на листовых пластинках. Для выделения препарата вакцины берут растения, которые накапливают вирус и при этом практически не проявляют симптомов в течение всего срока наблюдений.

С выбранных растений собирают листья и замораживают в бытовом холодильнике. Для гомогенизации используют бытовую мясорубку, которую затем стерилизуют кипячением. Гомогенат отжимают через марлю и отфильтровывают. Полученный сок прогревают в течение 10 мин пари 60^oC, затем добавляют сернокислый аммоний до концентрации 20% и оставляют на ночь. Надосадочную жидкость сливают, а осадок переносят на складчатый бумажный фильтр и промывают 17% -ным раствором сернокислого аммония. Промывку продолжают до получения слабожелтого фильтрата. Для извлечения вируса воронку с фильтром переносят в чистый цилиндр и промывают осадок 0,06 М фосфатным буфером pH 7,6. Вирус на фильтре растворяется и переходит в фильтрат в цилиндре. Для лучшего извлечения вируса промывку следует производить дважды.

В фильтрат добавляют 170 г/л сернокислого аммония и оставляют для отстаивания в цилиндре на ночь. После этого надосадочную жидкость сливают. Выход препарата 200-400 мкг/кг сухой листовой массы. Для проверки качества вакцины сеянцы огурца на стадии 2-3 настоящих листьев заражают полученным вирусным препаратом в концентрации 10 мкг/мл. Количество патогенных ревертантов является показателем чистоты конечного продукта и составляет 1,5% от общего количества заразившихся растений. Осадок с некоторым количеством надосадочной жидкости фасуют в ампулы по 1 мл и хранят в холодильнике.

При транспортировке допускаются колебания температуры от -3^oC до 35^oC.

Формула изобретения

Способ получения препарата вакцинного штамма вируса, предусматривающий заражение растений соответствующим слабопатогенным вирусом, отбор зараженных бессимптомных растений, получение из них сока, выделение препарата путем осаждения вируса сернокислым аммонием с последующим нанесением осадка на бумажный фильтр и вымыванием вируса, отличающийся тем, что в качестве растений используют растущие сеянцы огурца в стадии 1 3 настоящих листьев, заражение осуществляют суспензией бессимптомного вируса зеленой крапчатой мозаики огурца в концентрации 10^-3 10^-4 мкг/мл, а отбор зараженных бессимптомных патогенных растений проводят с помощью серологических тестов со специфической антивирусной сывороткой, полученный из этих растений сок прогревают при 60^oС для коагуляции растительных белков.