Способ получения пептидов и устройство для его осуществления

 

Сущность изобретения: предлагается способ получения пептидов путем синтезирования из раствора, содержащего в качестве компонентов аминокислоты, в котором предварительно по меньшей мере часть компонентов, например, изменением pH раствора переводят в ионизированное состояние, а затем раствор подвергают одновременному воздействию скрещенных между собой электрического поля и магнитного поля, имеющего постоянную и переменную составляющие, причем частота переменной составляющей магнитного поля соответствует собственной частоте циклоидного движения компонентов раствора, и устройство для осуществления способа. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к биологии, более точно к способам получения пептидов и устройствам для их осуществления.

Известен способ получения пептидов и ряда пептидных гормонов ферментов и иммуномодуляторов путем экстрагирования их из биологического материала (например, A.Lehninger, "Biochemistry", Worth Rublishers, N. J. 1972).

Способ является трудоемким, выход конечного продукта составляет 20-60% процесс отделения конечного продукта от множества молекулярных примесей, содержащихся в биологическом материале, сложен, из-за чего в настоящее время применяется редко.

Известны способы получения пептидных продуктов синтезом из аминокислот или гидролизом из более длинных белковых и пептидных последовательностей под действием протеолитических ферментов (Структурные основы действия пептидных и белковых иммуномодуляторов /Под ред. Г. И. Чипенса, Рига. Зиматне, 1990; Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия, М. Просвещение, 1987).

Однако из-за сложности контроля направленности синтеза пептидной последовательности и сложной очистки конечного продукта от ферментов и сопутствующих примесных пептидов применение этих способов в настоящее время ограничено.

Известен способ получения пептидных и белковых продуктов с помощью генной инженерии (Алберт А. Брей Р. Дльюис Дж и др. Молекулярная биология. М. Мир, 1986). Способ заключается в направленном встраивании в геном клетки бактерии определенного гена, кодирующего синтез заданного пептида или белка. Модифицированная таким образом клетка начинает синтезировать необходимый конечный продукт.

Применение данного способа ограничено из-за трудоемкости технологического процесса, а также необходимости очистки конечных продуктов от сопутствующих биологических соединений, являющихся продуктами метаболизма бактерий.

Наиболее широко в настоящее время используется способ получения пептидов путем химического синтеза пептидной последовательности ("The peptides, Analysis, Synthesis, Biology". Edited by Erhard Gross, Johahnes Meienhofed", Academic Press", N. Y. San Franc. London, 1979). В основе способа лежит осуществление многократно повторяющихся химических реакций, при которых происходит процесс присоединения аминокислот к растущей пептидной цепи (Merrifield R. B. "Automated Synthesis of Peptides", Science, 1965, p. 150, 178-185).

Способ методически сложен, требует постоянного контроля за содержанием аминокислот в реакционной смеси. Необходимость проведения промежуточной очистки выделяемых из смеси синтезированных молекул промежуточных пептидов для последующего возврата их в реакционную смесь для дальнейшего синтеза приводит к значительному увеличению продолжительности процесса синтеза конечного продукта. В связи с тем, что применяемые в способе реактивы конденсирующие агенты, необходимые для осуществления реакций образования пептидных связей, могут реагировать и с группами аминокислот, находящихся в смеси, но не участвующих в образовании нужных пептидных связей, такие группы аминокислот химически "блокируют", а затем удаляют из реакционной смеси. По этим причинам описанный процесс синтеза пептидов является многостадийным: блокирование-конденсация-деблокирование, требует сложной технологической оснастки, трудоемок. В среднем синтез одной пептидной связи имеет продолжительность около 3 ч, а выход конечного продукта за один цикл составляет 50-90% от количества сухого вещества исходного продукта.

Известно устройство для синтеза пептидов путем химического синтеза пептидной последовательности, содержащее емкость для размещения раствора, снабженную средствами для подачи и отбора раствора аминокислот, дозированной подачи в раствор дополнительно компонентов, необходимых для осуществления направленного синтеза, и средством обеспечения фильтрации раствора в процессе синтеза ((Merrifield R. B. "Automated Synthesis of Peptides", Scince, 1965, p. 150, 178-185).

В основу изобретения положена задача создания в способе получения пептидов таких физико-химических условий, которые бы позволили увеличить количество свободных ионов аминокислот в реакционной смеси, повысить из активность и упорядочить движение для наиболее эффективного использования энергии синтеза, а также создание устройства для осуществления такого способа.

При создании способа получения пептидов был использован принцип избирательности управляемой дегидратации и активации молекул аминокислот в растворе при комбинированном воздействии на раствор электрическим и магнитным полями в условиях управляемого раствора.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения пептидов путем синтезирования из раствора, содержащего в качестве компонентов аминокислоты, предварительно по меньшей мере часть компонентов переводят в ионизированное состояние и затем раствор подвергают одновременному воздействию скрещенных между собой электрического поля и магнитного поля, имеющего однонаправленные постоянную и переменную магнитные составляющие, при этом частота переменной составляющей соответствует собственной частоте циклоидного движения компонентов раствора.

При этом перевод компонентов в ионизированное состояние осуществляют изменением pH раствора.

Поставленная задача решается также тем, что устройство для получения пептидов, содержащее емкость для размещения раствора, снабженную средством для подачи и отбора раствора, снабжено регулятором pH раствора и источником магнитного поля, образованного двумя охватывающими емкость и размещенными коаксиально одна в другой магнитными катушками, одна из которых соединена с источником постоянного, а другая с источником переменного тока, а внутри емкости установлены два подключенные к источнику тока электрода из биологически инертного материала и расположенные так, что создаваемые электрическое поле и магнитное поле сокращены между собой, и при этом емкость выполнена термостатируемой.

Для наилучшего понимания предлагаемого способа рассмотрим сначала вариант выполнения устройства, предлагаемого для его осуществления, которое поясняется чертежом.

Устройство для получения пептидов способом согласно изобретению содержит емкость 1 из биологически инертного материала, например пластмассы, для размещения исходного раствора, которая снабжена средством 2 для подачи раствора из соединенного с емкостью 1 резервуара 3 и средством 4 для отбора раствора из емкости 1, соединенного с резервуаром 5 конечного продукта. Средства 2 и 4 обеспечивают подачу и отбор раствора с помощью известных средств, например с помощью пневматического насоса.

Емкость 1 выполнена термостатируемой, например, путем размещения внутри корпуса емкости 1 термостата 6, например, с жидким теплоносителем, например водой, скорость подачи и температура которого регулируется блоком 7 управления.

В емкости 1 установлены датчик 8 pH раствора, соединенный с регулятором pH раствора, содержащим блок 9 управления и емкости 10 для кислоты и 11 для щелочи.

Емкость 1 помещена внутрь расположенных коаксиально одна в другой магнитных катушек 12 и 13 любой известной конструкции, магнитная катушка 12 подключена к источнику 14 постоянного тока, а магнитная катушка 13 к источнику 15 переменного тока.

Внутри емкости 1 установлены электроды 16 из биологически инертного материала, например золота или платины, подсоединенные к источнику 17 постоянного тока.

Взаимное расположение электродов 16 и магнитных катушек 12 и 13 обеспечивает направление векторов электрического и магнитного поля следующим образом: , что и создает эффект скрещенных между собой электрического и результирующего магнитного полей.

Для исключения внешнего воздействия на исходный раствор устройство может быть окружено защитным экраном 18, выполненным, например, из пермаллоя.

Для обеспечения синхронной работы устройства по заданной программе управление устройством может быть автоматизировано.

Предлагаемый способ получения пептидов осуществляется в предлагаемом устройстве следующим образом.

В емкость 1 подают исходный раствор, содержащий в качестве компонентов аминокислоты, подобранные в зависимости от требуемого конечного продукта.

Исходный раствор в емкости 1 подогревается до температуры, необходимой для начала процесса ионизации аминокислот.

В исходном растворе регулируемой подачей кислоты и щелочи из резервуаров 3 и 5 устанавливается pH, необходимый для перевода в ионизированное состояние аминокислот, используемых для синтеза начальной пары заданной пептидной последовательности.

Для исключения внесения в конечный продукт дополнительных органических примесей, при регулировании pH раствора используют неорганические кислоту и щелочь, например соляную кислоту и едкий натр.

Затем создают электрическое поле подачей тока на электроды 16 внутри емкости 1 и создают постоянное и переменное магнитное поле подачей постоянного и переменного тока на катушки 12 и 13.

Частота переменной составляющей магнитного поля задается соответствующей частоте циклоидного движения первоначально синтезируемых молекул компонентов раствора.

Раствор подвергается воздействию этих полей в течение 15 мин, после чего измеряют pH раствора и измеряют его подачей в раствор необходимой дозы кислоты или щелочи, обеспечивая создание pH, необходимого для синтеза следующего компонента.

Затем раствор опять подвергают воздействию электрического и магнитного полей, вводя в частоту переменной составляющей магнитного поля гармоники частоты собственного циклоидного движения молекул присоединяемого компонента.

Процесс продолжают вышеописанным образом до получения заданных синтезированных продуктов пептидов заданной пептидной последовательности.

Известно, что уровень напряженности электрического поля не должен превышать величин, при которых происходит изоляция электродов в растворе слоем окружающих его ионов растворителя-противоионов, препятствующих движению ионов растворенных компонентов, в нашем случае аминокислот, в растворе между электродами.

Например, для применяемых в способе электродов из платины или золота уровень напряженности электрического поля составляет от 0,1 до 10 В/м.

Известно, что в магнитном поле при величине индукции постоянного магнитного поля ниже 10 μT циклоидное движение ионов аминокислот имеет неустойчивый характер с большими радиусами вращательной составляющей движения, что увеличивает вероятность хаотичного поведения молекулы в растворе. При величине выше 100 μT процессы диссипации (рассеивания) энергии при движении ионов в растворе усиливаются быстрее, чем процессы поглощения молекулами энергии электромагнитного поля, необходимой для синтеза, поэтому в способе оптимально диапазон величины индукции B₀ выбран в пределах от 10 до 100 μT.

Величина индукции переменного магнитного поля составляет от 10 до 200 нТ, и при этом электрический сигнал переменного тока, создающий переменное магнитное поле, должен содержать частотные гармоники, соответствующие собственным циклоидным частотам ионизированных молекул компонентов раствора, участвующих в реакции. Определение значений циклоидных частот осуществляется по известной формуле где q и m заряд и масса иона компонента; B₀ индукция постоянного магнитного поля.

Сочетание одновременного воздействия вышеописанных полей на компоненты раствора с подогревом и ионизацией раствора создает наиболее благоприятные условия для протекания процесса образования пептидных связей.

Экспериментально установлено, что время такого воздействия на аминокислоты для синтезирования пептида должно составлять не менее 15 мин.

Для синтезирования более крупных молекул пептидов время воздействия электрическим и магнитным полями увеличивают, предварительно переводя последовательно присоединяемые компоненты в ионизированное состояние путем изменения pH раствора, и добавляют в электрический сигнал, подаваемый на катушку переменного магнитного поля, частотную гармонику, соответствующую собственной циклоидной частоте присоединяемого компонента.

По окончании процесса синтеза раствор охлаждают и с помощью устройства, имеющегося в емкости, отбирают конечный продукт.

Количественные и качественные характеристики конечного продукта определяют с помощью химического и физического пептидов по их видам на основе данных замеренной оптической плотности пептида, а также известными методами определения количества сухого вещества.

Такое осуществление способа получения пептидов позволяет увеличить количество свободных ионов аминокислот в растворе, активизировать их для наиболее эффективного синтеза, а также за счет упорядочения движения молекул компонентов в растворе снизить потери энергии системы.

Способ является одностадийным, не требует промежуточной очистки компонентов раствора от примесей. Количество примесей в конечном продукте невелико. Выход конечного продукта составляет 60-92% от сухого вещества исходного продукта. Продолжительность одного цикла получения пептидов составляет около 20 мин.

Пример 1. Получение пептида NH₂ глутаминовая кислота триптофан (тимоген).

Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали раствор аминокислот глутаминовой кислоты (Glu) и триптофана (Try) в дистиллированной воде: по 2·10^-5M сухого вещества каждой аминокислоты в 10 мл воды.

pH раствора смещали в кислую сторону до pH 3,9, затем раствор емкости подогревали до 35^oC.

Создавали электрическое поле подачей тока на пластинчатые электроды, напряженность поля E 0,1 B/м.

Создавали постоянное магнитное поле с индукцией B₀=30 μT и переменное магнитное поле с индукцией B_n=25 нT. Направление векторов Электрический сигнал, создающий переменное магнитное поле, содержал гармоники частот 3, 11 и 2,33 Гц, соответствующих собственным частотам ν_ц циклического движения ионизированных молекул аминокислот Glu^- и Try-⁺, рассчитанным по приведенной ранее формуле.

Раствор подвергали одновременному воздействию электрическим и магнитным полем в течение 10 мин, затем за 10 мин снижали температуру раствора с 35 до 10^oC, и конечный продукт синтеза подвергали химическому анализу.

Проводили разделение синтезированных пептидов на установке HPLC фирмы LKB-Pharmacia (Швеция) на колонке Ultrashere OCTYL, 250x4,6 мм 5μ, P/N 235332, S/N 7UEON494 с помощью элюентов A и B: элюент A 2,0 мМ TEA-phosph, элюент B Acetonitril с градиентом подачи 10% B + 1% мин.

На колонку наносили по 50 mл конечного продукта, затем проводили регистрацию оптической плотности элюента с помощью ультразвукового детектора Uvicord SD-2158 при 220 нм.

В качестве эталона для сравнения использовали пептид тимоген производства фирмы "Пептос Россия".

Результаты исследований показали, что синтезирован дипептид-тимоген и выход тимогена составил 60% сухого вещества пептида относительно первоначального количества сухого вещества компонентов в исходном растворе. Общая продолжительность процесса 20 мин.

Пример 2. Получение пептида NH₂ аспарагиновая кислота - аспарагин Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали эквимолярный раствор аспарагина (ASP^-) и аспарагиновой кислоты (Asn⁺) в дистиллированной воде: по 2,27 М сухого вещества каждого компонента раствора в 10 мл воды.

pH раствора смещали до 3,2, затем раствор подогревали до 30^oC.

Создавали электрическое поле напряженностью E 0,5 В/м.

Создавали постоянное магнитное поле с индукцией B₀ 30 μT и переменное магнитное поле с индукцией B_n=25 нТ.

Электрический сигнал, создающий переменное магнитное поле, содержал две гармоники частот 3,50 и 3,53 Гц, соответствующих собственным частотам ν_ц циклоидного движения ионизированных молекул Asp^- и Asp^- и Asn⁺.

Подвергали раствор одновременному воздействию электрическим и магнитным полем в течение 15 мин, затем снижали за 8 мин температуру в емкости 1 с 30 до 10^oC и продукт синтеза подвергали химическому анализу.

Проводили разделение синтезированных пептидов аналогично описанному в примере 1 на колонке Nucleosyl C₁₈, 3 м 100x4,6 мм с помощью элюента QA состава H₂O 5% + Acetonitril + 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК) и элюента B состава Acetonitril + 0,1% ТФК с градиентом подачи 5% B + 2,83/мин. В течение 7,5 мин элюеция проходила без градиента, затем до 37,5 мин - с градиентом B.

На колонку наносили по 50 мл сконцентрированной после гель-хроматографии в 10 раз обессоленной фракции исходного компонента. Регистрацию оптической плотности элюента проводили аналогично описанной в примере 1.

В качестве эталона для сравнения использовали пептид аспарагиновая кислота-аспарагин, полученный описанным ранее химическим синтезом. Результаты исследований показали, что синтезирован пептид аспарагиновая кислота-аспарагин, выход конечного продукта составил 70% от количества сухого вещества исходных компонентов в исходном растворе. Общая продолжительность процесса 23 мин.

Пример 3. Получение трипептида NH₂-глутаминовая кислота-аргинин-триптофан Для синтеза трипептида в качестве исходного продукта использовали 10 мл эквимолярного раствора, содержащего по 2·10^-5M глутаминовой кислоты (Glu), аргинина (Arg) и триптофана (Try) в дистиллированной воде. Для ионизации Glu и Arg pH смещали до 6,0. Создавали электрическое поле напряженностью E 0,5 B/м. Создавали постоянное поле с индукцией B₀ 42,1 μT и переменное магнитное поле с индукцией B_n 25 нТ. Электрический сигнал, создающий переменное магнитное поле, содержал две гармоники частотой 3,39 и 4,42 Гц, соответствующие собственным частотам ν_ц ионов Glu^- и Arg⁺.

Подвергали раствор одновременному воздействию электрического и магнитного полей в течение 15 мин, затем изменяли pH раствора до 4,0 для перевода в ионизированное состояние молекул Try и продолжали воздействие переменным магнитным полем.

В электрический сигнал, создающий переменное магнитное поле, добавляли гармонику частотой 3,14 Гц, соответствующей собственной частоте ν_ц циклоидного движения ионизированных молекул Try.

Воздействие электрическим и магнитным полем продолжали еще 15 мин, после чего снижали температуру раствора с 30 до 10^oC за 8 мин и продукт синтеза подвергали химическому анализу.

Разделение синтезированных пептидов проводили аналогично описанному в примере 1 с помощью элюентов A и B, где A H₂O+5% Acetonitril+0,1% ТФК; B Acetonitril + 0,1% ТФК с градиентом подачи 99,9% Acetonitril + 2,83/мин.

500 μл конечного продукта упаривали до 50 μл и наносили на колонку. Регистрацию оптической плотности элюента проводили аналогично описанной в примере 1. В качестве эталона для сравнения использовали трипептид Glu-Arg-Try, полученный известным химическим способом. Результаты исследований показали, что синтезирован трипептид, соответствующий принятому за эталон трипептиду. Выход конечного продукта составил 60% от количества сухого вещества исходных компонентов, общая продолжительность процесса 38 мин.

Пример 4. Получение тетрапептида аргинин-лизин-глутаминовая кислота - триптофан Arg-Lys-Glu-Try Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали два пептида Arg-Lys и Glu-Try в эквимолярных концентрациях по 3·10^-3 μ /л (в 10 мл воды по 3·10^-5М каждого пептида). pH раствора смещали до 7,0, раствор подогревали до 30^oC.

Создавали электрическое поле напряженностью E=2 B/м, постоянное магнитное поле с индукцией B₀ 42,1 mT и переменное магнитное поле с индукцией B_n 25 нТ. В электрический сигнал, формирующий переменное магнитное поле, вводили гармоники частот 1,83 и 2,01 Гц.

Подвергали раствор одновременному воздействию электрического и магнитного полей в течение 15 мин.

Затем раствор охлаждали до 10^oC за 8 мин и продукт синтеза подвергали химическому анализу, аналогично описанному в примере 1. Результаты исследований показали, что синтезирован тетрапептид Arg-Lys-Glu-Try. Выход конечного продукта составил 61% от количества сухого вещества исходных компонентов, продолжительность процесса 23 мин.

Вышеописанные варианты осуществления изобретения являются наилучшими для их промышленной реализации, однако любому сведущему в этой области специалисту ясно, что в них могут быть внесены различные усовершенствования и модификации в пределах объема пунктов формулы изобретения.

Пример 5. Получение пептида NH₂-Cys-Ser Для синтеза пептида в качестве исходного продукта использовали эксимолярный раствор аминокислот Cys и Ser в фосфатном буфере: по 4·10^-5М сухого вещества каждой аминокислоты в 10 мл буфера.

pH раствора 5,5, затем раствор подогревали до 30^oC. Создавали электрическое поле напряженностью E 2 B/м, создавали постоянное магнитное поле с индукцией B₀ 30 μT и переменное магнитное поле с индукцией B_n 30 нТ.

Электрический сигнал, создающий B_n, содержал две частотные гармоники 3,78 и 4,28 Гц, соответствующие собственным частотам V_ц циклоидного движения ионизированных молекул Сys^- и Ser⁺.

Подвергали раствор одновременному воздействию электрическим и магнитным полем в течение 40 мин, затем снижали за 10 мин температуру в емкости 1 с 30 до 6^oC и продукт синтеза подвергали химическому анализу.

Проводили разделение синтезированных пептидов на установке HPLC фирмы LKB-Pharmacia (Швеция) на колонке Nucleosyl 5 М, 100x4,6 мм с помощью элюентов A и B: элюент A H₂O + 5% Acetonitril + 0,1% ТФК; B Acetonitril + 0,1% ТФК с градиентом подачи 5% B + 2,83/мин.

В качестве эталона для сравнения использовали пептид Cys-Ser, полученные известным химическим способом.

Результаты исследований показали, что синтезирован дипептид Cys-Ser. Выход конечного продукта составил 24% от количества сухого вещества исходных компонентов.

Пример 6. Пример осуществляли при граничных и средних значениях интервалов величин действующих факторов при синтезе пептида тимоген, описанного в примере 1:
при величине напряженности электрического поля E=10 B/м, величине индукции магнитного поля B₀ 10 μT и переменного поля B_n 10 нТ; в качестве исходных компонентов использовали раствор аминокислот - глутаминовая (Glu) и триптофан (Tuh) в дистиллированной воде: по 2·10^-5М сухого вещества каждой аминокислоты в 10 мл воды, pH 3,9; конструкция аминокислот, pH и температурный режим идентичны описанным в примере 1;
при величине E=10 B/м; B₀ 100 μT и B_n 200 нТ выход тимогена составил 4%
при величине E=5 B/м; B₀ 50 μT и B_n 100 нТ выход тимогена составил 52%

Формула изобретения

1. Способ получения пептидов путем синтезирования из раствора, содержащего в качестве компонентов аминокислоты, отличающийся тем, что предварительно по меньшей мере часть компонентов переводят в ионизированное состояние и затем раствор подвергают одновременному воздействию скрещенных между собой электрического поля и магнитного поля, имеющего однонаправленные постоянную и переменную магнитные составляющие, при этом частота переменной составляющей соответствует собственной частоте циклоидного движения компонентов раствора.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перевод компонентов в ионизированное состояние осуществляют изменением рН раствора.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что величину напряженности электрического поля выбирают в диапазоне 0,1 10,0 В/м, величину индукции постоянного магнитного поля выбирают в диапазоне 10 100 мкТ, а величину индукции переменного магнитного поля в диапазоне 10 200 нТ.

4. Устройство для получения пептидов, содержащее емкость для размещения раствора, снабженную средством для подачи и отбора раствора, отличающееся тем, что оно снабжено регулятором рН раствора и источником магнитного поля, образованного двумя охватывающими емкость и размещенными коаксиально одна в другой магнитными катушками, одна из которых соединена с источником постоянного, а другая с источником переменного тока, а внутри емкости установлены подключенные к источнику постоянного тока электроды из биологически инертного материала, расположенные так, что создаваемые электрическое поле и магнитное поле скрещены между собой, при этом емкость выполнена термостатируемой.

РИСУНКИ

Рисунок 1