Способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербицидам двудольных растений

 

Использование: изобретение относится к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующих гербицид - устойчивую форму фермента ацетолактатсинтазы. Сущность: предварительно конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий устойчивую к гербициду ацетолактатсинтазу, нуклеотидная последовательность которого содержит по крайней мере одну из консервативных субпоследовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности A, B, C, D, E, F и G, с помощью тригибридного скрещивания переносят плазмидную ДНК в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens, трансформируют протопласты растений агробактериями и отбирают трансформанты. Аминокислотная последовательность A представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности пролин-глицин-глицин (E2)-аланин (E1). Аминокислотная последовательность B представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности глицин-глутамин-валин-пролин (1). Аминокислотная последовательность C представляет собой последовательность из 8 аминокислот, гомологичных последовательности изолейцин-глицин-треонин-аспарагиновая кислота-аланин (2)-фенилаланино-глутамин-глутаминовая кислота. Аминокислотная последовательность D представляет собой последовательность из 3 аминокислот, гомологичных последовательности-пролин-лизин (1)-аспарагиновая кислота. Аминокислотная последовательность E представляет собой последовательность из 5 аминокислот, гомологичных последовательности - аргинин-фенилаланин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота (1)-аргинин. Аминокислотная последовательность F представляет собой последовательность из 10 аминокислот, гомологичных последовательности - глицин-метионин-валин (8)- валин-глутамин-триптофан (3)-глутаминовая кислота - аспарагиновая кислота-аргинин-фенилаланин (7), а последовательность G представляет собой последовательность Из 6 аминокислот, гомологичных последовательности - метионин-лейцин-глицин-метионин (1)-гистидин-глицин. 10 ил., 29 табл.

Настоящее изобретение относится к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующим гербицидустойчивую форму фермента ацетолактатсинтазы (АЛС).

Сульфонилмочевинные гербициды ингибируют рост некоторых бактерий, дрожжей и высших растений путем блокирования ацетолактатсинтазы (АЛС, ЭС 4.1.3.18), первого общего фермента в биосинтезе аминокислот с разветвленной цепью валина, лейцина и изолейцина. Биосинтез аминокислот с разветвленной цепью и, следовательно, токсичность сульфонилмочевинных гербицидов ограничиваются растениями и микробами. АЛС также ингибируется структурно неродственным классом гербицидов, а именно имидазолинонами.

Три основных изофермента АЛС, обозначенные I, II и III, идентифицированы в кишечных бактериях. Изоферменты I и III, но не II, являются чувствительными к конечному продукту ингибирования валином. Каждый из трех бактериальных изоферментов содержит большую и малую субъединицу белка. Ферменты АЛС из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и из некоторых высших растений частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибирования конечного продукта. Неизвестно, состоят ли ферменты АЛС дрожжей и растений из одного или более различных полипептидов. Данные дают основание предполагать, что клеточные местоположения ферментов АЛС дрожжей и растений находятся в митохондриях и хлоропластах соответственно.

Гены, кодирующие ферменты АЛС, выделены из кишечных бактерий Salmonella typhimurium и Escherichia coli, а также дрожжей S. cerevisiae. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих две субъединицы изоферментов I, II и III АЛС E. coli показывают, что они организованы, как опероны ilvBN, ilvGM и ilvIH соответственно. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей больших субъединиц изоферментов АЛС E. coli показывает три области, содержащие приблизительно 50% консервативных аминокислот (приблизительно 2/3 части белков), разделенных областями с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокислотные последовательности, хотя и в меньшем количестве, присутствуют среди малых субъединиц бактериальных изоферментов. В дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован единственный ген ILV2, существенный для активности АЛС. Анализ нуклеотидной последовательности гена ILV2 выявил, что полипептид, кодируемый им, гомологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Выведенная аминокислотная последовательность АЛС дрожжей показывает такую же ступень структурной организации и такую же степень гомологии, какая наблюдается между большими субъединицами бактериальных изоферментов, за исключением того, что около 90 аминокислот в амино-конце дрожжевого белка, как полагают, вовлечены в транслокацию белка в митохондрию. До описываемого здесь изобретения не было никакой информации относительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последовательности ферментов АЛС растений.

Изофермент I кишечных бактерий представляет собой единственную АЛС в природе, который является нечувствительным к ингибированию сульфометуронметилом и хлорсульфуроном. Поэтому кишечные бактерии чувствительны к этим гербицидам только в присутствии валина, который ингибирует изофермент I. Идентифицированы сульфонилмочевинные гербицидустойчивые мутантные формы кишечных бактерий Salmonella typhimurium и E. coli (отобранные в присутствии валина), дрожжей S. cerevisiae и высших растений Nicotaiana tabacum (табак), Arabidopsis thaliana и Zea mays (маис). Эти мутантные фенотипы расщепляются совместно с гербицид-устойчивыми формами АЛС посредством генетических кроссов. В S. typhimurium гербицидустойчивые мутации генетически связаны с геном, кодирующим АЛС, а в E. coli и S. cerevisiae эти мутации заключены в структурных генах для АЛС. В высших растениях мутации, ответственные за устойчивость, наследуются как единственные, доминантные или полудоминантные ядерные признаки. В табаке эти мутации картируются к одному из двух несцепленных генетических локусов.

Химическая борьба с нежелательными сорняками, ассоциируемыми с сельскохозяйственно полезными культурами, требует использования чрезвычайно селективных химических гербицидов. В некоторых случаях очень трудно идентифицировать какое-нибудь химическое вещество, которое убивает сорняки, не повреждая при этом сельскохозяйственную культуру. Интродукция устойчивости к гербицидам в качестве биологического признака могла бы преодолеть эту трудность.

Многие гены, вовлеченные в структуру и функцию дифференцированных растительных тканей и органов, не экспрессируются в недифференцированных тканях; те же, которые участвуют в основных клеточных функциях, экспрессируются и могут быть отобраны в дезорганизованном каллюсе или культуре клеточной суспензии. Это было продемонстрировано во многих случаях путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растения, экспрессирующие такой же фенотип. Примеры включают отбор in vitro растений, устойчивых к гербицидам, патотоксинам или заболеваниям, антибиотикам, аминокислотным аналогам, солям и т.д. (см. работы Chaleff, 1981; Evans и др. 1983; Vasil, 1986).

Поскольку ацетолактатсинтаза представляет собой фермент, вовлеченный в основную клеточную метаболическую активность аминокислотного биосинтеза, ожидалось и было продемонстрировано, что гены, кодирующие этот фермент, экспрессируются в каллюсной ткани также, как и в целом растении. Сульфонилмочевинные устойчивые мутанты табака, описанные в этом патенте, S4, C3 и Hra, вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы на целые растения, в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом (Chaleff и Ray, 1984). Каллюсные ткани, происходящие от регенерированных растений или их потомства, продолжают расти при концентрациях гербицида, которые ингибируют рост каллюса дикого типа. Таким образом, устойчивость к гербициду на основе сульфонилмочевины на уровне клеток растений прогнозируется устойчивостью на уровне целого растения. Кроме того, в бактериях, дрожжах и высших растениях было продемонстрировано, что мутации, приводящие к получению гербицидустойчивой АЛС, достаточны для того, чтобы придать устойчивость на клеточном уровне и в случае использования растений на уровне всего растения. Следовательно, данные наблюдений за гербицидустойчивой АЛС в экстрактах растительных клеток также прогнозируются гербицидустойчивым ростом культурных растительных клеток и гербицидустойчивым ростом целых растений.

Существуют ограничения для получения гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений посредством тканевой культуры или мутагенеза семян: 1) метод тканевой культуры ограничен теми культурами растений, которые подвергаются манипулированию и регенерации из тканевой культуры, 2) растения, происходящие от мутагенеза семян и возможно из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют проведения многочисленных генетических обратных скрещиваний, и 3) перенос устойчивого гена путем размножения был бы ограничен до культурных сортов одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществления многократных генетических обратных скрещиваний. Поэтому выделение фрагмента нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость, и его последующее интродуцирование в сельскохозяйственные культуры посредством генетической трансформации должны позволить осуществление быстрого, межвидового переноса гербицидной устойчивости и устранить многие из вышеуказанных ограничений.

Хотя гены, выделенные из одного растения, были интродуцированы и экспрессированы в других растениях, нерастительные гены были экспрессированы в растениях только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерастительных генов были сцеплены с растительными регуляторными последовательностями, необходимыми для генной экспрессии. Однако было бы трудно интродуцировать гербицидную устойчивость в растения путем введения химерных генов, состоящих из бактериальных или дрожжевых генов гербицидустойчивых форм АЛС, поскольку (а) эти микробные АЛС-ферменты, как полагают, не содержат специфическую сигнальную (транзитную) пептидную последовательность, требуемую для ввода в растительные хлоропласты, представляющие собой клеточное местоположение растительной АЛС, (б) бактериальные изозимы состоят из двух различных полипептидных субъединиц и (в) микробные АЛС-ферменты оптимально не могут функционировать в чужеродной клеточной среде высших растений. Следовательно, существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые (1) кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛС и (2) придают гербицидную устойчивость, когда они интродуцированы в гербицидчувствительные растения.

Ближайшим решением к предлагаемому способу является способ в статье "Herbicide Resistant Mutants from Tobacco Cell Cultures", написанной авторами Chaleff и Ray (Science, v. 223. 1984, 1148 1151). В этой статье описано получение растений, устойчивых к гербицидам, путем изоляции селекцией спонтанных мутаций в культуре табачной клетки и регенерации табачных растений из устойчивых клеток.

Однако в указанной статье не содержится сведений, относящихся к молекулярной биологии по устойчивости к гербицидам, и не имеется сведений о возможности идентифицирования и изолирования последовательности ДНК, кодирующей устойчивую к гербицидам форму биосинтетического фермента ацетолактатсинтазы и о способе регулирования роста нежелательной растительности путем трансформации различных культурных растений новыми последовательностями ДНК и обработки трансформированных культур эффективными количествами гербицидов для полного подавления сорняков без повреждения культурных растений. Данное изобретение является первым отчетом о такой успешной трансформации растений. Подобных сведений по молекулярной биологии ацетолактатсинтазы не имеется. Так как культивирование сахарной свеклы, картофеля и Brassica является исключительно важным в России, заявленный способ регулирования роста нежелательной растительности путем применения гербицида в локусе, где культурные растения включают в себя трансформированные растения, устойчивые к гербицидам, является весьма полезным в связи со всеобщей практикой ежегодного семяоборота после использования сульфонилмочевинных гербицидов. Устойчивость к гербицидам влечет за собой увеличенную надежность, которая будет обеспечивать семяоборот без повреждения.

Согласно настоящему изобретению предлагается способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербецидам двудольных растений, предусматривающий культивирование клеток на селективных средах, отбор устойчивых к гербициду клеток и получение регенерантов. Отличительной особенностью способа является предварительное конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующей устойчивую к гербициду ацетолактатсинтазу, нуклеотидная последовательность которого содержит по крайней мере одну из консервативных субпоследовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности A, B, C, D, E, F и G, перенесение плазмидной ДНК в Agrobacterium tumefaciens в результате тригибридного скрещивания, трансформирование протопластов растений агробактериями и отбор трансформантов, при этом аминокислотная последовательность A представляет собой последовательность из четырех аминокислот, гомологичных последовательности пролин-глицин-глицин (2)- аланин(1), соответствующих 119 122 аминокислотам ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме аланина, 2 любой аминокислотой, кроме глицина; аминокислотная последовательность B представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности глицин-глутамин-валин-пролин(1), соответствующих 194 197 аминокислотам ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме пролина; аминокислотная последовательность C представляет собой последовательность из 8 аминокислот, гомологичных последовательности изолейцин-глицин-треонин-аспарагиновая кислота-аланин(2)-фенилаланино-глутамин-глутаминовая кислота, соответствующих аминокислотам 201 208 ацетолактатсинтазы растения, где 2 является любой аминокислотой, кроме аланина; аминокислотная последовательность D представляет собой последовательность из трех аминокислот, гомологичных последовательности -пролин-лизин(1)-аспарагиновая кислота, соответствующих последовательностям 255 257 ацетолактатсинтазы растения, причем 1 является любой аминокислотой, кроме лизина; аминокислотная последовательность E представляет собой последовательность из пяти аминокислот, гомологичных последовательности -аргинин-фенилаланин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота (1)-аргинин, соответствующих аминокислотам 381 385 ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме аспарагиновой кислоты; аминокислотная последовательность F представляет собой последовательность из десяти аминокислот, гомологичных последовательности -глицин-метионин-валин(8)-валин-глутамин-триптофан(3)-глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота-аргинин-фенилаланин(7), соответствующих аминокислотам 586 595 ацетолактатсинтазы растений, где 3 является любой аминокислотой, кроме триптофана, 8 является любой аминокислотой, кроме валина, 7 является любой аминокислотой, кроме фенилаланина; аминокислотная последовательность G представляет собой последовательность из шести аминокислот, гомологичных последовательности -метионин-лейцин-глицин-метионин(1)- гистидин-глицин, соответствующих аминокислотам 356 361 ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме метионина.

Используемый фрагмент, кодирующий ацетолактатсинтазу растений, способен вводиться в конструкцию нуклеиновых кислот, используемую для трансформации растения, содержащего ацетолактатсинтазу дикого типа, которое является чувствительным к сульфонилмочевинному гербициду, причем данный фрагмент нуклеиновых кислот, имеющий по крайней мере одну точечную мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислот дикого типа, кодирующего ацетолактатсинтазу растений таким образом, что при трансформации данной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение содержит данный фрагмент нуклеиновых кислот и приобретает устойчивость к сульфонилмочевинному гербициду.

Настоящее изобретение позволяет получить белок ацетолактатсинтазы, который устойчив к сульфонилмочевинному гербициду, содержащему аминокислотную последовательность, в которой происходит замещение по крайней мере одной аминокислоты, а также конструкцию нуклеиновых кислот двудольных растений, которые содержат определенный фрагмент нуклеиновых кислот. Изобретение позволяет трансформировать растения определенными фрагментами, проводить селекцию трансформированных растительных клеток и выращивать трансформированные растения.

Селекцию растительных клеток, трансформированных фрагментом нуклеиновых кислот, можно проводить интродукцией фрагментов в растительные клетки, чей рост чувствителен к ингибированию гербицидами, к которым АЛС, кодируемая фрагментом, является устойчивой. В этом случае трансформированные растительные клетки, чей рост устойчив к отобранному гербициду, можно идентифицировать селекцией при концентрации гербицида, которая ингибирует рост нетрансформированных растительных клеток.

Настоящее изобретение позволяет также контролировать нежелательный вегетативный рост в очаге, где культивируют гербицидустойчивое, агрономически полезное растение (трансформированное фрагментом нуклеиновых кислот настоящего изобретения) путем внесения в защищаемый очаг эффективного количества гербицида. Изобретение позволяет определить с помощью фрагмента нуклеиновых кислот, содержащего фрагмент нуклеиновых кислот, кодирующий ацетолактатсинтазу, придающую гербицидную устойчивость, второй фрагмент нуклеиновых кислот, кодирующий второй признак. Причем первый фрагмент нуклеиновых кислот используют для трансформации растения, и экспрессию гербицидной устойчивости указанным растением при внесении соединения сульфонилмочевины используют для определения наличия второго фрагмента нуклеиновых кислот в данном растении.

Фиг. 1 представляет собой физическую карту вставочных фрагментов нуклеиновых кислот, содержащих гены АЛС, выделенные из геномной библиотеки ДНК из мутанта Hra табака.

Фиг.2 представляет собой схему плазмиды pAGS 152, показывающую физическую карту фрагмента нуклеиновых кислот из табака, кодирующего гербицидустойчивую АЛС.

Фиг.3 представляет собой физическую карту вставочного фрагмента нуклеиновых кислот в фаговом клоне 35, выделенном из геномной библиотеки ДНК из мутанта C3 табака.

Фиг. 4 представляет собой нуклеотидную последовательность гена мутанта Hra табака, кодирующего гербицидустойчивую форму АЛС, и выведенную из нее аминокислотную последовательность.

Фиг.5 представляет собой нуклеотидную последовательность гена мутанта C3 табака, кодирующего гербицидустойчивую форму АЛС, и выведенную из нее аминокислотную последовательность.

Фиг. 6 и 7 представлены сравнения выведенных аминокислотных последовательностей больших субъединиц бактериальной АЛС и дрожжевых и растительных АЛС-ферментов.

Фиг.8 представляет собой физическую карту вставочного фрагмента нуклеиновых кислот и суб-фрагментов, происходящих от фагового клона 21, выделенного из геномной библиотеки ДНК свеклы сахарной.

Фиг. 9 представляет сравнение выведенных аминокислотных последовательностей растительных АЛС-ферментов.

Получение ДНК-фрагментов, кодирующих гербицид-устойчивую ацетолактатсинтазу (АЛС) Каллюсные культуры чувствительного табака (Nicotiana tabacum, разновидность Xanthi) подвергают воздействию сульфометуронметила при 2 частях на биллион (ppb) в соответствии с методом, описанным Chaleff в патенте США N 4443971. Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные C3 и S4. Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что каждая из линий C3 и S4 несет единственную полудоминантную ядерную генную мутацию, отвечающую за признак гербицидной устойчивости, а также то, что мутации C3 и S4 не связаны генетически, то есть находятся в различных генах, обозначенных SURA и SURB соответственно. Как показывает анализ, линии C3 и S4 продуцируют активность фермента АЛС, в 100 раз более устойчивого к сульфонилмочевинным гербицидам хлорсульфурон и сульфометуронметил, чем АЛС от дикого типа. Гербицидустойчивой АЛС-активность расщепляется в генетических кроссах и наследуется совместно с устойчивостью к ингибированию роста растений гербицидами. Наблюдение за двумя различными генами, которые мутировали с образованием гербицидустойчивой АЛС, не дало неожиданных результатов, поскольку N. tabacum, как полагают, представляет собой аллотетраплоид, образованный из N. tomentosiformis и N. sylvestris, по существу, содержащих два полных генома. Так, каждая клеточная линия C3 и S4 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Линию клеток S4 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ppb, избирательная концентрация которого полностью ингибирует рост S4. Идентифицируют линии клеток, устойчивые к 200 ppb; одну такую линию обозначают Hra. Hra переносят концентрации сульфометуронметила в 1000 раз большие, чем те, которые требуются для полного ингибирования роста каллюса дикого типа. Как показывает анализ, линия Hra кросс-резистентна к хлорсульфурону. Растения регенерируют из каллюсных культур Hra. Генетический анализ растений показывает, что Hra и S4-мутации связаны, что говорит о том, что линия Hra содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительской линии S4. Определяют активность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растениях табака гомозиготного мутанта Hra. Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Hra приблизительно в 1000 раз более устойчива к хлорсульфурону, чем активность растений дикого типа. Растения мутанта Hra кросс-резистентны к некорневому питанию следующими соединениями: 2-(2-хлорэтокси)-N-[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)- аминокарбонил] бензолсульфонамид; 2-хлор-N-[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)аминокарбонил] - бензолсульфонамид; 2-[[(4-хлор-6-метоксипиримидин-2-ил)аминокарбонил] аминосульфонил] бензойная кислота, сложный этиловый эфир; N-[(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)аминокарбонил] -2,3-дигидро-2- метилбензо[]тиофен-7-сульфонамид, 1,1-диоксид; 7-хлор-N-[(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)аминокарбонил] -3,4-дигидро-2-метил- 2H-1,2-бензотиазин-8-сульфонамид, S,S-диоксид; 2-[[(4-метокси-6-метилпиримидин-2-ил)аминокарбонил] аминосульфонил]-6-метилбензойная кислота, сложный метиловый эфир; 2-[[(4,6-диметилпиримидин-2-ил)аминокарбонил] аминосульфонил] бензойная кислота, сложный метиловый эфир.

Для того, чтобы клонировать ген гербицидустойчивой АЛС, ДНК табака выделяют из гомозиготной мутантной линии S4 Nicotiana tabacum. Порции по 50 г каллюсной ткани замораживают в жидком N2 и затем лиофилизуют. Полученную высушенную ткань измельчают при температуре около 23oC в мешалке с использованием 15-секундных импульсов до превращения в порошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора (0,3 М сахароза, 50 мМ трис-HCl pH 8,0, 5 мМ MgCl2) добавляют в смесь и полученную суспензию инкубируют при температуре 0oC в течение 5 мин. Суспензию фильтруют через марлю и центрифугируют при 350g в течение 10 мин. Зернистый осадок ресуспендируют в лизисном буферном растворе (20 мМ ЭДТК; 50 мМ трис-HCl pH 8,0, 1% Sarkosyl), добавляют CsCl с получением 0,95 г на мл буферного раствора, и полученную смесь центрифугируют при 17000g в течение 20 мин при температуре 4oC. Бромид этидиума бромид соединения этила с металлом: MeC2H5 - добавляют к полученному супернатанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломления регулируют до 1,39 и полученный раствор центрифугируют при 90000g в роторе Beckman Ti 70 при температуре 20oC в течение 3 дней. Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепляют от градиента и обрабатывают изопропанолом для экстрагирования бромида этидиума. ДНК диализуют против буфера ТЭ и осаждают путем прибавления этанола.

Геномную библиотеку Nicotiana получают из этой ДНК следующим образом, используя фаг лямбда-вектора EMBL4, описанный в работе Frischauf и др. J. Mol. Bio. 170: 827 (1983). Фаг EMBL4 получают из биомассы с агаровых чашек, получаемой по методу Davis и др. Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1980). Фаговую ДНК получают, как описано Silhavy и др. Experiments with Gene Fusions (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1984), путем концентрирования фага полиэтиленгликолем, удаления полиэтиленгликоля экстракцией хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина. Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этанола. Для получения плечей фага EMBL4 фаговую ДНК последовательно переваривают эндонуклеазами Sal I и Bam HI. Плечи отжигают и затем отделяют от центрального фрагмента на 10 40%-ном сахарозном градиенте, как описано в работе Maniatis и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1982). Плечи полностью денатурируют и повторно отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную, как ранее описано, частично переваривают эндонуклеазой Sau3A и осаждают посредством градиента 10 40%-ной сахарозы. Фракции от сахарозного градиента анализируют электрофорезом на 0,5%-ных агаровых гелях. Фракции, содержащие фрагменты 20 40 кб, диализируют, осаждают и лигируют к плечам ДНК лямбда-фага. ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на мл вектора и 45 мкг на мл вставки ДНК. Полученные лигированные конкатамеры затем упаковывают с использованием экстрактов упаковки лямбда ДНК. Полученный выход фага составляет приблизительно 4,5105 фагов на мкг вставки ДНК. Конструируют библиотеку из приблизительно 400000 фагов, представляющую вычисленную 99%-ную полную библиотеку для табака, которая имеет приближенное геномное содержание 1,65 пг или 1,52109 пар оснований (Zimmerman и др. Chromosoma 59: 227, 1977).

Полученную фаговую библиотеку ДНК Nicotiana выращивают и высевают на чашки на штамме LE 392 E. coli (ATCC 33572), как описано Silhavy и др. Experiments with Gene Fusions. (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1984). Фаги высевают на чашки с получением 2000 5000 пятен на 90 мм чашках Петри или 50000 пятен на 150 мм чашках Петри. Подъемы пятен осуществляют по методу Benton и др. Science 196: 180 (1977). Вслед за переносом фаговой ДНК к нитроцеллюлозным фильтрам фильтры предварительно гибридизируют путем инкубирования в течение приблизительно 4 ч при температуре 56oC в 6SSPE, содержащем 0,5% ДДС Na, 100 мкг на мл денатурированной ДНК телячьего тимуса и 10 раствора Denhardt. Гибридизацию осуществляют так, как описано Maniatis и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1982, с. 326). На этой стадии добавляют свежую аликвоту гибридизационного раствора вместе с приблизительно 108 отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию проводят в течение 24 48 ч при температуре 56oC. В этот момент фильтры вначале промывают в течение приблизительно 4 ч в 6SSPE при температуре 56oC, затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2SSPE при температуре около 23oC. Затем фильтры сушат и подвергают воздействию при температуре -70oC в течение 2 дней рентгеновской пленки Kodak XAR или XRP и усиливающего экрана Du Pont Cronex Lighting PlusTM. Открытые пятна на пленке указывают положение зон гемолиза, потенциально содержащих гены АЛС Nicotiana.

Авторадиограммы, полученные, как описано выше, затем ориентируют над первоначальными, бактериофаг-содержащими чашками Петри. Используя широкий конец стерильной пастеровской пипетки, выщипляют бляшки, соответствующие наиболее темным пятнам на авторадиограммах. Собранные бляшки затем элюируют буфером SM и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Каждая чашка получает около 100 200 фагов. Затем повторяют полный процесс определениям местоположения фагов, используя вновь приготовленный зонд. Таким образом повторяют стадии определения местоположения и выделения фагов до тех пор, пока большинство бляшек не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способной гибридизироваться к зонду гена АЛС дрожжей.

Мини-препараты ДНК из очищенного от пятен фага, обозначенного NtAI 3, выделяют, как описано, и обрабатывают, как описано Maniatis и др. Molecular Cloning: A Lanorarotv Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1982, с. 371). Фрагменты мини-препаратов ДНК, полученные с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, подвергают электрофорезу через 0,7% агарозные гели и блоттингу на нитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена. Фрагменты, способные гибридизироваться с зондом, затем выделяют и субклонируют в векторы pBR 322, M13 mp 9 или M13 mp 18. Эти фрагменты затем секвенируют с использованием олигонуклеотидных праймеров в методике дидезокси-терминации цепи, осуществляемой, в основном, как описано в работе Sanger и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977). Используют комплект приборов, поставляемый New England Biolabs (Беверли, Масс. США). Использование синтетических олигонуклеотидных праймеров позволяет осуществить наращивание ДНК-последовательности вдоль клонированного фрагмента в перекрывающихся сегментах. ЭВМ-анализ последовательности ДНК идентифицирует открытую рамку считывания 667 кодонов. Выведенная аминокислотная последовательность этой открытой рамки считывания в основном гомологична последовательностям, ранее определенным из гена ILV2 Saccharomyces cerevisiae и гена ilvG E. coli, что указывает на то, что фрагмент ДНК, восстановленный из геномной библиотеки Nicotiana, содержит ген АЛС табака. Для того, чтобы определить, кодирует ли ген АЛС гербицидустойчивый фермент дикого типа или мутантный гербицидустойчивый фермент из линии S4, ген интродуцируют в гербицидустойчивый табак дикого типа посредством Agrobacterium tumefaciens опосредованной трансформации.

Требуется генетический маркер для отбора трансформированных растительных клеток. Используют устойчивость к антибиотику G-418, получаемую в результате экспрессии в растениях, бактериального гена NPT II, кодирующего неомицинфосфотрансферазу. Для осуществления экспрессии NPT II регуляторные последовательности растений сливают с областью кодирования NPT II в векторе pKNK. Вектор pKNK происходит от традиционно используемой плазмиды pBR322 в результате отщепления сайтов Hind III и BamH I и инсерции в сайт Cla I фрагмента Cla I (приблизительно 2,3 кб), который состоит из следующих компонентов:
а) последовательность Cla I-Bgl II длиной 320 п.н. содержащая промоторную область гена неомицинфосфотрансферазы (NPT II) транспозона Tn 5, получена в результате преобразования сайта Hind III в сайт Cla I [Beck Е. Ludwig G. Auerswald E.A. Reiss В. и Schaller H. (1982) Gene, 19: 327 336]
б) последовательность Sau 3 A-Pst I длиной 296 п.н. содержащая промотор нопалинсинтазы (NOSP), получена от гена нопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды -263 до +33 относительно сайта начала транскрипции) [Depicker A. Stachel S. Dhaese P. Zambryski P. и Goodman H.J. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561 - 574] путем создания сайта Pst I у кодона инициации;
в) последовательность Hind III- BamH I длиной 998 п.н. содержащая кодирующую последовательность для гена NPT II, получена от Tn 5, путем создания сайтов Hind III и BamH I у нуклеотидов 1540 и 2518 [Beck Е. Ludwig G. Auerswald E.A. Reiss В. и Schaller H. (1982) Gene, 19: 327 336] соответственно;
г) последовательность BamH I-Cla I длиной 702 п.н. содержащая 3'- область гена нопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды 848 1550) [Depicker А. Stachel S. Dhaese P. Zambryski P. и Goodman H.J. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561 574]
Нуклеотидная последовательность у слияния NOSP и последовательности кодирования NPT II выглядит следующим образом:
NOS Последовательность NPT II Последовательность AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGATCGTTCGC ATG
Pst I Hind III
Вектор pKNK расщепляют рестрикционным ферментом Sal I (BRL) и полученный линейный вектор после экстракции фенолом соединяют в присутствии ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs) с очищенным фрагментом Sal I (2,1 кб), несущим бактериальный ген неомицинфосфотрансферазы I (NPT I) в качестве селектируемого маркера для бактериальной устойчивости к канамицину. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток HB 101 Е. coli, и трансформанты селектируют на чашках, содержащих 100 мг/л канамицина. Полученную рекомбинантную плазмиду, обозначенную pKNKS, подвергают очистке.

Плазмиду pKNKS расщепляют рестрикционным ферментом Eco RI (BRL) и ее концы делают затупленными фрагментом Кленова (BRL). Полученную линейную ДНК соединяют в присутствии ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs) с фосфорилированными линкерами Bgl II. Вслед за экстенсивным перевариванием рестрикционным ферментом Bgl II (BRL) для удаления избыточных линкеров ДНК пропускают через колонку гель-фильтрации Сефадекс G-150 (очищенный) (Pharmacia) с тем, чтобы отделить ее от линкеров. Фрагмент ДНК выделяют и объем регулируют с получением концентрации ДНК около 78 мкг/мл. 1 мкл ДНК самолигируют в присутствии ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs) в общем объеме 5 мкл и используют для трансформации компетентных клеток Е. coli HB101. Ампициллинустойчивые клетки содержат плазмиду pKNKSG, которая идентична плазмиде pKNKS, за исключением того, что рестрикционный сайт EcoRI замещен сайтом Bgl II.

Фрагмент Sma I фага NtA13 содержит область, которая гибридизируется к дрожжевому гену АЛС. Фаг NtA13 частично переваривают рестрикционным ферментом Sma I (New England Biolabs) и вслед за экстракцией фенолом присоединяют к фосфорилированным линкерам BamH I (New England Biolabs) в присутствии ДНК лигазы T4 (New England Biolabs). После переваривания BamH I и удаления избыточных линкеров путем электрофореза на агарозном геле рестрикционный фрагмент BamH I (16 кб), содержащий ген АЛС табака от фага NtA13, выделяют из геля электроэлюированием и используют для дальнейшего клонирования.

Вектор pKNKSG линеаризуют рестрикционным ферментом Bgl II (BRL) и вслед за дефосфорилированием кишечной фосфатазой теленка (Boehringer Mannheim) его присоединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 (New England Biolabs) к рестрикционному фрагменту (16 кб) BamH I, происходящему из фага NtA13. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток E. coli HB101, и ампициллинустойчивые трансформанты содержат рекомбинантную плазмиду, обозначенную pIV13. Ориентация фрагмента-вставки в pIV13 такова, что открытые рамки считывания гена NOS NPT II в векторе и гена АЛС во вставке находятся в противоположных направлениях. Е. coli HB 101 (pIV13) после очистки тремя штриховыми разводками одной колонии используют для трехродительского скрещивания.

3 мл ночных культур Е. coli HB101 (pIV13) и Е. coli HB101 (pRK 2013) (номер ATCC 37159) в среде ЛБ, содержащей 25 мг/л канамицина, выращивают при температуре 37oC, Agrobacterium tumefaciens GV 3850 в среде ЛБ при температуре 28 29oC. Клетки собирают при комнатной температуре в клинической центрифуге, промывают один раз в среде ЛБ, не содержащей лекарства, собирают и ресуспендируют в 3 мл ЛБ. 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь переносят на миллипоровый фильтр (2,5 см HAWP, 0,45 мкм), помещенный на поверхности трех фильтров из ватманской бумаги N 1 в чашке Петри. После того, как вся жидкая среда абсорбируется ватманским фильтром (около 30 мин), миллипоровый фильтр с бактериями на его верхней поверхности кладут (бактериями набок) на чашку со средой ЛБ без лекарства. После инкубирования в течение ночи при температуре 28 29oC миллипоровый фильтр переносят к 5 мл 10 мМ раствора MgSO4 и завихряют с тем, чтобы ресуспендировать бактерии в растворе. 0,1 мл аликвоты высевают на чашки с селективной средой [чашки с минимальной средой M9, содержащие 20% сахарозу, 1 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2 и 1 мг/мл канамицина (Sigma)] Несколько больших колоний появляются примерно через 4 дня инкубирования при температуре 28 29oC. Несколько трансконъюгантов очищают с помощью трех последовательных штриховых разводок (одноколониевыми) на тех же селективных чашках. Ожидают рост только Agrobacteria, содержащих плазмиду pIV13, вновь объединенную с эндогенной плазмидой pGV3850 посредством их общих последовательностей pBR322. Это подтверждают анализом по Саузерну, который проводят перед использованием плазмиды GVKNT 13 для трасформации растений с помощью Agrobacterium.

Для трансформации растительных клеток следуют стандартным асептическим методикам для манипуляции стерильными средами и аксенными растительно-бактериальными культурами, включая использование колпака с ламинарным потоком для всех переносов. Рецепты для сред представлены в примере VI. Консервированные растения табака для заражения листовых пластин выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24oC и 12 ч при ночной температуре 20oC, при относительной влажности около 80% при смешанном холодном свете флуоресцентного и температурного свечения. Заражения листовых пластин табака осуществляют, в основном, по методу Horsch и др. (1985), Science, 227. с. 1229.

Молодые листья, неполностью распустившиеся и имеющие приблизительно 4 6 дюймов (101,6 152,4 мм) в длину, собирают скальпелем с растений табака (Nicotiana tabacum, разновидность Xanthi) приблизительно 4 6-недельного возраста. Поверхность листьев стерилизуют в течение 30 мин погружением их в 500 мл 10%-ного Chlorox, 0,1%-ного раствора додецилсульфата натрия и затем промывают три раза стерильной деионизированной водой. Листовые пластины диаметром 6 мм получают из целых листьев с использованием стерильного бумажного пуансона.

Листовые пластины инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл 1 10 разбавления ночной культуры Agrobacterium, несущей плазмиду GCKNT 13. Культуры Agrobacterium появляются после инокулирования 10 мл бульона YEB единственной бактериальной колонией, удаленной из чашки со средой R-агара. Культуру выращивают приблизительно 17 20 ч в 18-мм стеклянных пробирках с культурой в качалке с платформой New Brunswick, поддерживая температуру 28oC.

После инокулирования листовые пластины помещают на чашки Петри, содержащие CN-агаровую среду. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанных флуоресцентом и "Gro and Sho" освещениях для растений (General Electric) в течение 2 3 дней в камере для культур, где поддерживается температура около 25oC.

Для того, чтобы избавиться от Agrobacterium и отобрать для роста трансформированные клетки табака, листовые пластины переносят на свежую CN-среду, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного 100 мг/мл основного раствора и добавляют асептически (стерилизуют через 0,45 мкм фильтр) к средам после автоклавирования. Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготавливают для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская в автоклавированные среды.

Листовые пластины инкубируют в условиях роста, описанных выше, в течение 3 недель и затем переносят на свежие среды с таким же составом.

Приблизительно через 1 2 недели всходы, развивающиеся на среде, содержащей канамицин, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде A, содержащей либо 10 ppb хлорсульфурона, либо 100 мг/л канамицина. Корнеобразование на селективной и неселективной средах регистрируют в пределах 3 недель.

В течение 2 недель посева маленькие листья удаляют с подрезанных проростков для определения уровней устойчивости к хлорсульфурону и канамицину в проводимом испытании на каллюсовую индукцию на селективных средах. Для индуцирования образования каллюса маленькие листья отщепляют и разрезают на несколько участков при помощи скальпеля и засевают в B-среду, содержащую либо 10 ppb хлорсульфурона, либо 50 мг/л канамицина. Каллюсный рост на селективной и неселективной средах регистрируют в пределах 3 недель.

Приведенные в табл. 1 результаты указывают на то, что трансформация табака была достигнута за счет штамма GVKNT 13 и выявлена на основе получения канамицинустойчивого каллюса. Канамицинустойчивый каллюс остается чувствительным к сульфонилмочевинному гербициду хлорсульфурон, означая, что ген АЛС, выделенный из мутанта S4 табака в фаге Nta 13, кодирует гербицидчувствительный фермент дикого типа. Это ген АЛС растений был использован в качестве зонда гибридизации ДНК для выделения других растительных АЛС-генов, включая гены, которые кодируют гербицид-устойчивую АЛС.

Геномную библиотеку ДНК из мутанта Hra табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируются к гену АЛС табака дикого типа из мутанта S4. Выделяют несколько фаговых клонов. Физическое картирование ДНК-вставок табака с использованием рестрикционных эндонуклеаз выявляет присутствие двух различных классов фрагментов ДНК, представляющих два гена АЛС табака: SURA и SURB. Сравнение физических карт генов SURA и SURB N. tabacum с картами от прародительских видов показывает, что ген SURA происходит от N. sylvestris и ген SURB происходит от N. tomentosiformis. Ген АЛС дикого типа, выделенный ранее из мутанта S4, обозначают SURA. Генетическая связь высокого уровня мутации гербицидустойчивости Hra с мутацией S4 показывает, что мутация Hra наблюдается в том же гене АЛС, что и мутация S4, а именно SURB. Следовательно, ожидается, что ген SURB, выделенный из мутанта Hra, должен быть мутантным геном, обозначенным SURB-Hra. кодирующим гербицидустойчивую АЛС. Один фаговый клон, содержащий ген SURB-Hra, выбирают для дальнейшего анализа. Этот фаговый клон, обозначенный 3, депонирован Американской Коллекцией Типовых Культур, Роквилл, Мэриленд, под номером ATCC 40237. Фаговый клон переваривают рестрикционной эндонуклеазой Spe I с получением ДНК-фрагмента (8,3 кб), который встраивают в сайт Xba I плазмиды pMuc 19, и полученную рекомбинантную плазмиду pAGS148 депонируют в Американской Коллекции Типовых Культур, Роквилл, Мэриленд, под каталожным номером ATCC 67124. Плазмиды pAGS148 и pAGS135 лигируют одна с другой, как описано ниже, и полученную рекомбинантную плазмиду pAGS152 (фиг. 2) интродуцируют в Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Полученную Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (pAGS152) депонируют в Американской Коллекции Типовых Культур под каталожным номером ATCC 67126.

Геномную библиотеку ДНК из мутанта C3 табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируются с ранее выделенными генами АЛС из табака. Несколько фаговых клонов выделяют, после чего ДНК-вставки табака физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Идентифицируют два различных типа фрагментов ДНК, соответствующих гену SURA-C 3 и гену SURB. Два фаговых клона, обозначенные 35 и 38, несущие ген SURA-C 3, отбирают для дальнейшего анализа.

Фаговый клон 35 переваривают рестрикционными эндонуклеазами Spe I и Sal I с получением фрагмента ДНК (6,3 кб), показанного на фиг. 3. Этот фрагмент ДНК встраивают в плазмидный вектор pUC 119, обработанный рестрикционными эндонуклеазами Xba I и Sal I, и полученную рекомбинантную плазмиду pALS 35 депонируют в ATCC, Роквилл, Мэриленд под каталожным номером ATCC 67424.

Кроме четырех генов АЛС табака, SURA и SURB, кодирующих гербицидчувствительную АЛС дикого типа, и SURA-C 3 и SURB-Hra, кодирующих мутантную гербицидустойчивую АЛС, гены АЛС выделяют из Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (свекла сахарная) и часть гена АЛС выделяют из Zea mays (маис). Последние гены АЛС из гербицидчувствительных растений получают из геномных библиотек ДНК, сконструированных в бактериофаге лямбда путем скрининга с ДНК, гибридизирующейся с ранее выделенным геном АЛС из дрожжей или табака. Ген АЛС дикого типа из сахарной свеклы выделяют в фаге, обозначенном Ф21, и физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. ДНК-фрагмент, выделенный в этом фаге, и два ДНК-фрагмента, которые были субклонированы в плазмидный вектор pUC 119, представлены на фиг. 8. Плазмида pSBALS216 депонирована в ATCC, Роквилл, Мэриленд под каталожным номером 67425.

На фиг. 1 показаны рестрикционные карты фрагментов ДНК, содержащих гены АЛС, выделенные из мутанта Hra табака. На основе этих карт можно различить два класса фрагментов ДНК. Вставка нуклеиновых кислот (приблизительно 18 кб) в фаговом клоне 3 несет ген SURB-Hra. Вставка содержит предпочтительный фрагмент ДНК настоящего изобретения, который кодирует гербицидустойчивую АЛС из табачного мутанта Hra. Этот фрагмент нуклеиновых кислот состоит из двунитевой ДНК (8,30,5 кб) и имеет молекулярную массу 5,50,3 МДа а также имеет 5' выступающие последовательности CTAG по обоим концам. Фрагмент нуклеиновых кислот (8,3 кб) между двух сайтов Spe I гибридизируется к зонду гена АЛС, используемому для скрининга геномной библиотеки. Рестрикционную эндонуклеазу Spe I можно использовать для отщепления фрагмента от фага, используя для этого хорошо известные методики.

На фиг. 2 представлена физическая карта плазмиды pAGS152. Плазмиды pAGS135 и pAGS148 даны не в масштабе. Показаны сайты рестрикции EcoR I (RI), BamH I (B), Xba I (X), Pst I (P), Sal I (S), Spe I (Sp), Nco I (N), Hind III (H), BstE II (Bs), Sma I (Sm), Kpn I (K), Sst (St), Sph I (Sh), a также Bgl II (G). Плазмида pAGS152 происходит в результате легирования BamH I расщепленных плазмид pAGS 135 (приблизительно 27 кб) и pAGS148 (приблизительно 12,1 кб). Плазмида pAGS135, вычерченная в виде круга, представляет собой плазмиду широкого спектра хозяев, содержащую растительный ген, ген устойчивости к канамицину (NOS NPT II), и клонирующий сайт BamH I, фланкированный по левой границе (LB) и правой границе (RB) Т-ДНК. Плазмида pAGS148, показанная в виде линейного фрагмента BamH I, состоит из фрагмента Spe I (Sp) (приблизительно 8,3 кб) варианта настоящего изобретения (показана фланкированной посредством X/Sp и Sp/X), содержащего кодирующую последовательность для гербицидустойчивой формы АЛС, из мутанта Hra, вставленную в сайт Xba I (X) плазмиды pMuc19. Хотя рестрикционные ферменты Spe I и Xba I узнают различные последовательности, их действие приводит к образованию ДНК-фрагментов с такой же 5' выступающей последовательностью, а именно 5'-CTAG-3'. Таким образом, фрагменты, обработанные Spe I и Xba I, могут быть легированы один к другому, однако легирование приводит к потере обоих сайтов. Заштрихованная часть на фрагменте вставки соответствует кодирующей области гена АЛС, и стрелка обозначает направление 5' _ 3' кодирующей последовательности. Фрагмент нуклеиновых кислот фланкируется сайтами Hind III, Sph I, Pst I и Sal I у одного конца и сайтами BamH I, Sma I, Kpn I, Sst I и EcoR I с другого конца. Эти ферменты могут быть использованы для вырезания фрагмента из плазмиды путем частичного переваривания с использованием для этого хорошо известных методик. После переваривания концы фрагмента будут отличительной чертой эндонуклеазы, используемой для вырезания фрагмента (фиг. 10).

Фрагмент (8,3 кб) может быть выделен из рестрикционного переваривания с использованием электрофореза в агаровом геле. Фрагмент может быть охарактеризован картой рестрикции, приведенной на фиг.2, и содержит кодирующую последовательность для АЛС из мутантного растительного Hra Nicotiana tabacum, разновидность "Xanthi", устойчивого к ингибированию хлорсульфуроном и сульфометуронметилом. Фрагмент также содержит регуляторные нуклеотидные последовательности, необходимые для экспрессии гена в растениях.

На фиг.3 представлена карта рестрикции предпочтительного фрагмента нуклеиновых кислот (приблизительно 6,8 кб), который несет ген SURA-C3. Этот фрагмент ДНК получают из клона 35 лямбда фага путем обработки рестрикционными эндонуклеазами Spe I и Sal I и инсерцируют в плазмидный вектор pUC119, который был обработан рестрикционными эндонуклеазами Xba I и Sal I, как описано в надписи к фиг. 2.

На фиг.4 представлена частичная нуклеотидная последовательность предпочтительного ДНК-фрагмента, кодирующего гербицидустойчивую форму АЛС из гена SURB-Hra. Нуклеотиды указаны их основаниями посредством следующих стандартных сокращений:
A аденин;
C цитозин;
T тимин;
G гуанин.

Начало нуклеотидной последовательности соответствует сайту Pst I (P), стоящему из 885 нуклеотидных оснований перед кодирующей последовательностью, показанной на фиг. 2; последовательность заканчивается у основания номер 2946, которое на 67 оснований выходит за конец кодирующей последовательности, показанной на фиг. 2. Нуклеотидная последовательность от нуклеотида N 1 до нуклеотида N 884, как полагают, содержит 5' регуляторную последовательность (последовательности), необходимые для экспрессии кодируемой АЛС. На Фиг.4 также показана выведенная аминокислотная последовательность белка АЛС.

Аминокислотные остатки указаны следующими сокращениями:
A аланин;
С цистеин;
D аспарагиновая кислота;
E глутаминовая кислота;
F фенилаланин;
G глицин;
H гистидин;
I изолейцин;
K лизин;
L лейцин;
M метионин;
N аспарагин;
P пролин;
Q глутамин;
R аргинин;
S серии;
T треонин;
V валин;
W триптофан и
Y тирозин.

Термин "аминокислоты", как он здесь используется, означает вышеприведенные природные аминокислоты и их функциональные эквиваленты.

На фиг.5 представлена частичная нуклеотидная последовательность и выведенная из нее аминокислотная последовательность предпочтительного фрагмента ДНК, кодирующего гербицидустойчивую форму АЛС из гена C3 табака. Начало нуклеотидной последовательности соответствует сайту BamH I, приведенному на фиг. 3. Кодирующая последовательность начинается у нуклеотида 176 и заканчивается у нуклеотида 2175. Нуклеотидная последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 175, как полагают, содержит 5' регуляторную последовательность (последовательности), необходимую, однако не достаточную для экспрессии кодируемой АЛС. Нуклеотиды и аминокислоты указаны стандартными сокращениями, как показано выше.

На фиг. 6, 7 приведены выведенные аминокислотные последовательности больших субъединиц АЛС-изоферментов I, II и III из E. coli (линии E, F и G соответственно), белков АЛС дикого типа дрожжей (линия D), Arabidopsis thaliana (линия C) и Nicotiana tabacum (табак) (линии A и B), кодируемые генами SURB и SURA соответственно. Аминокислотные остатки указаны стандартными сокращениями, как показано выше. Первая аминокислота, метионин, выведенных аминокислотных последовательностей дрожжей (линия D, фиг. 6, 7) и белков АЛС высших растений (линии A C) является мнимым началом транзитных пептидов, которые, как полагают, вовлечены в транслокацию ферментов в митохондрии, в случае дрожжевого фермента, или хлоропласты, в случае растительных ферментов. Эти транзитные пептиды, как полагают, расщепляются во время транслокации белков в органеллы и не требуются для активности АЛС. Простирание этих транзитных пептидов трудно определить при отсутствии данных по N-концам in vivo белков АЛС дрожжей и высших растений. На основании гомологии с бактериальными белками АЛС можно предположить, что хлоропластные и митохондриальные транзитные последовательности простираются на 90 аминокислот.

Пунктирные линии в последовательностях представляют собой промежуточные отметки, внесенные для выделения областей гомологии. Вертикальные линии подчеркивают аминокислотные остатки, которые сохраняются между смежными последовательностями фиг. 6, 7. Гомология между белками АЛС табака и Arabidopsis (линии A C), которые происходят от разных семейств растений, является поразительной. А учитывая эволюционное расстояние между микробами и высшими растениями, даже более неожиданным является открытие того, что аминокислотные остатки, сохранившиеся у бактериальных (линии E G) и дрожжевых (линия D) белков АЛС, в значительной степени сохраняются в белках АЛС растений.

На фиг. 8 представлена рестрикционная карта встроенного фрагмента нуклеиновых кислот (приблизительно 17,5 кб) в фаговом клоне Ф21, несущем ген АЛС свеклы сахарной. Также показаны два более мелких фрагмента ДНК, которые также содержат ген АЛС свеклы сахарной и которые были субклонированы в плазмидный вектор pUC119.

Фиг.9 показывает выведенные аминокислотные последовательности белков АЛС дикого типа из растений Nicotiana tabacum (табак) (линии A и B), Arabidopsis thaliana (линия C), Beta vulgaris, сорт sennica (свекла сахарная) (линия D) и частичную последовательность белка АЛС из маиса (линия E). Пунктирные линии в последовательностях представляют собой промежуточные отметки, внесенные для выделения областей гомологии. Вертикальные линии подчеркивают аминокислотные последовательности, сохранившиеся между смежными последовательностями. Гомология между всеми белками АЛС растений является очень обширной. В связи с вышеизложенным мутация в одном гене АЛС растений, вызывающая аминокислотное замещение, которое приводит к АЛС, устойчивой к сульфонилмочевинному гербициду, могла бы, как ожидают, иметь аналогичный эффект, если бы она присутствовала в любом другом гене АЛС растений.

Аминокислотные остатки, которые сохраняются во всех последовательностях АЛС на фиг. 6, 7, имеют важное значение для связывания с субстратами, гербицидами, коферментами и т.д. Эти последовательности, как полагают, значительно сохраняются во всех белках АЛС. Остатки, которые частично сохраняются в различных белках АЛС, могут принимать участие в менее консервативных аспектах ферментативной функции, как, например, управление гербицидной чувствительностью фермента и ингибированием его конечного продукта. Примеры такого рода могли бы включать устойчивость бактериального изофермента I к сульфометуронметилу и хлорсульфурону, а также бактериального изофермента II к ингибированию конечного продукта валином. Наконец, те остатки, которые не сохраняются между белками, возможно, находятся в каркасе белка АЛС, где дивергенция последовательности менее разрушительна для функции фермента.

Связывание сульфонилмочевинных гербицидов с АЛС во время синтеза ацетолактата, как полагают, облегчается связыванием первой пуриват-молекулы с ферментом. Тем не менее, связывание молекулы сульфонилмочевинного гербицида конкурентно связыванию второй пуриват-молекулы с ферментом. Чувствительность к сульфонилмочевинному гербициду сохраняется в продолжение эволюции в большинстве ферментов АЛС. На основании этих фактов обнаружено, что связывание сульфонилмочевинного гербицида происходит в месте нахождения или в непосредственной близости от одной или более, в основном консервативных аминокислот в белках АЛС. Авторами обнаружено, что замещения одного или более из 10 специфических аминокислотных остатков в одной или более из 7, в основном, консервативных субпоследовательностях A G придают гербицидную устойчивость. Ожидается, что замещение в других аминокислотных остатках в консервативных субпоследовательностях будет также придавать гербицидную устойчивость.

Устойчивость к сульфонилмочевинному гербициду в бактериях, дрожжах и высших растениях, которая кореллирует с гербицидустойчивыми формами АЛС, происходит в результате мутаций в структурных генах для АЛС. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов АЛС организмов, кодирующих гербицидчувствительные и гербицидустойчивые формы АЛС, позволяет определить, какие аминокислотные остатки фермента важны для ингибирования гербицидов. Одна мутация в гене ilvG E. coli, которая приводит к образованию фермента с повышенной устойчивостью к ингибированию сульфометуронметилом и с пониженной каталитической активностью, была обнаружена авторами при замещении аланина на валин в положении 122 (фиг. 6, 7). Другая мутация сульфометуронметиловой устойчивости в этом гене приводит к замещению аланина на серии в том же положении. Этот остаток аланина сохраняется во всех ферментах АЛС, за исключением бактериального изофермента 1 (фиг. 6, 7), который природно является устойчивым.

Многие гены, кодирующие гербицидустойчивые ферменты АЛС, выделены из спонтанных мутантов сульфонилмочевиноустойчивых дрожжей. Секвенирование этих генов показало, что молекулярную основу устойчивости составляют изменения в парах, которые приводят к аминокислотным замещениям в 10 различных положениях в белке (табл. 2), т.е. остатках 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и 595 (нумерация приводится относительно положений на фиг. 6, 7).

В шести из этих положений 122, 197, 205, 256, 384 и 591 (табл. 2) получено более чем одно замещение, которое придает гербицидную устойчивость. В положении 122, в котором остаток аланина присутствует во всех известных ферментах АЛС дикого типа, за исключением изофермента I Е. coli, замещения аспарагиновой кислотой, пролином, треонином или валином приводят к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 197, в котором остаток пролина присутствует во всех известных ферментах АЛС дикого типа, за исключением изоферментов II и III E. coli, замещения серином или аргинином приводят к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 205, в котором остаток аланина присутствует во всех известных ферментах АЛС дикого типа, замещения аспарагиновой кислотой или треонином приводят к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 256, в котором остаток лизина присутствует во всех известных ферментах АЛС дикого типа, замещения глутаминовой кислотой, аспарагином или треонином приводят к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 384, в котором аспарагиновая кислота присутствует во всех известных ферментах АЛС дикого типа, замещения глутаминовой кислотой, аспарагином или валином приводят к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 591, в котором триптофан присутствует во всех известных ферментах АЛС дикого типа, за исключением изофермента I E. coli, замещения аланином, цистеином, глицином, лейцином, аргинином или серином приводят к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС.

Были получены мутанты, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины, в результате аминокислотных замещений в других четырех положениях 121, 359, 588 и 595. В положении 121, в котором глицин присутствует во всех известных ферментах АЛС, замещение серином приводит к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 359, в котором метионин присутствует во всех известных ферментах АЛС, замещение валином приводит к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 588, в котором валин присутствует во всех известных ферментах АЛС, замещение аланином приводит к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 595, в котором фенилаланин присутствует во всех известных ферментах АЛС, за исключением изофермента III E. coli, замещение лейцином приводит к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС.

Олигонуклеотид-направленные, сайт-специфические мутации, которые приводят к аминокислотным замещениям в положениях 122, 205, 256, 359, 384 и 591, получены в дрожжевом гене, кодирующем АЛС (табл. 3).

В положении 122 выполнены мутации, приводящие к замещениям восемнадцатью аминокислотами аланина, который присутствует в АЛС дикого типа. Девятнадцатое замещение (аспарагиновая кислота) было выделено ранее как спонтанная мутация и поэтому не отмечается. Каждое замещение, за исключением глицина, приводит к получению сульфонилмочевиноустойчивой АЛС. В положении 205 мутации, приводящие к замещениям аланина, остатка дикого типа, на цистеин, глутаминовую кислоту, аргинин или триптофан, образуют сульфонилмочевиноустойчивую АЛС. В положении 256 мутации, приводящие к замещениям лизина, остатка дикого типа, на аспарагиновую кислоту, глицин, лейцин, пролин или триптофан, образуют сульфонилмочевиноустойчивую АЛС. В положении 359 мутации, приводящие к замещениям метионина, остатка дикого типа, на глутаминовую кислоту или пролин, образуют сульфонилмочевиноустойчивую АЛС. В положении 384 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям аспарагиновой кислоты, остатка дикого типа, на цистеин, глицин, пролин, лизин, серии или триптофан, образуют сульфонилмочевиноустойчивую АЛС. В положении 591 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям триптофана, остатка дикого типа, на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, гистидин, изолейцин, лизин, аргинин, валин, метионин, аспарагин, глутамин, треонин или тирозин, образуют сульфонилмочевиноустойчивую АЛС.

Все мутации, описанные в табл. 2 и 3, приводят к получению ферментов, которые активны и менее ингибируются гербицидами на основе сульфонилмочевины, чем ферменты дикого типа. Вместе взятые эти результаты показывают, что наибольшее количество замещений в этих десяти положениях приводит к получению ферментативно активной гербицидустойчивой АЛС.

Выведенные аминокислотные последовательности белков АЛС дикого типа из табака, Arabidopsis, сахарной свеклы и маиса показаны на фиг. 8. Аминокислотные остатки в положениях 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588 и 595 (нумерация положений с фиг. 6, 7) во всех растительных ферментах такие же, как те, которые присутствуют в гербицидчувствительном дрожжевом белке дикого типа (Фиг. 6, 7). Выведенная аминокислотная последовательность гена SURB-Hra АЛС табака, который кодирует гербицидустойчивую АЛС, приведена на фиг.4. Мутантный ген фиг.4 происходит из линии тканевой культуры, которая подверглась двум последовательным спонтанным мутациям. Две мутации, как показано, генетически связаны, и введение этого фрагмента в чувствительные клетки табака придает клеткам такой же уровень гербицидной устойчивости, который обнаружен для первоначального высокоустойчивого мутантного растения табака, от которого происходит данный фрагмент. На основе этих фактов ожидается, что должно быть два аминокислотных замещения в ферменте, кодируемом фрагментом. Сравнение выведенной аминокислотной последовательности мутантной АЛС с выведенной аминокислотной последовательностью АЛС дикого типа выявляет, что мутантная АЛС имеет замещение пролина на аланин в положении 197 (фиг. 6, 7) и замещение триптофана на лейцин в положении 591 (фиг. 6, 7). На основании вышеизложенного обнаружено, что замещения в остатках пролина 197 и триптофана 591 придают гербицидную устойчивость. Выведенная аминокислотная последовательность второго мутантного гена АЛС табака, SURA-C3, который кодирует АЛС, устойчивую к гербициду на основе сульфонилмочевины, приведена на фиг.5. Сравнение выведенной аминокислотной последовательности мутантного фермента с аминокислотной последовательностью фермента АЛС дикого типа (фиг.5 и 6, линия B) выявляет, что мутантная АЛС имеет единственное замещение пролина на глутамин в положении 197. Линия клеток C3, из которой был получен ген SURA-C3, показывает избирательную гербицидную устойчивость. То есть мутация C3 придает устойчивость к сульфонилмочевинным гербицидам, но не придает устойчивость к имидазолиноновому гербициду.

Идентификация аминокислотных замещений в гербицидустойчивых ферментах АЛС из растений в положениях 197 (от мутантов C3 и Hra) и 591 (от мутанта Hra) показывает, что замещения в положениях, операбельных в дрожжевой АЛС, также операбельны в растительной АЛС.

В то время как аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и 595, сохраняются во всех гербицидчувствительных ферментах АЛС дикого типа, до сих пор имеющих отличительные признаки эукариотов, некоторые замещения в этих положениях обнаружены в бактериальных ферментах АЛС дикого типа. Изофермент I E. coli имеет серин, а не аланин в положении 122 и глутамин, а не триптофан в положении 591; изофермент II E. coli имеет серин, а не пролин в положении 197; и изофермент III E. coli имеет аланин, а не пролин в положении 197, и изолейцин, а не фенилаланин в положении 595. Каждый из этих изоферментов АЛС Е. coli более устойчив (от 50 раз до более, чем 10000 раз) к ингибированию (определенными) сульфонилмочевинными гербицидами, чем растительная или дрожжевая АЛС. Кроме того, сайт-направленная мутация, вызывающая замещение серина на пролин в положении 197 в E. coli АЛС II, придает мутантному ферменту в 100 раз большую чувствительность к ингибированию, то есть такую чувствительность, которая присуща ферментам высших растений. Таким образом, пролин в положении 197 вовлечен в связывание с гербицидом в Е. coli АЛС II также, как и в АЛС дрожжей и высших растений.

Кроме того, были выполнены сайт-направленные мутации, которые приводят к замещениям триптофана на лейцин и глутамина на триптофан в положении 591, соответственно в АЛС II и АЛС I Е. coli. Мутация в АЛС II делает фермент более гербицидустойчивым, чем АЛС II дикого типа, тогда как мутация в АЛС I делает его более восприимчивым к гербициду, чем АЛС I дикого типа.

Сайт-направленные мутации в положениях 197 и 591 в АЛС I и АЛС II E. coli оказывают воздействие на ингибирование гербицидом мутантных ферментов, что можно предсказать в результате сопоставления с дрожжевыми и растительными белками АЛС гербицидустойчивых мутантов. Эти экспериментальные данные подтверждают универсальность аминокислотных остатков, вовлеченных в гербицидное связывание с ферментами АЛС из разнообразных источников.

Точные аминокислотные замещения, необходимые для придания гербицидной устойчивости, могут быть достигнуты посредством мутирования фрагмента нуклеиновых кислот, кодирующего гербицидчувствительную АЛС из любого растения, в основном следующим образом:
(1) выделяют геномную ДНК или мРНК из растения;
(2) конструируют геномную библиотеку из выделенной ДНК или кДНК-библиотеку из выделенной РНК;
(3) идентифицируют те фаги или плазмиды, которые содержат фрагмент ДНК, кодирующий АЛС;
(4) секвенируют фрагмент, кодирующий АЛС;
(5) субклонируют фрагмент ДНК, несущий ген АЛС в клонирующий носитель, который способен продуцировать однонитевую ДНК;
(6) синтезируют олигонуклеотид (около 15 20 нуклеотидов), который комплементарен определенной нуклеотидной последовательности АЛС, кодирующей одну из аминокислотных суб-последовательностей, изложенных выше, за исключением нуклеотидного изменения (изменений), необходимого для введения мутации в кодон аминокислоты, выбранной по ее способности придавать гербицидную устойчивость;
(7) прижигают олигонуклеотид к однонитевой ДНК, содержащей мутируемую область, и используют ее для первичного синтеза in vivo нити комплементарной ДНК, образующей гетеродуплекс;
(8) трансформируют бактериальные клетки гетеродуплексной ДНК;
(9) осуществляют скрининг трансформированных бактериальных клеток для тех клеток, которые содержат мутированный фрагмент ДНК, путем а) иммобилизации ДНК на нитроцеллюлозном фильтре, б) гибридизации с 5'-32P-меченым олигонуклеотидом с мутацией при температуре окружающей среды, и в) промывки ее в условиях повышения температуры с тем, чтобы избирательно отделить зонд от гена дикого типа, не содержащего мутацию;
(10) выделяют фрагмент двунитевой ДНК, содержащий мутацию из клеток, несущих мутантный ген; и
(11) подтверждают присутствие мутации анализом последовательности ДНК.

Аминокислотное замещение, необходимое для придания гербицидной устойчивости, также можно получить замещением нуклеотидной последовательности гена АЛС растений, который кодирует последовательность аминокислот, на другую нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислоты, содержащие желаемое замещение.

Получение гербицидустойчивых растений
Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть использованы для введения гербицидной устойчивости в растения. С целью интродуцирования фрагмента нуклеиновых кислот, который включает ген, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, в различные растения, используют большое разнообразие методик в зависимости от желаемого вида или культурного сорта. Вообще, эксплантаты или протопласты могут быть взяты или получены из растений, выращенных как in vitro, так и в почве. Эксплантаты или протопласты могут быть получены из семядолей, стеблей, черешков, листьев, корней, незрелых зародышей, гипокотилий, соцветий и т.д. В теории любая ткань, которой можно манипулировать in vitro с образованием нового каллюса или организованного тканевого роста, может быть использована для генетический трансформации.

Для достижения трансформации эксплантаты или протопласты могут совместно культивироваться с Agrobacterium, которую можно индуцировать для переноса фрагментов нуклеиновых кислот, расположенных между границами T-ДНК плазмиды Ti, в растительные клетки. Другой способ, менее встречающийся на практике, представляет собой прямое поглощение ДНК растительными протопластами. При данном способе использованием Agrobacterium пренебрегают, и ДНК вводится непосредственно протопластами при соответствующих условиях.

В примерах целый ряд эксплантатов из различных растений культивируют совместно с Agrobacterium с тем, чтобы получить трансформацию в гербицидную устойчивость. Эти эксплантаты культивируют так, чтобы позволить расти каллюсу. Затем каллюс сразу исследуют на устойчивость к сульфонилмочевинам, или растения регенерируют, а затем исследуют на устойчивость к сульфонилмочевинам. Исследование представляет собой ферментативный анализ экстрактов растительных клеток на наличие активности АЛС, устойчивой к гербициду, и/или рост растительных клеток в культуре или целых растений в присутствии обычных ингибирующих концентраций гербицида.

Фрагменты ДНК состоят из области, кодирующей синтез гербицидустойчивой АЛС, и области, предназначенной для экспрессии кодирующей последовательности в растениях. Фрагмент ДНК (8,3 кб), приведенный на фиг. 2, который кодирует белок гербицидустойчивой АЛС, показанный на фиг. 4, состоит из приблизительно 800 п.н. в 5' направлении (вверх по ходу) кодирующей области, достаточной для экспрессии белка в растениях. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего до 2000 ppb в трансформированных каллюсах табака. Растения, регенерированные из трансформированных клеток, также проявляют устойчивость на уровне целого растения. Фрагмент ДНК размером 6,3 кб, приведенный на фиг. 3, который кодирует белок гербицидустойчивой АЛС, показанный на фиг. 5, содержит 2,5 кб в 5' направлении (вверх по ходу) и 1,8 кб в 3'-направлении (вниз по ходу) кодирующей области, достаточной для экспрессии белка в растениях. Этот фрагмент может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего 2 ppb в трансформированных каллюсах табака.

В работе, которая продолжается, фрагменты ДНК, содержащие сайт-направленные мутации в гене SURA, который, как ожидают, кодирует гербицидустойчивую АЛС, были выполнены заявителем. Эти мутации приводят к получению следующих аминокислотных замещений: Ala 122 в Ser, который, как известно, операбелен в изозиме II АЛС E. coli и дрожжевой АЛС, Ala 122 в Val, который, как известно, операбелен в изозиме II АЛС E. coli и дрожжевой АЛС, Ala 122 в Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС; Pro 197 в Ser, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в ферменте АЛС II E. coli. Pro 197 в Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака; Lys 256 в Glu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС; Asp 384 в Val, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС; и Trp 591 в Leu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака. Путем объединения вышеприведенных мутаций также были выполнены двойные мутации, приводящие к получению двух аминокислотных замещений, таких как Ala 122 в Ser и Pro 197 в Ser, или Ala 122 в Ser, и Pro 197 в Ala, или Pro 197 в Ala и Trp 591 в Leu, или Pro 197 в Ser и Trp 591 в Leu. Эти мутации были выполнены во фрагменте ДНК, содержащем только около 180 п.н. в 5' направлении (вверх по ходу) и только около 600 п.н. в 3' направлении (вниз по ходу) последовательности, кодирующей АЛС. Эти фрагменты ДНК были интродуцированы в табак посредством трансформации. Гербицидная устойчивость не была экспрессирована в этих трансформациях. Выявлены регуляторные последовательности для экспрессии гербицидной устойчивости /область кодирующая мутант SURA-C3, а именно 2,5 кб в 5' направлении (вверх по ходу) и 1,8 кб в 3' направлении (вниз по ходу) кодирующей области/, которые обеспечивают экспрессию гербицидной устойчивости при наличии всех сайт-направленных мутаций в области, кодирующей SURA.

Сайт-направленные мутации, которые, как ожидают, кодируют гербицидустойчивую АЛС, были выполнены также в гене АЛС свеклы сахарной. Эти мутации приводят к получению следующих аминокислотных замещений: Ala 122 в Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 в Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака, Trp 591 в Leu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака, а также двойному мутанту Pro 197 в Ala и Trp 591 в Leu, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака.

Фрагмент нуклеиновых кислот настоящего изобретения может быть интродуцирован непосредственно в растения, либо в конструкцию нуклеиновых кислот, содержащую фрагмент желательной нуклеиновой кислоты. Конструкция нуклеиновых кислот может происходить от бактериальной плазмиды или фага, от плазмид Ti- или Ri-, от вируса растений или от автономно реплицирующейся последовательности. Один предпочтительный способ интродукции фрагмента нуклеиновых кислот в растительные клетки заключается в использовании Agrobacterium tumefaciens, содержащей фрагмент нуклеиновых кислот между границами Т-ДНК либо на бесплечевой Ti-плазмиде (то есть Ti-плазмиде, из которой делетированы гены для иммуногенности опухолевых клеток), либо в бинарном векторе in trans в Ti-плазмиду с Vir-функциями. Agrobacterium может быть использована для трансформации растений инокулированием тканевых эксплантатов, таких как стебли или листовые пластинки, или совместным культивированием с растительными протопластами. Другой предпочтительный способ интродуцирования фрагмента нуклеиновых кислот настоящего изобретения заключается в непосредственном введении фрагмента или вектора, содержащего фрагмент, в растительные протопласты или клетки с помощью или без помощи электропорации, полиэтиленгликоля или других агентов или способов, известных для изменения пропускающей способности мембраны.

Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть использованы для трансформации протопластов или культур клеток из широкого спектра видов высших растений для образования культур растительных тканей настоящего изобретения. Эти виды включают двудольные растения: табак, петунья, хлопчатник, подсолнечник, соя культурная, canola (рапсовое семя) и другие виды Brassica, и тополя. Ожидается, что все линии растительных клеток, имеющие протопластное происхождение, могут стабильно трансформироваться фрагментами настоящего изобретения.

Фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут также интродуцироваться в растительные клетки с последующим образованием трансформированных растений настоящего изобретения. Трансформация целых растений осуществляется в растениях, клетки которых могут быть трансформированы чужеродными генами на той стадии, на которой из них могут быть регенерированы целые растения. В соответствии с настоящим изобретением трансформируемыми растениями являются двудольные растения. Предпочтительно, если трансформируемые растения выбирают из группы, состоящей из табака, картофеля, томата настоящего, подсолнечника, свеклы сахарной, люцерны, латука или видов Brassica. Спектр сельскохозяйственных культур, в которые могут быть введены чужеродные гены, как ожидают, быстро увеличивается, поскольку тканевая культура и способы трансформации усовершенствуются, а селектируемые маркеры, такие как фрагменты настоящего изобретения (обсуждение см. ниже) становятся доступными.

Фрагменты нуклеиновой кислоты предлагаемого изобретения кодируют АЛС (ацетолактатсинтазу), которая устойчива относительно следующих гербицидов на основе сульфонилмочевины

где R означает H или CH3;
J означает

R1 представляет Cl, Br, NO2, C1- C4алкил, C2-C4алкенил, CF3, C1- C4алкокси, C1-C4галогеналкокси, C3- C4алкенилокси, C2-C4галогеналкенилокси, C3-C4алкинилокси, CO2R9, CONR10R11, S(O)mR12, OSO2R12, фенил, SO2N(-OCH3)CH3, SO2NR10R11


R2 представляет H, Cl, Br, F, CH3, NO2, SCH3, OCF2H, OCH2CF3 или OCH3;
R3 представляет Cl, NO2, CO2CH3, CO2C2H5, SO2N(CH3)2, SO2CH3 или SO2C2H5;
R4 означает C1-C3алкил, Cl, Br, NO2, CO2R9, CON(CH3)2, SO2N(CH3)2, SO2N(OCH3)CH3 или S(O)mR12;
R5 означает C1-C3алкил, C4-C5циклоалкилкарбонил, F, Cl, Br, NO2, CO2R14, SO2N(CH3)2, SO2R12 или фенил;
R6 представляет H, C1-C3алкил или CH2CH=CH2;
R7 означает H, CH3, OCH3, Cl или Br;
R8 означает H, F, Cl, Br, CH3, OCH3, CF3, SCH3 или OCF2H;
R9 означает C1-C4алкил, C3- CH4алкенил или CH2CH2Cl;
R10 означает H или C1-C3алкил;
R11 означает H или C1-C2алкил;
R12 означает C1-C3алкил;
R13 означает H или CH3;
R14 означает C1-C3алкил или CH2CH=CH2;
m равно 0, 1 или 2;
n равно 1 или 2;
Q означает CH2, CHCH3 или NR15;
R15 означает H или C1-C4алкил;
P представляет O или CH2;
R16 означает H или CH3;
R17 означает C(O)NR18R19;
R18 означает H или CH3;
R19 означает CH3;
R20 означает H, Cl, F, Br, CH3, CF3, OCH3 или OCF2H;
R21 означает H или CH3;
X означает CH3, OCH3, OC2H5 или NHCH3;
Y означает CH3, C2H5, OCH3, OC2H5, OCF2H, OCH2CF3, Cl, CH2OCH3 или циклопропил;
Z означает CH или N;
или их сельскохозяйственно-приемлемые соли;
при условии, что
а) когда Y означает Cl, Z представляет CH, а X означает OCH3;
б) когда Y означает OCF2H, Z представляет CH;
в) когда J означает J-1, а R1 представляет OSO2R12 или фенил, тогда Y не представляет OCF2H;
г) когда J означает J-2, тогда Y не представляет OCF2H или OCH2CF3; и
д) когда J означает J-3, а R4 представляет S(O)mR12, тогда Y не представляет OCH2CF3.

Сульфонилмочевинные гербициды, относительно которых АЛС особенно устойчива, включают:
1) Соединения формулы 1, где J означает J-1;
R1 представляет Cl, CH3, C1-C4алкокси, C1-C2галогеналкокси, аллилокси, пропаргилокси, CO2R9, CONR10R11, SO2N(OCH3)CH3, SO2NR10R11, S(O)mR12, OSO2R12, фенил или

2) Соединения формулы 1, где J означает J-2; R представляет H; а R3 означает SO2N(CH3)2, CO2CH3 или CO2C2H5;
3) Соединения формулы 1, где J означает J-3; R представляет H; а R4 означает CO2CH3 или CO2C2H5;
4) Соединения формулы 1, где J означает J-4; R представляет H; а R5 представляет Cl, Br, CO2CH3, CO2C2H5 или

R6 означает CH3 и R7 представляет H, Cl или OCH3;
5) Соединения формулы 1, где J означает J-5; R представляет H; R5 означает CO2CH3 или CO2C2H5; и R7 представляет H или CH3;
6) Соединения формулы 1, где J означает J-6; Q представляет CHCH3 или NR15; R означает H; и R8 представляет H, F, Cl, CH3, OCH3, CF3 или SCH3;
7) Соединения формулы 1, где J означает J-7; R представляет H; P означает O; и R8 представляет H, F, Cl, CH3; OCH3, CF3 или SCH3;
8) Соединения формулы 1, где J означает J-8; R означает H; R16 представляет CH3; и R8 означает H, F, Cl, OCH3, CH3, CF3 или SCH3;
9) Соединения формулы 1, где J означает J-9; R представляет H; и R17 означает C(O)N(CH3)2;
10) Соединения формулы 1, где R представляет H; R1 означает Cl, C1-C4алкокси, OCF2H, OCH2CH2Cl, CO2R9, CON(CN3)2, SO2N(CH3)2, SO2R12 или OSOC2RC12; и R12 представляет H, Cl, CH3 или OCH3.

Любое из вышеуказанных соединений можно использовать индивидуально или в комбинации с до- и/ или послевсходовом периоде. Вследствие того, что сельскохозяйственные культуры сами по себе устойчивы к действию гербицида(ов), спектр гербицидной активности можно подбирать на основе их эффективности в борьбе с нежелательной растительностью.

Настоящее изобретение дополнительно охарактеризовано в прилагаемых примерах, где все части и проценты приведены по массе, а градусы даны в градусах Цельсия, если не оговорено иное. Следует иметь ввиду, что указанные примеры при раскрытии предпочтительных вариантов осуществления изобретения даны только в виде иллюстрации. Исходя из вышеуказанного описания и представленных примеров специалист в данной отрасли знаний может установить существенные признаки предлагаемого изобретения и, чтобы приспособить его для различных применений и условий, может осуществить различные варианты и модификации в пределах сущности и его объема.

Пример 1
ДНК табака (Nicotiana tabacum вида Xanthi) от мутанта Hra получают по методике Dunsmuir и др. (J. Mol. App. Genetics, 1983, 2, 285). Табачные листья 2 x 13 г размером 5,08 см (2 дюйма) отщепляют от растений и сразу же разминают в 2 объемах по 20 мл буфера A (10 мМ Трицин-KOH pH 7,6 1,14 M сахароза 5 мМ MgCl2 5 мМ 2-меркаптоэтанол) в холодной комнате. Добавочно прибавляют 40 50 мл буфера A и полученную суспензию фильтруют через 16 слоев марли. Фильтрат центрифугируют в роторе Sorvall GSA при скорости 2500 об/мин и температуре 4oC в течение 5 мин. После центрифугирования осадок ресуспендируют в 10 мл буфера A, примешивают еще 100 мл буфера A и клетки центрифугируют при вышеуказанных условиях. Затем полученный после центрифугирования осадок (шарики) ресуспендируют в 100 мл буфера A в смеси с 0,4% раствором Тритона X-100, выдерживают на льду в течение 10 мин и центрифугируют, как указывалось ранее. Осадок после центрифугирования дважды промывают в последнем буферном растворе. Полученный конечный осадок ресуспендируют в 5 мл ресуспензионного буфера (50 мМ трис-HCl pH 8, 20 мМ ЭДТА), прибавляют 1 мл ресуспензионного буфера, содержащего 10% саркозила, а затем посредством ресуспензионного буфера объем доводят до 10 мл. Протеиназу K прибавляют до концентрации 100 мкг/мл до получения лизатов, и лизаты подвергают перевариванию при температуре 37oC в течение ночи. Затем лизаты доводят до плотности 1,55 г/мл CsCl и до конечной концентрации 300 мкг/мл бромида этидиума. Растворы центрифугируют в роторе Beckman Ti 70.1 при скорости 40000 об/мин и температуре 15oC в течение 24 ч и полосу флуоресцентной ДНК снимают после визуализации длинноволновым УФ-излучением. Для снятия ДНК в боковых сторонах трубок полиалломера прокалывают отверстия иглой 18 калибра, что дает возможность вязкой ДНК скапывать в трубку для сбора материала. Для предотвращения среза ДНК на всех стадиях после лизиса клеток соблюдают большую осторожность. ДНК вновь ресуспендируют в мягких условиях в растворе CsCl с плотностью 1,55 г/мл и бромида этидиума с концентрацией 300 мкг/мл, а затем центрифугируют в роторе Sorvall TFT 65.13 при скорости 40000 об/мин и температуре 15oC в течение 48 ч. Затем ДНК вновь собирают через боковой прокол трубки-сборника. Затем ее экстрагируют 10 раз в мягких условиях посредством TE-буфера (10 мМ трис-HCl pH 8, 1 мМ ЭДТА), насыщенного изоамиловым спиртом, а затем экстенсивно диализуют против TE-буфера.

Стандартные методики получения рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, используемые в данном описании, описаны R.W. Davis, D. Botstein и J. R. Roth, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1980; и T. Maniatis, E.F. Fritsch и Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

Библиотеку ДНК табака конструируют по методике, предложенной T. Maniatis и др. (см. выше). ДНК табака переваривается рестрикционным ферментом Sau 3A с образованием большинства фрагментов, как определено электрофорезом в агарозном геле, протяженностью в интервале 20 кб (т.п.о). Полученные фрагменты нагружают на градиенты 10 40% сахарозы (в 1 М NaCl, 20 мМ Трис pH 8,1 мМ ЭДТА) и фракционируют по размерам центрифугированием в роторе Beckman SW 28 при скорости 26000 об/мин и температуре 17oC в течение 16 ч. Фракции, образованные от градиентов концентрации сахарозы, собирают и анализируют электрофорезом в агаровом геле, при этом фракции, содержащие фрагменты размером 20 к.б. (20 т.п.о.), диализируют против TE-буфера и осаждают этанолом. Затем указанные фракции лигируют с плечами EMBL 3 фага лямбда на BamH I-срезе при молярном соотношении 2 1 и упаковывают в головки фага лямбда, следуя инструкциям изготовителя по плечам генома лямбда и реакциям упаковки (ДНК) (Stratagene Cloning Systems, Сан Диего, Са).

Библиотеку ДНК табака, содержащую 400000 фагов, высевают на чашки со штаммом-хозяина E. coli LE 392 (Salhavy T.J. Berman M.L. и Enquist L.W. 1984, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк) при плотности 50000 фагов на 150 мм чашку Петри с распределением на 10 чашках. Перенос из бляшек фага на сдвоенные нитроцеллюлозные фильтры проводят по методике Maniatis и др. и затем гибридизируют 32P-меченными зондами, несущими либо 5', либо 3' фрагменты гена АЛС, полученных в системе мечения рибозондов. Рибозонды синтезируют по методикам с прилагаемым к ним комплектом рибопроб, поставляемым Promega Biotech (Madison WI). Бляшки, дающие положительные сигналы на пленках из обоих комплектов фильтров, собирают и очистку повторяют многократно до тех пор, пока не получат хорошо изолированные гибридизирующиеся бляшки. Минипродукты ДНК из очищенного фага анализируют перевариваниями рестрикционным ферментом. Как показано на фиг.1, выделено два класса вставок фрагментов клонированной ДНК табака. Фаги 1, 2, 17 и 18 содержат вставки, родственные с ранее выделенным геном АЛС из локуса SURA, кодирующего чувствительную к гербициду АЛС. Фаг 3 содержит вставку, отличающуюся от вышеуказанной, как предполагают, которая содержит ген SURB-Hra, кодирующий АЛС, устойчивую к гербициду. Фрагменты EcoR I, которые окружают области гибридизации фага 3, субклонируют в фаговые векторы M13 и проводят анализ последовательности ДНК, используя олигонуклеотиды для расширения секвенированных областей в перекрывающихся сегментах. Выявлена единственная открытая рамка считывания из 1992 нуклеотидов, которая идентифицирована как ген АЛС при сравнении выведенной аминокислотной последовательности с консервативными областями аминокислотных последовательностей АЛС белков из других видов.

АЛС-гены, изолированные из гербицидустойчивого мутантного табака, Hra, вводят в чувствительные клетки табака через систему "бинарный вектор", используя Agrobacterium tumefaciens. Гены АЛС первоначально вводят в бинарный вектор в A. tumefaciens через конъюгацию плазмиды и затем используют сконструированную A. tumefaciens для трансформации растительных клеток чужеродными генами через совместное культивирование.

A) Интродукция изолированных генов АЛС табака в A. tumefaciens
i) Конструирование бинарных векторов: Стандартные методы получения рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, которые применяют в данном изобретении, описаны R.W. Davis, D. Botstein и J.R. Roth, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1980 и T. Maniatis, E.F. Fritsch и Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1982. Очищенный фрагмент нуклеиновых кислот Spe I размером 8,3 кб предлагаемого изобретения, изолированного из мутанта табака Hra и содержащего кодирующую последовательность для гербицидустойчивой формы гена АЛС, вставляют в сайт Xba I плазмидного вектора pMuc19 (J.D.G. Jones, P. Dunsmiur и J. Bedbrook, EMBO Journal 4: 2411 2418, 1985). (Хотя рестрикционные ферменты Spe I и Xba I распознают отличающиеся ДНК-последовательности, продукты этих перевариваний несут аналогичную 5' выступающую последовательность). Ориентация фрагмента вставки в одной из целевых плазмид, т.е. pAGS148, определяют рестрикционно-ферментным анализом (фиг. 2).

Бинарный вектор pAGS135 используют для переноса плазмиды pAGS148 в A. tumefaciens. Плазмида pAGS135 образована из плазмиды pAGS112 (P. Van den Elzen, K. Y. Lee, J. Townsend и J. Bedbrook, Plant Mol. Biol. 5: 149 154, 1985) в результате переваривания ДНК плазмиды pAGS112 эндонуклеазой рестрикции Xho I, обработки фрагментом Кленова, в присутствии из ДНК-полимеразы I E. coli, и самолигирования ДНК, что обеспечивает отщепление сайта Xho I снаружи правого края T-ДНК. Плазмиду pAGS112 получают из вектора широкого круга хозяев pLAFR (A.M. Friedman, S.R. Long, S.E. Brown, S.E. Buikema и F. M. Ausubel, Gene, 18: 289 296, 1982) путем вставки в плазмиду в уникальный для клонирования сайт BamH I фрагмента Eco R I, границы T-ДНК которого фланкируют ген для экспрессии устойчивости к канамицину в растениях (Van den Elzen и др. Plant Mol. Biol. 5: 149 154, 1985). Очищенные посредством CsCI плазмиды pAGS148 и pAGS135 переваривают эндонуклеазой рестрикции BamH I и образующиеся BamH I-расщепленные плазмиды лигируют. Лигированные смеси упаковывают в частицы фага лямбда in vitro и используют для заражения штамма HB 101 Escherichia coli. Трансформанты отбирают по ампициллину. Физическую карту (фиг. 2) рекомбинантной плазмиды pAGS 152, полученную от одного из трансформантов, определяют рестрикционным анализом.

ii) Перенос плазмиды pAGS152 из E. coli в A. tumefaciens осуществляют методом трехродительского скрещивания, описанным Ruvkun, G. и Ausubel, F.M. Nature. 289: 85 88, 1981. Штамм E. coli HB 101, несущий плазмиду pAGS152 и штамм E. coli HB101, несущий мобилизирующий вектор pRK2013 (ATCC 37159) (D. Figurski и D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 1648 1652, 1979) смешивают со штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим плазмиду pAL4404 (A. Hoekema, P.R. Hirsch, P.J.J. Hooykaas и R.A. Schilperoort, Nature, 303: 179 180, 1983) и подвергают скрещиванию на твердой LB-среде (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Sprinmg Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1972) при температуре 28oC в течение 16 ч. Трансконъюгаты подвергают селекции на пластинах, содержащих рифамицин при концентрации 100 мг/л и тетрациклин при 1 мг/л. A. tumefaciens LBA4404: pAGS152 помещают на минимальную A-среду, содержащую тетрациклин при концентрации 1 мг/л.

Аналогичный метод используют для получения как штамма A. tumefaciens LBA 4404, содержащего плазмиду pAGS112, бинарного вектора без вставки какого-либо фрагмента нуклеиновых кислот растения, и штамма A. tumefaciens LBA4404, содержащего плазмиду pAGS145, бинарного вектора с любым фрагментом нуклеиновых кислот от фагового клона 1. Последний фрагмент изолируют из Hra мутантных растений табака, он несет ген для экспрессии гербицидчувствительной формы АЛС; этот ген не является аллелем дикого типа гена для экспрессии гербицидустойчивой АЛС, однако представляет ген SURA из второго генетического локуса.

Б) Интродукция изолированных АЛС генов в чувствительные клетки табака посредством совместного культивирования клеток растения штамма A. tumefaciens LBA4404 (pAGS145) и штамма LBA4404 (pAGS152).

Все манипуляции с растительным материалом на стерильных средах проводят в камерах с ламинарным потоком в условиях приемлемой контаминации. Рост растений и культивирование растительных клеток осуществляют при температуре 27oC. Все манипуляции на протопластах осуществляют, если не оговорено особо, при комнатной температуре.

1 день (после полудня)
Среду для изоляции протопластов приготавливают при добавлении следующих компонентов к K 3/S(1) среде: 0,1% (масс/об) MES буфере фирмы Sigma Chemical Co. 1% (масс/об) целлюлозы фирмы Onozuka or Cellulysin, и 0,1% мацеразы фирмы Onozuka. После осторожного перемешивания примерно в течение 30 мин pH доводят до 5,6 с помощью KOH и полученную среду стерилизуют на фильтрах.

Стерильные растения табака (Nicotiana tabacum сорта Висконсин-38) культивируют из 1 см апикальных или вспомогательных эксплантатов при цикле из 16-часового светлого периода (6,000 8,000 люкс) с последующим 8-часовым темным периодом. Когда растения достигнут 5 7-недельного возраста, отщепляют полностью распустившиеся листья (3 6 листьев снизу от верхушки), и каждые два листа помещают верхней поверхностью вниз на 20 мл среды для изоляции протопласта, содержащейся в чашке Петри размером 100 x 25 мм. Затем листья погружают в среду и мелко измельчают острым хирургическим скальпелем. Среднюю жилку листа фиксируют и делают надрезы наружу от нее в направлении к краю листа с промежутками примерно 2 мм. После этого чашки Петри герметизируют парапленкой и мацерированную ткань инкубируют с вечера и всю ночь (14 17 ч) в темноте при температуре 27 29oC при осторожном встряхивании в гираторе (20 25 об/мин).

2 день (утро)
75-мм воронку для фильтрования, заполненную 4 слоями марли, закрепленную в кольцевидном держателе. Стеклянную пробирку (примерно длиной 15 см и внешним диаметром < 5 мм) прикрепляют к воронке с системой трубок из латекса. Используемые воронку, марлю, систему трубок и пробирок из стекла и латекса заворачивают в алюминиевую фольгу и стерилизуют в автоклаве в виде единого целого.

Систему стеклянных пробирок помещают в колбу Бабкока, а марлю пропитывают средой K 3/S(1). Дигерированную ткань листа с двух чашек Петри осторожно выливают в воронку. Марлю промывают и вживают в указанную колбу. Заполненные колбы доверху заливают средой K 3/S(1), покрывают фольгой и центрифугируют примерно при 100g в течение 10 мин. Плавающие протопласты (1 2 мл) собирают серологической пипеткой (1 мл) и помещают в 20 мл среды K3/S(1), содержащейся в другой колбе Бабкока. После ресуспендирования протопластов в результате осторожного перемешивания колбы Бабкока заполняют доверху и центрифугируют, как указывалось ранее. Флотирующие протопласты (1 2 мл) собирают по методу, описанному выше, и помещают в 30 мл среды K3/G(1). Указанные протопласты подсчитывают в гемацитомере, а полученный объем регулируют для получения 110+5 протопластов на мл. 5 мл аликвот протопластов высевают в чашки Петри [чашки Петри для культивирования ткани размером 100 x 20 мм (Corning); данные чашки используют во всех последующих манипуляциях с протопластами] и выращивают в темноте.

2 день (после полудня).

Единичную колонию клеток A. tumefaciens, содержащую вектор трансформации требуемого растения, например pAGS112 (вышеуказанный плазмидный вектор), pAGS152 (содержащая фрагмент нуклеиновых кислот предлагаемого изобретения) или pAGS145 (содержащая любую нуклеиновую кислоту, кодирующую чувствительную форму АЛС), выращиваемую на минимальной A-пластине, инокулируют в 5 мл минимальной A-среды в 18-мм тестируемой пробирке и выращивают в течение вечера и ночи в роликовом барабане при скорости 40 60 об/мин и температуре 27 28oC.

3 день (утро).

Оптическую плотность культур A. tumefaciens измеряют при 550 нм и доводят до 0,15 с помощью минимальной A-среды, и бактерии продолжают выращивать, как указано выше.

3 день (после полудня).

Когда оптическая плотность (при 550 нм) культур A. tumefaciens составляет 0,6 (логарифмическая фаза роста), примерно через 6 ч после разбавления, указанные бактерии вносят в клетки растения при титре примерно 50 бактерий/клетку растения (оптическая плотность порядка 1,0 при 550 нм 1,4109 бактерий). Полученную смесь бактерий и растительных клеток совместно культивируют в течение 66 ч при температуре 24oC при слабом освещении (примерно 500 люкс). Нетрансформированные протопласты-контроли инкубируют аналогичным образом, но без использования агробактерий. Для каждого совместного культивирования проводят последующее протоколирование (для клеток, трансформированных различными агробактериями, а также для нетрансформированных клеток).

6 день (утро).

Совместное культивирование прерывают путем прибавления 20 мл смеси в соотношении 1 1, состоящей из среды K3/G(2) и среды С, дополненной 500 мг/л цефотаксима (для отбора против агробактерий) к 5 мл смеси для сокультивирования. Совместно выращенные клетки осторожно и тщательно ресуспендируют в новой среде путем смешивания 5 или 10 мл серологической пипеткой. Плотность клеток составляет 2104 протопластных эквивалентов/мл (протопластные эквиваленты исходным протопластам, допуская 100% извлечение и выживаемость клеток), а осмолярность составляет 0,35 М. 3 порции 5 мл аликвот из каждой культуры распределяют в свежих чашках Петри.

С этого момента, до тех пор пока культивируемые клетки не внедрятся в твердую среду, они растут при слабом освещении (500 1500 люкс) без движения и их переносят без соблюдения септики в различные среды. С определенного времени клетки с одной чашки каждой культуры переносят в неселективную среду, в то время как клетки с других двух чашек из каждой культуры переносят в селективную среду, содержащую либо 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона для отбора трансформированных растительных клеток. Во время этих переносов клеток содержимое из каждой чашки собирают с помощью серологической пипетки, помещают в раздельные полистирольные трубки конической центрифуги и центрифугируют примерно при 50g в течение 5 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой, не разрушая рыхлых гранул. Полученные гранулы из совместно культивируемых клеток с каждой из чашек затем осторожно суспендируют в соответствующей свежей среде.

10 день.

Клетки переносят в 5 мл среду C, которая дополнена в случае неселектируемых растительных клеток 500 мг/л цефотаксима или в случае селектируемых клеток 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона. Каждую из указанных культур возвращают в чашки Петри, из которых они были взяты.

13 день.

Неселектируемые клетки переносят в 20 мл смеси с соотношением 3 1, состоящей из среды C и MSP-среды с добавкой 500 мг/л цефотаксима и 5 мл аликвота распределяют в свежей чашке Петри (при плотности 5103 протопластных эквивалентов/мл). Селектируемые клетки ресуспендируют в 5 мл смеси (3 1), состоящей из среды C и MSP-среды, дополненной 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона и возвращают на первоначальные чашки для последующего роста.

16 17 день.

Клетки переносят в 5 мл смеси в соотношении 1 1, состоящей из среды C и MSP-среды, дополненной 500 мг/л цефотаксима (в случае неселектируемых клеток растений) или 500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона (в случае селектируемых клеток) и выращивают, как описано выше.

20 день.

Неселектируемые клетки переносят в 25 мл смеси (1 1), состоящей из среды С и MSP-среды, и затем полученную смесь прибавляют к 25 мл смеси в соотношении 1 1, состоящей из 2 объемов среды MSP и 1% (мас./об) раствора агарозы типа VII (температура 50oC). Полученную культуру быстро перемешивают с 25 мл серологической пипеткой с широким отверстием и распределяют в 5 мл аликвот на свежие чашки Петри. Суспендированные микрокаллюсы в агаровом растворе осторожно и равномерно распределяют поперек чашек взбалтыванием вручную. Чашки нагревают и оставляют на час под колпаком для затвердевания перед тем, как их обернут в парапленку и перенесут в вегетационную камеру. Плотность клеток составляет примерно 5102 протопластных эквивалентов/мл, а осмолярность составляет 0,15 М. Внедрившиеся клетки подсчитывают примерно через 10 дней счетчиком для подсчета колоний (см. табл. 1 и 2).

Селектируемые клетки переносят в 20 мл смеси в соотношении 1 3, состоящей из среды C и MSP-среды, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл аликвот ресуспендированных культур (510+3 протопластных эквивалентов/мл) распределяют по 4 чашкам Петри на селектируемую культуру и выращивают, как указано выше.

23 24 дни.

Каждые 5 мл культуры селектируемых клеток разводят 7,5 мл среды MSP, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона для получения плотности клеток 210+3 протопластных эквивалентов/мл. Эту культуру с установленной плотностью смешивают с 12,5 мл смеси в соотношении 1 1, состоящей из 2 объемов MSP-среды и 1% (масс/об) раствора агарозы типа VII (температура 50oC), дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл аликвот перемешанных культур быстро переносят посредством 25 мл широкогорлой серологической пипетки на свежие чашки Петри. Конечная плотность посева составляет 1103 протопластных эквивалентов/мл, а осмолярность культуры составляет 0,1 М. Чашки отверждают, как описано выше. Внедрившиеся клетки считают для роста примерно через 10 дней счетчиком для подсчета колоний.

25 день.

От 10 до 12 индивидуальных трансформированных каллюсов/колоний собирают и переносят скальпелем N II в чашку Петри, содержащую MSP-среду с использованием или без использования соответствующего селективного агента для регенерации растений. Каллюсы выращивают при температуре 27oC с фотопериодом в 16 световых часов (5000 8000 люкс) с последующими 8 ч темноты. Побеги появляются спустя 2 3 недели и продолжают свое развитие в течение нескольких месяцев. Ростки длиной 5 мм срезают острым хирургическим скальпелем и переносят для укоренения в OMS-среду в ящики Магента. После образования корневой системы (от 1 до 4 недель) растения переносят в почву для регенерации по методу, описанному R. S. Chaleff и M. F. Parsons, Proc. Natl. Sci. USA, 75: 5104 (1978) и B. Tisserat, Plant Cell Culture: A Practical Approach. Ed. Dixon, R.A. IRL Press, Оксфорд, 1985.

Результаты совместного культивирования.

Полученные результаты экспериментов по совместному культивированию показывают, что фрагмент нуклеиновых кислот предлагаемого изобретения, кроме гена SURA табака, экспрессирующего гербицидчувствительные формы АЛС, придает растениям устойчивость к гербициду, когда включается в гербицидчувствительные клетки табака (см. табл. 4 и 5, представленные ниже). Поскольку фрагмент нуклеиновых кислот предлагаемого изобретения может придавать резистентность к гербициду независимо от ориентации в векторе, он, как считают, содержит регулярные последовательности обоих 5' и 3' концов кодирующей последовательности, которая необходима для экспрессии гербицидустойчивого АЛС гена.

Уровень резистентности к гербициду, создаваемый фрагментом нуклеиновых кислот предлагаемого изобретения, определяют путем посева 100 колоний каждых клеток N. tabacum трансформированных pAGS152, устойчивых к хлорсульфурону, при концентрации 2 ч. на биллион и несовместно-культивируемых клеток дикого типа N. tabacum при различных концентрациях хлорсульфурона. Через 1 месяц подсчитывают количество активно растущих колоний при различных концентрациях хлорсульфурона (см. табл. 6). В то время как колонии дикого типа чувствительны к хлорсульфурону при концентрации 2 ч. на биллион, колонии, образованные из совместного культивирования A. tumefaciens с плазмидой pAGS152, могут выдерживать концентрацию до 2000 ppb. Указанный уровень резистентности полученных трансформантов сравнивают с уровнем Hra гербицидустойчивого мутантного табака, из которого фрагмент нуклеиновых кислот предлагаемого изобретения изолирован, причем он примерно в 10 раз выше уровня S4 гербицидустойчивого мутантного табака (родитель Hra).

Для отверждения среды: агар для автоклавирования (15 гм/л) фирмы Difco Bacto в раздельном 500 мл объеме. Перед посевом соли и агар смешивают.

Вспомогательное оборудование, химикаты и среды.

MES-буфер 2-(N-морфолино)этансульфокислота Sigma N.M-8250
Агароза типа VII с низкой температурой застудневания (удерживается в расплавленном состоянии при температуре 50oC) Sigma N.A-4018
ЦеллулизинTM Calbiochem 219466
МацеразаTM Calbiochem 441201
Цефотаксим, натриевая соль разбавлен м/г.д. стерильная H2O хранят при 5oC, в темноте, < 10 дней в качестве базового компонента 50 мг/мл - Calbiochem 219380
Сульфат канамицина разбавлен м/г.д. стерильная H2O, хранят при -20oC, в темноте, в качестве базового компонента при концентрации 50 мг/мл - Sigma N. K-4000
Хлорсульфурон E. I.du Pont de Nemour and Company, Wilmington, Delaware 19898
Чашки Петри для тканевой культуры размером 100мм x 20 мм Corning 25020
Колба Бабкока Kimble
Центрифуга (сходная с колбой Бабкока) Damon/IEC Division HN-SII
Ящики Магента 7,63 x 10,16 см Magenta Corp. 4149 W. Montrose Ave Chicago, IL 68641
Т.С.агар KC Biological CR-100
Пример II.

Получают ДНК табака из мутанта C3 и конструируют, как описано в примере I, геномную библиотеку ДНК на бактериофаговом векторе EMBL3. Фаг, несущий гены АЛС, идентифицируют, как описано в примере I, посредством гибридизации с 32P-меченым 5' зондом фрагмента гена АЛС табака.

Изолируют шесть независимых рекомбинантных фагов с помощью скрининга 600000 рекомбинантов из библиотеки C3. Анализ рестрикционными нуклеазами этих изолированных фагов показывает, что ДНК-вставки из 3 фагов совпадают с геном SURA из библиотеки Hra (фаги 35, 36, 38). Оставшиеся 3 фага (фаги 31, 34 и 37) содержат ДНК-вставки, соответствующие гену SURB. Как полагают, ген АЛС, переносимый из фагов 35, 36 и 38, должен представлять собой ген SURA-C3. кодирующий гербицидустойчивую АЛС, а ген АЛС, переносимый из фагов 31, 34 и 37, должен представлять собой ген SURB. кодирующий гербицидчувствительную АЛС.

Фрагменты ДНК из фагов 31, 35 и 38 субклонируют в плазмиду pUC119, а затем в бинарный вектор плазмиды pAGS135, как описано в примере I. Фрагмент эндонуклеазы рестрикции Spe I размером примерно 8,3 кб из фага 31 аналогичен фрагменту, содержащемуся в pAGS148 (Фиг. 2), несущему ген SURB, который кодирует гербицидчувствительную АЛС. Субклонируют этот фрагмент в обеих возможных ориентациях в указанный вектор. Фрагмент эндонуклеазы рестрикции Spe I Sal I размером примерно 6,3 кб из фага 38 субклонируют с получением pALS35 (ATCC N 67424) и pALS38 соответственно. Указанные фрагменты включают в 5' направлении (восходящем) АЛС-кодирующую область продолжительностью 2,5 кб, АЛС-кодирующую последовательность размером 2,0 кб, кодирующие гербицидустойчивый фермент 1,8 и 3,3 кб соответственно в 3' направлении (нисходящем) от указанной АЛС-кодирующей области. Последние два субклонированных фрагмента содержат сайт для эндонуклеазы рестрикции BamH I. Частичные переваривания BamH I или pALS35 и pALS38 используют для вставки указанных плазмид в сайт BamH I бинарного вектора pAGS135. Гены АЛС в бинарном векторе, обозначенные p312, p313, p351 и p381 (табл. 14) переносят в a. tumefaciens путем тройного родительского скрещивания, как описано в примере I.

Интродукцию генов АЛС в гербицидчувствительные клетки табака путем совместного культивирования клеток растения с A. tumefaciens, несущим гены АЛС в бинарном векторе, проводят по методу, описанному в примере I. Полученные результаты экспериментов по совместному культивированию представлены в табл. 14. Как ожидалось, ген АЛС, изолированный из фага 31, это ген SURB, кодирующий гербицидчувствительную АЛС, который не дает никаких гербицидустойчивых клеток растения. Ген АЛС, выделенный в фаги 35 и 38, это ген SURA-C3, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, действительно придает клеткам растения устойчивость к гербициду. Гербицидустойчивые клетки растения образуются при более низкой частоте, чем клетки растения, устойчивые к канамицину, причем при более низкой частоте, чем наблюдается в случае, когда используют ген SURB-Hra. Это может быть объяснено либо меньшей резистентностью к гербициду АЛС-фермента, кодированного геном SURA-C3 по сравнению с АЛС, кодированной геном SURB-Hra, либо низкой экспрессией гена SURA-C3 по сравнению с геном SURB-Hra, либо и тем, и другим.

Нижеследующие примеры иллюстрируют данное изобретение с использованием методик и исходных компонентов, полученных и указанных выше.

Пример III.

Мутации осуществляют в гене SURA дикого типа табака in vitro, чтобы он мог кодировать гербицидустойчивую АЛС. Фрагменты из эндонуклеазы рестрикции, содержащие часть гена SURA, субклонируют в фаговые векторы M13 или плазмидные векторы, содержащие начало репликации M13, для получения однонитевой ДНК. Специфический фрагмент ДНК, который субклонирован, зависит от области, подвергаемой мутагенезу in vitro и наличия сайтов эндонуклеазы рестрикции.

Синтезируют олигонуклеотиды длиной 16 17 оснований, которые имеют неправильные кодоны для единственного основания. Эти неправильные кодоны предназначены для превращения аминокислотных кодонов, обнаруженных в гене АЛС дикого типа, в кодоны генов АЛС, которые кодируют АЛС-ферменты, устойчивые к сульфономочевинным гербицидам. Указанные олигонуклеотиды содержат фрагменты
5' GTTCAATTGGAGGATC 3' для замены trp 591 на leu
5' GTCAAGTGGCACGTAGG 3' для замены pro 197 на ala
5' GTCAAGTGTCACGTAGG 3' для замены pro 197 на ser
5' ATGTACCTGAGGATATT 3' для замены lys 256 на glu
5' GAGGTTTGTTGATAGAG 3' для замены asp 384 на val
5' AGGTTTGAGGATAGAGT 3' для замены asp 384 на glu
5' TACTGATGATTTTCAGG 3' для замены ala 205 на asp
5' CAGGTGGCCCTTCCATG 3' для замены ala 122 на pro.

Указанные нуклеотиды гибридизируют с однонитевой ДНК и используют в качестве праймера для синтеза комплементарной нити в реакции, катализируемой фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1, следуя методике Carter и др. (см. Oligonucleotide site-directed mutagenesis in M13, Anglian Biotechnology Limited, England, 1985). Полученную ДНК трансформируют в компетентные клетки E. coli mutL (Kramer и др. 1984, Cell, 38, 879). Отдельные бляшки или колонии очищают в зависимости от того, использованы ли фаговые векторы M13 (M13mp 18/19) или плазмидные векторы с началом репликации фага M13. Минипродукты однонитевой ДНК получают и используют в реакциях секвенирования ДНК для идентифицирования клонов, которые несут мутированные основания.

Эти сконструированные in vitro сайт-специфические мутации можно включать индивидуально или в комбинации в ген SURA дикого типа, который содержит 5' и 3' концевые регуляторные последовательности, необходимые для обеспечения экспрессии гена в растительных клетках (см. пример II). Такую замену получают путем встраивания фрагментов, несущих мутации, в любую плазмиду, содержащую ген SURA, из которого удален аналогичный фрагмент. Выбор для замены рестрикционного фрагмента зависит от положения мутации в гене и наличия сайтов эндонуклеазы рестрикции. Интродукция мутированных генов SURA в клетки растения далее осуществляется по методу, описанному в примерах I и II. Любой из фрагментов ДНК, содержащий мутации, которые приводят к получению гербицидустойчивой АЛС, как раскрыто в данном описании изобретения, можно получить, главным образом, по указанному методу. Кроме того, нет необходимости осуществлять мутации только в гене SURA. Аналогичные мутации можно осуществлять в гене SURB или в любом другом гене растения, кодирующем АЛС, для которого доступна информация о ДНК последовательностях.

Пример IV.

ДНК получают из Beta vulgaris вида Sennika (сахарная свекла), а геномную библиотеку ДНК в векторе EMBL3 фага лямбда конструируют, как описано в примере I. Рекомбинантные фаги (300000) подвергают скриннингу путем гибридизации с 32P-меченным на 5'-конце зондом фрагмента гена АЛС табака, как описано в примере I. Фильтры промывают при температуре 42oC (0.1XSSC) и выделяют 20 индивидуальных клонов. На второй стадии очистки рекомбинантный фаг гибридизируют с обоими зондами 3' и 5' конца гена АЛС табака. Фильтры, содержащие фаги, которые гибридизованы с 5'-концом зонда промывают при температуре 55oC. Только один клон, 21, гибридизуется с 5' и 3' концами зонда. После промывки при температуре 55oC этот фаг остается гибридизованным. Препараты минилизатов ДНК получают из 20 клонов и переваривают с помощью EcoR I и Nco I. Различные изоляты содержат разные формы сайтов рестрикции, причем опять только v21 гибридизуется с обоими зондами и остается гибридизованным после промывки при температуре 55oC. Один фаг, а именно v41, также содержит полосу гибридизации, которая остается после промывки при температуре 55oC, тем не менее он не гибридизируется с 3' концом зонда. На фиг. 8 показана карта сайтов рестрикции фага v21 вместе с субклонами, которые сконструированы из него. Путем гибридизации с 5' и 3' концами зондов из гена N. tabacum выяснено, что АЛС-кодирующая область локализована на фрагменте BamH I Hind III размером 3,0 кб. Обе нити ДНК этого фрагмента секвенируют. Фрагмент BamH I Hind III субклонируют в pUC119 или Bluescript векторы; затем осуществляют делеции экзонуклеазой III или Bal 31. Используют метод дидеоксисеквенирования. Сравнительный анализ выведенной аминокислотной последовательности, кодируемой геном сахарной свеклы с этой же последовательностью гена (генов) табака, показывает отсутствие гомологии в первых 88 аминокислотах предполагаемого белка (см. фиг. 9). Указанная область может представлять собой белок перехода в хлоропласт. Согласно этому, гомология составляет примерно 90% при вставке 4 аминокислот вокруг остатка 290 АЛС табака. Проверка аминокислотных остатков, которые позволяют получить гербицидустойчивость в табаке и дрожжах, показывает, что указанные остатки, кроме того, являются консервативными в АЛС сахарной свеклы. Полученные данные позволяют непосредственно подойти к конструированию гена, кодирующего гербицидустойчивый АЛС-фермент сахарной свеклы посредством сайт-направленного мутагенеза, как описано в примере III.

Три сайта подвергают мутагенезу в указанном гене сахарной свеклы. Кодон GCA для Ala в положении 122 (обозначение аминокислотных остатков из фиг. 6, 7) заменяют на CCA для Pro, кодон CCA для pro в положении 197 заменяют на GCA для Ala и кодон для TGG для Trp в положении 591 заменяют на TTG для Leu. Двойные мутации, изменяющие Pro на Ala в положении 197 и Trp на Leu в положении 591, которые имеют сходное действие с геном SURB-Hra табака, также проводят путем комбинирования двукратных мутаций.

Для трансформации растений посредством сконструированных in vitro указанных мутаций в гене АЛС сахарной свеклы в плазмидный вектор pUC 119 клонируют фрагменты ДНК, содержащие мутации и расположенные от сайга BamH I размером примерно 910 п.о. в 5' концевом направлении (восходящем) области кодирования до сайта Pst I размером примерно 1000 п.о. в 3' концевом направлении (нисходящем) кодирующей области. Указанные фрагменты вводят в бинарный вектор pAGS140 для трансформации клеток растения, как описано в примере I. Данный бинарный вектор pAGS140 аналогичен вектору pAGS135 (фиг. 2), за исключением того, что между сайтом BamH I и правой границей T-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens введен ген, который сообщает резистентность растениям к антибиотику гигромицину.

Интродукцию генов АЛС в гербицидчувствительные клетки табака и сахарной свеклы путем совместного культивирования клеток растений с A. tumefaciens, несущими гены АЛС в бинарном векторе, проводят, как описано в примерах I и II. Полученные результаты совместного культивирования на табаке представлены в табл. 15. Гербицидустойчивые трансформанты получают с помощью трех из 4 мутантных генов АЛС сахарной свеклы. Частота выхода гербицидустойчивых трансформантов ниже полученной для трансформантов, устойчивых к канамицину, и, кроме того, ниже чем частота трансформантов резистентности к гербициду, полученная в случае, когда используют ген SURB-Hra табака. Полагают, что это вызвано слабой экспрессией мутантных генов АЛС сахарной свеклы в табаке. Вышеуказанное можно объяснить либо неполными регуляторными последовательностями, расположенными вверх или вниз по ходу мутантных генов АЛС сахарной свеклы в используемых ДНК-фрагментах, либо недостаточной утилизацией нуклеотидных последовательностей нуклеотидов сахарной свеклы в табаке или обоих. Ожидают, что мутантный ген АЛС сахарной свеклы, не создающий гербицидустойчивых трансформантов, будет вести себя таким образом, при условии, если удастся получить и испытать большее количество трансформантов.

Пример V.

Ген SURB-Hra. описанный в примере 1, трансформируют в культурные сорта табака путем заражения пластинок табачных листьев Agrobacterium tumefaciens и трансформанты анализируют с тем, чтобы продемонстрировать экспрессию устойчивости на уровне целого растения и наследственность признака гербицидной устойчивости. Следуют стандартным асептическим методикам для манипулирования стерильными средами и аксенными растительными/бактериальными культурами, включая использование колпака с ламинарным потоком для всех переносов. Растения табака для заражения листовых пластинок выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24oC и 12 ч при ночной температуре 20oC, при относительной влажности около 80% при смешанном холодном свете флуоресцентного и температурного свечения. Заражения листовых пластинок табака осуществляют в основном по методу Horsch R.B. Fry J.E. Hoffmann N.L. Eichholtz D. Rogers S. G. Fraley R.T. (1985), Science 227: с. 1229 1231.

Молодые листья, распустившиеся неполностью и имеющие приблизительно 4 6 дюймов (101,6 152,4 мм) в длину, собирают скальпелем с растений табака (Nicotiana tabacum, сорт NK 326 или K 14). Поверхность листьев стерилизуют в течение 30 минут погружением их в 500-мл объем 10%-ного Chlorox, 0,1%-ного раствора додецилсульфата натрия и затем промывают три раза стерильной деионизированной водой. Листовые пластинки диаметром 6 мм получают из целых листьев с использованием стерильного бумажного пуансона.

Листовые пластинки инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл 1 10 разбавления ночной культуры Agrobacterium, несущей плазмиду pAGS152. Культуры Agrobacterium получают после инокулирования 10 мл Min A (пример I) бульона единственной бактериальной колонией, удаленной из Min A плюс тетрациклин (пример VI). Культуру выращивают около 17 20 ч в 18 мм стеклянных пробирках с культурой в качалке с платформой New Brunswick, поддерживая температуру 28oC.

После инокулирования листовые пластинки помещают на чашки Петри, содержащие среду с агаром CN (пример VI). Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанном флуоресцентном и "Gro and Sho" освещении (General Electric) в течение 2 3 дней в камере для культур, где поддерживают температуру около 25oC.

Для того, чтобы освободить листовые пластинки от Agrobacterium и отобрать для роста трансформированные клетки табака, листовые пластинки переносят на свежую среду CN, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного 100 мг/мл основного раствора и прибавляют асептически (стерилизуют через 0,45 мкм фильтр) к средам после автоклавирования. Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготавливают для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская в автоклавированные среды.

Листовые пластинки инкубируют в условиях роста, описанных выше, в течение 3 недель и затем переносят на свежие среды с таким же составом.

Приблизительно через 1 2 недели всходы, развивающиеся на канамицинотобранных эксплантатах, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде A, содержащей 100 мг/л канамицина. Корнеобразование на селективной и неселективной средах регистрируют в пределах 3 недель. Всходы, которые укореняются в канамицине, переносят в почву и выращивают в растильне, как описано выше. Через 4 5 недель, но перед тем, как происходит цветение, листовую ткань вырезают и используют для анализа АЛС, как описано в примере VI. Результаты этих анализов показывают, что продуцируется гербицидустойчивая форма АЛС (см. табл. 16). Растения, проявляющие гербицидустойчивую АЛС-активность, затем переносят в теплицу, где они растут до зрелости. Отдельные цветки заключают в мешки для того, чтобы позволить самооплодотворение без перекрестного опыления. Зрелые семена собирают и осуществляют испытания по качеству потомства для определения наследуемости признака гербицидной устойчивости. Поверхность семян стерилизуют, как описано выше, сушат и семена сажают на среде SG (1/4 соли MS, 0,75% сахароза, 0,8% агар) в присутствии или отсутствии гербицида (DPX-F6025, Classic). Чувствительные семена прорастают, но далее не развиваются. Результаты испытания по качеству потомства приведены в табл. 16. Сегрегационное отношение 3 устойчивых потомств к одному чувствительному указывает на присутствие одной вставки гена SURB-Hra в трансформанте, который является стабильно унаследованным у 15 из 17 трансформантов. Более высокие отношения устойчивых к чувствительным потомствам показывают множественные вставки в несвязанных положениях в геноме. Отношение 15/1 показывает присутствие 2 несвязанных генов SURB-Hra, а отношение 255/1 показывает наличие 4 несвязанных генов SURB-Hra в трансформантах K 14 N 40 и K 14 N 7 соответственно.

Пример VI.

Для трансформации гербицидчувствительного томата в гербицид-устойчивый используют ген SURB-Hra из табака, переносимый на бинарном векторе pAGS152 в штамме A. tumefaciens LBA4404 (см. пример I).

Следуют стандартным асептическим методикам для манипулирования стерильными средами и аксенными растительными/бактериальными культурами, включая использование колпака с ламинарным потоком для всех переносов.

Поверхность семян томата (Lycopersicon esculentum, сорт Herbst Red Cherry) стерилизуют в течение 30 мин в 10%-ном Chlorox, 0,1%-ном растворе додецилсульфата натрия и промывают три раза стерильной деионизированной водой. Семена сажают в ящиках Magenta (Magenta Corp.), содержащих 100 мл среду с агаром OMS, и инкубируют при смешанном флуоресцентном и "Gro and Sho" освещении для растений (General Electric) в камере для культур, поддерживая в ней температуру около 25oC. Семядоли от всходов 10 15-дневного возраста используют для инокуляции Agrobacterium.

Семядоли скарифицируют путем отщепления около 2 мм ткани от каждого конца семядоли при помощи стерильного скальпеля. Скарифицированные семядоли высевают на чашки Петри на среду с агаром CTM либо в присутствии, либо в отсутствии 75 мкМ ацетосирингона (Aldrich Chemical).

При получении инокуляций семядолей единственную бактериальную колонию с чашки с агаровой средой Min A + тетрациклин (1 мкг/мл) инокулируют в колбу, содержащую 30 мл бульона Min A (пример I), и выращивают в течение 2 дней при температуре 28oC в качалке с платформой New Brunswick. В утреннее время для инокуляции семядолей бактериальную культуру разбавляют стерильным бульоном Min A до оптической плотности 0,1 при 650 нМ и увеличивают до оптической плотности 0,2 в условиях роста, описанных ранее. Эту культуру затем используют неразбавленной для инокулирования.

Чашки с агаром CTM, содержащие эксплантаты семядолей, наполняют 5 мл бактериального раствора в течение приблизительно 5 мин перед тем, как удалить раствор. Затем чашки закрепляют лентой Time (Shamrock Scientific Specialty) с двух сторон чашки и инкубируют в течение 2 дней при смешанном флуоресцентном и "Gro and Sho" освещении для растений (General Electric) при температуре около 25oC.

Для того, чтобы освободиться от растительных культур Agrobacterium и отобрать для роста трансформированные клетки томата, эксплантаты семядолей переносят в свежую среду CTM, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, и инкубируют при таких же условиях культивирования, которые описаны выше, приблизительно в течение 3 недель. Затем семядоли переносят в свежие среды с таким же составом и селективными веществами, как и среда CTM, однако при 1/10 концентрации зеатина.

Приблизительно через 2 4 недели всходы, развившиеся из канамицинотобранных семядолей, отрезают и высевают в средах OMS, содержащих 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Всходы томата, которые укоренились в канамицине через 2 3 недели, переносят в почву в 8-дюймовых (203,2 мм) сосудах и накрывают пластмассовыми мешками. Растения выращивают при смешанных флуоресцентном и температурном свечениях: 12 ч при дневной температуре 24oC и 12 ч при ночной температуре 20oC, при относительной влажности около 80% в течение одной недели перед тем, как снять пластмассовые мешки. Затем растения выращивают еще 2 4 недели и осуществляют проверку на ацетолактатсинтазу. В этих экспериментах показано повышение ингибированной АЛС-активности в присутствии сульфонилмочевины Classic в экстрактах листьев из трансформированных растений (табл. 17).

Испытание на активность АЛС в отсутствии или в присутствии гербицида из трансформированных или нетрансформированных растений осуществляют следующим образом:
1. Измельчают 2,5 г относительно молодой листовой ткани [4 6 дюймов (101,6 152,4 мм) в длину] в тканевом гомогенизаторе, содержащем 10 мл экстракционного буферного раствора (100 мм KHPO4, pH 7,5, 0,5 мМ MgCl2, 10% глицерина, 1 мМ пирувата, 0,5 мМ тиаминпирофосфата, 10 нМ флавинадениндинуклеотида) и 200 мг Polyclar AT (BDH Biochemicals). Сохраняют на льду.

2. Гомогенизируют экстракт в течение приблизительно 10 с в политроне (Brinkman Instruments) при настройке на N 7.

3. Центрифугируют экстракт в роторе Sorvall SS-34 в течение 20 мин, 16 K об/мин, 4oC.

4. Уравновешивают колонки PD-10 (Pharmacia) промыванием 5 раз колоночным буферным раствором (100 мМ KHPO4, pH 7,5, 0,5 мМ MgCl2, 10% глицерин, 1 мМ пируват).

5. Для засева экстракционного супернатанта прибавляют холодный насыщенный раствор (NH4)2SO4 с получением 50% фракции. Инкубируют на льду в течение 30 мин.

6. Центрифугируют экстракт в роторе SS-34, 20 мин, 16 K об/мин, 4oC. Декантируют супернатант.

7. Ресуспендируют осадок в 1 мл холодного колоночного буфера.

8. Загружают экстракт на колонку и прогоняют объемом колоночного буферного раствора с получением полного объема загрузки, равного 2,5 мл. Этот прогон пропускают через колонку.

9. Элюируют белки 2X объемом загруженного экстракта. Извлекают в 15 мл трубке Falcon, расположенной под колонкой.

10. Вызывают реакцию для каждого экстракта в трубках следующим образом: 350 мкл реакционной смеси (200 мМ пирувата, 5 мМ ТПФ, 0,9 мМ ФАД, 5 мМ KHPO4 pH 7,0), 50 мкл либо 5 мМ KHPO4, либо желаемой концентрации сульфонилмочевины, и 100 мкл растительного экстракта подвергают взаимодействию.

11. Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч, 30oC.

Для остановки реакции прибавляют 50 мкл 6М раствора H2SO4 и инкубируют при 60oC в течение 10 мин. Центрифугируют в микромельнице в течение 5 мин.

13. Устанавливают режим колориметрических пробирок: 500 мкл 0,5%-ного креатина, реакционного пробирочного супернатанта, 0,5 мл раствора -нафтола (1,5 г a-нафтола в 30 мл 2,5 N раствора NaOH). Смешивают содержимое и нагревают при температуре 60oC в течение 20 мин.

14. Завихряют каждую пробирку и кладут 100 мкл каждого образца в резервуары микротитровых чашек. Снимают показания при оптической плотности 530.

B.

Среда индукции каллюса.

1 упаковка солей MS (Gibco Murashige Organics Medium) с 0,3%-ной сахарозой на 1 л
1 мл из 1 мг/мл NAA pH 5,8
0,2 мл из 1 мг/мл BAR 0,8% агар
CN.

Среда индукции всходов.

1 упаковка солей MS с 3% сахарозой на 1 л
1 мл из 1 мг/мкл NAA pH 5,8
1 мл из 1 мг/мл BAP
0,8% агар
A.

Среда корневой индукции.

1 упаковка солей MS (без сахарозы) на 1 л
10 г сахарозы pH 5,8
0,8% агар
R-среда Agrobacterium.

Добавляют 7,5 г агара к 440 мл воды, автоклавируют и сохраняют при температуре 55oC. Прибавляют стерильные смеси:
0,5 мл 1 M MgSO4
0,5 мл 1 M CaCl2
10,0 мл 20% сахарозы
5,0 мл 100 мг/мл канамицина
50,0 мл 10x солей (Na2HPO47H2O 60 г/л; - KH2PO4, 30 г/л; NaCl, 5 г/л; NH4Cl, 10 г/л).

Среда CTM.

1 упаковку солей MS;
1 мл витаминов B5 (на 100 мл; никотиновая кислота 100 мг, тиамингидрохлорид 1000 мг, пиридоксин гидрохлорид 100 мг, миоинозит 10000 мг)
3 мМ MES
3% глюкозы
0,7% агара
pH 5,7
Автоклавируют и прибавляют 1 мл 1 мг/мл раствора зеатина.

Среда OMS.

1 упаковка солей MS
1 мл витаминов B5 (см. выше)
3 мМ MES
3% сахарозы
0,8% агара
pH 5,7
Среда Min A + тетрациклин (1 мкг/мл).

1. Прибавляют 7,5 г агара к 400 мл воды,
2. Приготавливают основной раствор:
K2HPO4 5,25 г
KH2PO4 2,25 г
(NH4)2SO4 0,5 г
Лимоннокислый натрий2H2O 0,25 г 100 мл
3. Готовят смесь MgSO47H2O 20 г/100 мл, автоклавируют.

4. Готовят основной раствор глюкозы 20% раствор, автоклавируют.

5. Готовят тетрациклиновую смесь 1,0 мг/мл в этаноле/H2O, 50 об. стерилизуют через фильтр.

Для получения среды Min A + 1 мкг/мл тетрациклина необходимо смешать (1) и (2), прибавить 0,5 мл (3), 5 мл (4) и 0,5 мл (5).

Среда YEB. на литр.

Бактомясной экстракт 5,0 г
Бактодрожжевой экстракт 1,0 г
Пептон 5,0 г
Сахароза 5,0 г
MgSO47H2O 0,5 г
Агар (по выбору) 15,0 г
Гербицидные растворы: 1 ч. на миллион основного раствора гербицидного соединения сульфонилмочевины можно получить растворением 1 мг гербицида в 100 мл 0,01 н. раствора NH4OH с последующим разбавлением 1 10 путем добавления 5 мМ KHPO4 pH 7,0. Эта смесь будет достаточной для испытания при концентрации гербицида 100 ч. на миллион или ниже. Если требуются более высокие концентрации, следует растворить 1 мг в 10 мл 0,01 н. раствора NH4OH и т.д.

Гербицидные разбавления. При проведении стандартного испытания 50 мкл гербицида прибавляют к 450 мкл испытуемой смеси и экстрагируют, для 1 10 разбавления. Итак, для каждой испытуемой концентрации 10X раствор в 5 мМ KHPO4 pH 7,0 должен быть разбавлен из основного раствора.

Пример VII.

Табачный ген SURB-Hra, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации Beta vulgaris (сахарная свекла) в гербицидноустойчивую с использованием следующей методики Agrobacterium tumefaciens опосредованной трансформации.

Для того, чтобы стерилизовать поверхность семян, 50 100 семян помещают в 25x100 мм стерильные чашки Петри в колпаке с ламинарным потоком и прибавляют 70% -ный этанол. Семена перемешивают руками в течение 1 2 мин, этанол декантируют, после чего прибавляют 25 30 мл 20%-ного Chlorox (20 мл коммерческого отбеливателя/80 мл стерильной воды/1 капля Твин 80). Семена перемешивают на качающемся сите со скоростью 40 об/мин, 20 мин и отбеливатель сливают. Стерилизацию с отбеливателем повторяют 2 раза (общее время 60 мин) и стерилизованные семена промывают 3 раза в течение 5 мин, каждый раз 25 30 мл стерильной воды.

Для прорастания семян последние высевают на чашки с агаром l/2 PGO, отверждающим среду; 12 семян/50 мл среды/15x150 мм чашку Петри, и культивируют при температуре 24oC в темноте.

Примечание: 10 20% загрязнение семени можно ожидать для хорошей, чистой делянки с семенами. По этой причине семена высевают далеко друг от друга на больших пластинках, и прорастания регистрируют непрерывно, и незагрязненные семена переносят к свежим пластинкам. Если загрязнение грибковое, тогда переносы осуществляют в камере с ламинарным потоком с вентилированием.

60 80% всхожесть семян ожидается для хорошей семенной делянки. Прорастание несинхронное. Приблизительно 14 дней необходимо для достижения (а) всех прорастаний и (б) достаточной элонгации с тем, чтобы получить много подходящих эксплантатов.

Затем получают ночные суспензионные культуры (O/N) Agrobacterium, как описано в примере I. Заново посеянная Agrobacterium имеет более короткий латентный период, чем культуры, сохраняемые в течение более длительного времени при температуре 5oC. Важно, что лог-фазовые бактерии используют в качестве инокулятов. Поэтому необходимо провести испытание с тем, чтобы удостовериться в том, что есть ночная культура, которая достигает лог-фазы (оптическая плотность 0,4 0,8) перед инокулированием гипокотилий.

Для получения растительных эксплантатов гипокотилии разрезают на сегменты около 0,5 см при помощи острого хирургического скальпеля и немедленно высевают на чашки с агаром, отвержденным PGO /0,10,1. Не следует позволять ране высохнуть или повредиться при использовании тупого скальпеля или при сжатии пинцетом.

Для инокуляции эксплантатов последние погружают отдельно в суспензию соответствующего штамма Agrobacterium. находящегося в log-фазе. Эксплантаты погружают на короткий срок (1 3 с) и располагают в решетчатой конфигурации на свежей чашке: 25 эксплантатов/100 мм чашке с агаровой средой, отвержденной PGO 0,1/0,1.

Эксплантаты сушат, оставляя чашки открытыми в колпаке с ламинарным потоком 10 30 мин. Это концентрирует Agrobacteria на ране. Это также может ограничить возможное повреждение, наносимое водой. Важно также, чтобы ткань не теряла влагу. Требуется тщательное наблюдение за данной стадией. Затем чашки герметизируют пара-пленкой и культивируют при температуре 24oC в течение 3 дней.

Эксплантаты собирают в жидкой PG 0,1/0,1, содержащей цефотаксим при концентрации 500 мкг/мл в 25x100 мм чашках Петри и осторожно встряхивают на круговой качалке при 40 об/мин в течение 1 ч. Среды декантируют, заменяют свежими селективными средами для подсчета микроорганизмов и встряхивают осторожно в течение еще 2 ч. Эксплантаты высевают в решетчатой конфигурации на 25/100 мм чашки с агаровой средой, отвержденной PG 0,1/0,1, содержащей 500 мкг/мл цефотаксима, и культивируют при температуре 24oC в течение 3 дней.

Отбор трансформированных растительных клеток осуществляют следующим образом. Эксплантаты переносят на свежие чашки с агаром, отвержденным PG 0,1/0,1, содержащим 100 мкг/мл ванкомицина или 2 нг/мл хлорсульфурона в качестве селективных агентов. Число устойчивых колоний подсчитывают через 20 - 30 дней. В каждой ране можно наблюдать более чем одну колонию. Трансформанты отщепляют следующим образом. Каллюс удаляют из раны/эксплантата хирургическим скальпелем и культивируют независимо на свежих селективных средах. Некоторые Agrobacterium могут избежать подсчета колоний. Возможны дополнительные промывки в цефотаксимсодержащих жидких средах для осуществления повторного переноса к цефотаксимсодержащим чашкам, отвержденным агаром. С соблюдением предложенных правил заявитель заметил приблизительно 15% загрязнение эксплантатов, которое является допустимой потерей. Результаты эксперимента по трансформации Beta vulgaris сахарной свеклы с использованием линии клеток 87193 приведены в табл. 18. Уровень устойчивости к хлорсульфурону в каллюсах Beta vulgaris, трансформированной мутантным АЛС-геном SURB-Hra табака, выдерживает сравнение с уровнем нетрансформированных каллюсов. Эти результаты показывают, что ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, может быть эффективно экспрессирован в сахарной свекле.

Среды и структурообразователи показаны в табл. 19 и 20.

Пример VIII.

Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицид-устойчивую АЛС, используют для трансформации Brassica napus, сорт Olga, с использованием следующей Agrobacterium tumefaciens опосредованной методики трансформации.

Для поверхностной стерилизации семян последние погружают на 1 мин в 70% этанол, затем на 30 60 мин в раствор Chlorox/Твин (см. пример VII). Поверхностно-стерилизованные семена прорастают на 1/2 MS, 1/2 PGO (см. пример VII) при температуре 24oC в темноте. Через 5 10 дней после прорастания гипокотили разделяют на участки 0,5 см и помещают на твердой среде I, содержащей по 100 мкм Ацетосиригона (IAS100).

Сразу же эксплантаты окунают по отдельности в суспензию LBA4404 в лог-фазе, содержащую бинарную плазмиду pAGS15.

Эксплантаты высевают обратно на IAS100. Каплю Agrobacterium осторожно сушат на ткани, оставляя пластинку открытой в колпаке с ламинарным потоком. Совместное культивирование осуществляют при температуре 24oC при малом свете или в темноте в течение 3 дней.

Через 3 дня эксплантаты собирают в жидкой среде I, содержащей 500 мг/л цефотаксима, в 100x25 мм чашках Петри и встряхивают на круговой качалке при 40 об/мин в течение 3 ч.

Эксплантаты высевают на твердую среду I, содержащую 500 мг/мл цефотаксима, и культивируют в течение 3 дней при температуре 24oC при малом свете.

Эксплантаты высевают на чашки с твердой средой I, содержащей ванкомицин (100 мг/л) и канамицин (100 мг/л).

Приблизительно через 1 месяц трансформированные каллюсы появляются в виде дискретных узелков на концах эксплантатов.

Сразу же узелки отщепляют острым скальпелем и высевают на твердую среду I, содержащую 100 мг/л канамицина. Когда трансформированный каллюс достигает достаточного размера (диаметр 0,5 см), его переносят на среду KR, содержащую 100 мг/л канамицина. Этот материал регенерируется быстрее, если его высевают на свежие среды каждые две недели. Корни регенерируются на 1/2 MS, содержащей 2 мкм IBA.

В одном эксперименте из 100 скарифицированных сайтов (любой конец 0,5 см сектора гипокотиля) 20 развили каллюсную ткань, которая была устойчивой к канамицину при его концентрации 100 мг/л. Пять из 20 трансформированных линий клеток последовательно индуцировали для регенерации на канамицине, и соматические, скрещивающиеся между собой сибсы для каждого регенерирующего генотипа были получены узловым размножением. Эти растения опрыскивали различными концентрациями хлорсульфурона, и результаты приведены в табл. 22. Два из пяти трансформантов устойчивы к хлорсульфурону на уровнях, которые приблизительно в 10 раз выше уровня, летального для контрольных (нетрансформированных) растений.

Для дальнейшего показа экспрессии гена SURB-Hra в трансформированном Brassica napus осуществляют испытание АЛС в присутствии гербицида хлорсульфурона, как описано в примере VI. Активности АЛС сравнивают между нетрансформированным родителем и трансформантом Ro N 5 (табл. 22); результаты сравнения приведены в табл. 23. В трансформанте наблюдается неуклонное повышение процента ингибирования АЛС-активности. Таким образом, ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицид-устойчивую АЛС, может экспрессироваться в Brassica napis, однако эта экспрессия не является эффективной. Добавление нуклеотидных регуляторных последовательностей Brassica napis, как ожидают, могло бы повысить уровень экспрессии гербицидустойчивой АЛС и уровень толерантности к некорневому внесению гербицида.

Brassica napus Культуральные среды (табл. 24, 25)
Brassica napus Основные растворы (табл. 26)
Пример IX.

Ген SURB-Hra, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации Cucumis melo, сорт Amarillo Oro (дыня) в гербицидустойчивый с использованием следующей методики трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens. Ссылочными материалами для этой методики является работа Moreno V. и др. Plant regeneration from calli of melon. Plant Cell Tissue Organ Culture, 5 (1985), с. 139 146.

Поверхностная стерилизация семян в значительной степени упрощается первоначальным удалением семенной оболочки. Затем семена стерилизуют промывкой в 70% этаноле в течение 2 мин, после чего семена промывают в Chlorox/Твин (см. пример VII) в течение 20 мин. Стерильные семена промывают 3 раза в стерильной дистиллированной воде и выращивают на среде OMS при температуре 24oC при продолжительности дня 16 ч.

Семядоли проростков дыни 7 14-дневного возраста разрезают на 5 мм срезы при помощи нового, острого скальпеля. Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterium в лог-фазе, полученную, как описано в примере I, переносят к новым чашкам для совместного культивирования и культивируют при температуре 24oC по 16 ч 3 дня.

Бактерии убивают путем промывки эксплантатов в течение 3 ч с осторожным помешиванием в промывочных средах и культивируют на свежих чашках с селективной средой. Эксплантаты субкультивируют каждые 3 4 недели, отсекая более компактные, темно-зеленые секторы от белого ворсистого каллюса.

Когда "морфогенный" каллюс (очень темно-зеленый, компактный, возможны чуть узнаваемые уровни) становится заметным, его переносят к регенерационным средам. Ткань может давать ростки вместо того, чтобы проходить через морфогенную стадию. Всходы укореняются в корнеобразующих средах. Приблизительно 70% эксплантатов развивают каллюс, устойчивый к канамицину при концентрации 100 мкм/л. Трансформированный каллюс помещают на среды, содержащие возрастающие концентрации хлорсульфурона, и рост в присутствии гербицида определяют взвешиванием каллюса через 30 дней (табл. 27). Некоторые трансформанты растут при высоких концентрациях хлорсульфурона (1000 ppb) также, как и в его отсутствии, например Транс 1, Транс 2 и Транс 7. Таким образом, ген SURB-Hra может обеспечивать высокий уровень гербицидной устойчивости.

Среды
OMS
Соли MS и Fe ЭДТК 1X
Витамины B5 1X
Сахароза 3%
MES 3 мМ
pH 5,7
Агар Т.С. 0,8%
Автоклав 20 мин
Основная среда
Соли MS и Fe ЭДТК 1X
Миоинозит 100 мг/л
Тиамин 1 мг/л
Сахароза 3%
MES 3 мМ
pH 5,7
Агар Т.С. 0,8%
Автоклав 20 мин
Средой для совместного культивирования является основная среда плюс:
Ацетосирингон 100 мкм [ацетосирингон поддерживают в виде 100 мМ основного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО)]
Кинетин 6 мг/л;
IAA 1,5 мг/л.

Промывочной средой является основная среда без агара плюс:
Цефотаксим 500 мг/л
Кинетин 6 мг/л
IAA 1,5 мг/л
Элективной средой является основная среда плюс:
Кинетин 6 мг/л
IAA 1,5 мг/л
Ванкомицин 100 мг/л
Одно из следующих селективных лекарств в зависимости от конструкции Agrobacterium:
Канамицин 100 мг/л
Гигромицин 50 мг/л
Хлорсульфурон 100 мг/л
Регенерационной средой является основная среда плюс:
BAP 0,1 мг/л
Ванкомицин 100 мг/л
Описанные выше селективные лекарства.

Корнеобразующей средой является OMS плюс:
IBA 1 мкм
Ванкомицин 100 мг/л
Описанные выше селективные лекарства.

Пример X.

Ген SURB-Hra, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, используют для трансформации Medicago sativa, сорт Rangelander (люцерна) в гербицидную устойчивость при помощи следующей методики трансформации, опосредованной Agrobacterium tumefaciens. Ссылкой для этой методики служит работа Deak M. Kiss G. Koncz C. и Dudits D. Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene transfer (предварительная печать).

Растения выращивают и субкультивируют в среде OMS. Используемыми материалами являются черешки и сегменты стебелька (длиной 5 мм) от растений через 2 месяца после последней субкультуры. Черешки и стебли стерильных растений разрезают на 5-мм отрезки при помощи свежего, острого скальпеля. Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterium в log-фазе, полученную, как описано в примере I, переносят на свежие чашки для совместного культивирования при температуре 24oC по 16 ч в течение 3 дней.

Бактерии убивают путем промывки эксплантатов в течение 3 ч с осторожным помешиванием в промывочной среде и культивируют на свежих чашках с элективной средой.

Эксплантаты субкультивируют каждые 3 4 недели. Через 1 месяц виден трансформированный каллюс, выросший из обработанных концов эксплантатов, который отрезают от эксплантата и высевают на чашки со свежей селективной средой. Когда каллюс становится более организованным (площади более темно-зеленые и более компактные), его переносят на свежие среды для созревания.

Когда появляются развившиеся зародыши, их переносят на среды для прорастания. После прорастания маленькие растения выращивают на этой же среде.

Менее 1% эксплантатов развивают каллюс, устойчивый к канамицину при концентрации последнего 100 мг/л. Канамицинустойчивые секторы устойчивы к гербициду хлорсульфурон при концентрации 50 ppb. Эти всходы получены из канамицинустойчивого каллюса. Ткань из этих трансформантов оценивают на гербицидустойчивый рост в пределах изменения концентрации гербицида хлорсульфурона. Один из трансформантов способен расти при концентрации хлорсульфурона 1000 ppb; два других способны расти при концентрации хлорсульфурона 5000 ppb. Таким образом, ген SURB-Hra может обеспечивать высокий уровень гербицидной устойчивости у люцерны.

Среды
OMS
Соли MS и Fe ЭДТК 1X
Витамины B5 1X
Сахароза 3%
MES 3 мМ
pH 5,7
Агар Т.С. 0,8%
Автоклавирование в течение 20 мин.

Основная среда
Соли MS и Fe ЭДТК 1X
Витамины UM 1X*
Сахароза 3%
pH 5,7
Агар Т.С. 0,8%
Автоклавируют в течение 20 мин.

*100 X витамины UM
(количества даны для 100 мл 100 x смеси).

Тиамин HCl 1 г
Никотиновая кислота 0,5 г
Пиридоксин HCl 1 г
Миоинозит 10 г
Глицин 0,2 г
Среда для совместного культивирования
Основная среда плюс
Ацетосирингон 100 мкм (Ацетосирингон сохраняют в виде смеси 100 мМ в ДМСО).

2,4 D 0,5 мг/л
BAP 0,2 мг/л
Промывочная среда
Основная среда без агара плюс
Цефотаксим 500 мг/л
2,4 D 0,5 мг/л
BAP 0,2 мг/л
Селективная среда
Основная среда плюс
2,4 D 0,5 мг/л
BAP 0,2 мг/л
Ванкомицин 100 мг/л
Одно из следующих селективных лекарств в зависимости от конструкции Agrobacterium:
Гигромицин 50 мг/л
Хлорсульфурон 100 мг/л
Среда для созревания: то же, что и селективная среда, но без 2,4-D;
Среда для прорастания: Основная среда плюс Ванкомицин 100 мг/л; вышеописанные селективные лекарства.

Пример XI.

Устойчивость растения Brassica napus "Westar", трансформированного геном SURB-Hra табака, к сульфонилмочевинному гербициду (EXPRESS) при нанесении на листву.

Ген SURB-Hra табака подвергают генетической инженерии для повышения уровня его экспрессии в Brassica napus, как описано ниже.

Плазмида pAG148, содержащая ген SURB-Hra (пример I), переваривается рестрикционным ферментом Bbv I, следуя инструкциям изготовителя (BRL). 5' выступающую последовательность заполняют dNTP с использованием ДНК-полимеразы I, а к концам лигируют BamH I линкеры, следуя стандартным протоколам. Фрагмент Bbv I размером 1,2 кб выделяют из агарозного геля, имеющего низкую температуру плавления, и лигируют с плазмидой pUC119, обработанной BamH I. Последовательность полученной таким образом плазмиды определяют по методике Sanger. Результаты анализа подтверждают, что Bbv I разрезал ДНК в направлении 5' от первого ATG в гене SURB-Hra на расстоянии 4 п.о.

К этому фрагменту гена SURB-Hra присоединяют 3'-конец путем переваривания плазмиды pAGS148 с помощью BstE II и Pst I и выделения фрагмента размером 2,3 кб, содержащего сайт присоединения поли-А+ гена SURB-Hra, из агарового геля, имеющего низкую температуру плавления. Этот фрагмент лигируют к переваренному BstE II/Pst I фрагменту плазмиды, описанной в предыдущем абзаце с тем, чтобы реконструировать целый ген SURB-Hra.

В конце концов, 35S-промоторный фрагмент (нуклеотиды 7042 7460) вируса "Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)" тупым концом лигируют с сайтовым Sma I фрагмента размером 10 п.о. в направлении 5' от первого ATG в гене SURB-Hra. Полученная в результате плазмида содержит ген SURB-Hra табака, имеющий собственный сайт присоединения ПОЛИ-А+ и 35S-промоторный фрагмент CaMV.

Эту плазмиду переваривают ферментом Sca I, фрагмент размером 324 п.о. с геном устойчивости к ампициллину, встраивают в плазмиду pUC119. Фрагмент размером 2 кб, содержащий транспозон TN903, кодирующий бактериальную канамицинустойчивость, тупым концом лигируют с сайтом Sca I. Канамицинустойчивые клоны выделяют в результате посева на LB среду, содержащую 50 мг/мл канамицина; полученные колонии не были способными расти на LB среде, содержащей 100 мг/мл ампициллина.

Для трансформирования растительной ткани устойчивые к канамицину конструкты клонируют в бинарный вектор pAGS140 (пример IV) путем переваривания бинарного вектора с помощью BamH I и заполнения концов dGTP и dATP с использованием ДНК-полимеразы I. Производное pUC119, несущее полученный генетической инженерией ген SURB-Hra, переваривают Sal I, а концы частично заполняют dCTP и dTTP с использованием ДНК-полимеразы I. Две ДНК лигируют друг с другом, следуя стандартным протоколам.

Полученную в результате плазмиду pHRABIN при помощи вспомогательной плазмиды PRK2013 вводят в штамм Agrobacterium LBA4404.

Полученный генетической инженерией ген SURB-Hra вводят в растение Brassica napus сорт "Westar" путем инокулирования гипокотильных сегментов с помощью штамма Agrobacterium LBA 4404/pHRABIN (методику см. в примере VIII). После трехдневного совместного культивирования с Agrobacterium гипокотильные участки помещают на индукционную среду, содержащую либо 50 мг/л канамицина, либо 20 ppb хлорсульфурона для селекционного роста трансформированных каллюсов. Когда устойчивые каллюсы достигают диаметра более 5 мм, их переносят на регенерационную среду, не содержащую селективного агента. В течение трехмесячного периода культивирования из каждого трансформированного каллюса регенерируют 8 10 ростков.

Восемь ростков, регенерируемых из каждой из трех трансформированных линий клеток, трансплантируют из сосудов для стерильного культивирования в сосуды диаметром 4 дюйма (около 10 см), содержащие среды "Pro Mix potting media" с несколькими пилюлями удобрения Osmokote 14-14-14. Сосуды накрывают пластиковыми мешками и помещают в растильню, где их выдерживают при температуре 20oC при смешанных флуоресцентом и температурном свечениях: 14 ч при дневных условиях, 10 ч при ночных условиях. Через 19 сут. растения очевидно укоренились и сильно растут. Пластиковые мешки удаляют и растения перемещают в теплицу. Нетрансформированные, выращенные из семян, растения "Westar" культивируют в идентичных условиях в качестве контрольных растений.

Через 6 дней выращивания в теплице растения, регенерируемые из трех трансформированных линий клеток, и контрольные растения, выращенные из семян, опрыскивают сульфонилмочевинным гербицидом DPX L5300-25, растворенным в воде вместе с 0,25% ПАВ Х-77. Дубликатные растения из каждой линии опрыскивают автоматическим разбрызгивателем в дозах 0, 4, 8 и 20 г/га. В момент опрыскивания все растения имели 5 6 листьев; растения, произведенные от линии клеток 30 14, проявили зачатки цветков. Растения возвращают в теплицу непосредственно после опрыскивания.

Через 8 и 15 дней после опрыскивания оценивают и фотографируют степень повреждения растений (из каждой пары дубликатных растений снимают растение с наименьшей степенью повреждения). Оценки степени повреждения, полученные через 15 дней после опрыскивания, приведены в приложенной табл. 28. В некоторых случаях один представитель дубликатной пары, видимо, потерпел более сильное повреждение, чем второй при данной норме расхода гербицида (например, 24-1-С и 24-1-D). По мнению заявителя, это различие обусловлено различным уровнем экспрессии гена SURB-Hra в индивидуальных регенерируемых растениях. Несмотря на это, один представитель каждой дубликатной пары проявляет существенно меньшую степень повреждения, чем нетрансформированные контрольные растения при одинаковой норме расхода гербицида.

Пример XII.

Нанесение гербицида EXPRESS на листву растений картофеля, трансформированных геном SURB-Hra.

Трансформируют растения картофеля (Kennebac) геном SURB-Hra табака путем совместного культивирования эксплантата стебля и штамма Agrobacterium с pAGS152/LBA 4404. После того, как растения достигли высоты около 6 дюймов (около 15 см), их обрабатывают указанным ниже образом. Оценку проводят через 5 дней после обработки (табл. 29).


Формула изобретения

Способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербицидам двудольных растений, предусматривающий культивирование клеток на селективных средах, отбор устойчивых к гербициду клеток и получение регенерантов, отличающийся тем, что предварительно конструируют рекомбинатную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий устойчивую к гербициду ацетолактатсинтазу, нуклеотидная последовательность которого содержит по крайней мере одну из консервативных субпоследовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности A, B, C, D, E, F, G, с помощью тригибридного скрещивания переносят плазмидную ДНК в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens, трансформируют протопласты растений агробактериями и отбирают трансформанты, при этом аминокислотная последовательность А представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности пролин-глицин-глицин(Е2)-аланин(Е1), соответствующих 119 122 аминокислотам ацетолактатсинтазы растения, где Е1 является любой аминокислотой, кроме аланина, Е2 любой аминокислотой, кроме глицина, аминокислотная последовательность В представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности глицин-глутамин-валин-пролин(1), соответствующих 194 197 аминокислотам ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме пролина, аминокислотная последовательность С представляет собой последовательность из 8 аминокислот, гомологичных последовательности изолейцин-глицин-треонин-аспарагиновая кислота-аланин (2)- фенилаланин-глутамин-глутаминовая кислота, соответствующих аминокислотам 201 - 208 ацетолактатсинтазы растения, где 2 является любой аминокислотой, кроме аланина, аминокислотная последовательность D представляет собой последовательность из 3 аминокислот, гомологичных последовательности пролин-лизин (1)- аспарагиновая кислота, соответствующих последовательностям 255 257 ацетолактатсинтазы растения, причем 1 является любой аминокислотой, кроме лизина, аминокислотная последовательность Е представляет собой последовательность из 5 аминокислот, гомологичных последовательности аргинин-фенилаланин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота (1)-аргинин, соответствующих аминокислотам 381 385 ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме аспарагиновой кислоты, аминокислотная последовательность F представляет собой последовательность из 10 аминокислот, гомологичных последовательности глицин-метионин-валин (8)-валин-глутамин -триптофан (3)-глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота-аргинин-фенилаланин (7), соответствующих аминокислотам 586 595 ацетолактатсинтазы растений, где 3 является любой аминокислотой, кроме триптофана, 8- является любой аминокислотой, кроме валина, и 7- является любой аминокислотой, кроме фенилаланина, последовательность G представляет собой последовательность из 6 аминокислот, гомологичных последовательности метионин-лейцин-глицин-метионин (1)-гистидин-глицин, соответствующих аминокислотам 356 361 ацетолактатсинтазы растения, где 1 является любой аминокислотой, кроме метионина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к способу трансформации размножающихся путем опыления растений посредством введения экзогенной ДНК в незрелые и культивированные in vitro пыльцевые зерна

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам защиты клеток растений от вредного воздействия гербицидов

Изобретение относится к области генной инженерии, биохимии и трансформации растений, в частности касается трансформации растительных клеток, приводящей к экспрессии химерного гена, кодирующего белок, токсичный для жесткокрылых насекомых

Изобретение относится к клеточной и генетической инженерии, а именно к получению клеточных линий и растений с новыми наследственными свойствами

Изобретение относится к получению трансгенных растений, в частности трансгенных растений кукурузы, и может быть использовано в сельском хозяйстве

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения резистентного к вирусу трансгенного растения

Изобретение относится к способу выделения генетически трансформированных клеток, в которые введена заданная последовательность нуклеотидов, заключающемуся в том, что трансформированные клетки получают избирательные преимущества без разрушения нетрансформированных клеток, а также к новым соединениям, которые используются в указанном способе

Изобретение относится к приготовлению представляющих интерес ферментов в семенах трансгенных растений и применению подготовленных таким образом семян и производственных процессах при отсутствии необходимости экстракции или изоляции фермента
Наверх