Способ получения антипрокоагулянтного препарата из медицинских пиявок

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ. Препарат из медицинской пиявки обладает антитромбиновой активностью, удлиняет время рекальцификации плазмы, а также блокирует агрегацию и адгезию тромбоцитов за счет пиявочных простагландинов, подобных простациклину. Способ заключается в замораживании пиявок, лиофилизации с последующим измельчением, разбавлении водой, подкислением до pH 5,8 - 7,0, прогревании на кипящей водяной бане 3 - 15 мин с последующим собиранием фильтрата. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ.

Известен способ получения препарата из медицинской пиявки, обладающего антитромботическим, тромболитическим и антиатеросклеротическим действием, взятый в качестве прототипа.

Но препарат обладает следующими недостатками: при ряде заболеваний может оказать отрицательное действие. Это прежде всего заболевания, связанные с риском тромбообразования (гипотенция, различные оперативные вмешательства, тромбоцитопения и др.), он содержит балластные вещества, ограничивающие растворимость препарата (максимальная растворимость по белку 50 мг/мл).

Цель предлагаемого способа получение препарата, обладающего профилактическим противотромботическим действием.

Поставленная цель достигается тем, что полученный гомогенат пиявок разбавляют водой, подкисляют до pH 5,8 7.0, прогревают на кипящей бане в течение 3 15 мин, после чего собирают фильтрат.

Способ осуществляют следующим образом.

Пиявок промывают, замораживают при температуре не ниже -15^o, лиофилизуют, размалывают в порошок. После этого порошок разбавляют водой, подкисляют до значения pH 5,8 7,0, прогревают в кипящей бане в течение 3 - 15 мин, затем собирают надосадочную жидкость.

Полученный препарат обладает антитромбиновой активностью, обеспечиваемой гирудином, удлиняет время рекальцификации плазмы крови, обусловленной ингибитором калликреина плазмы крови, а также блокирует агрегацию и адгезию тромбоцитов за счет пиявочных простагландинов, подобных простациклину.

Эти свойства препарата определяют его противотромботическое действие, которое больше, чем у препарата-прототипа, в среднем в 6 раз.

Способы определения: 1. Антитромбиновая активность определяется по удлинению времени свертывания фибриногена тромбином. Определяют время образования сгустка в системе, состоящей из 0,2 мл 0,3% раствора фибриногена и 0,1 мл анализируемого препарата после добавления 0,1 мл тромбина, содержащего 1 тромбиновую единицу. Активность гирудина выражают в антитромбиновых единицах (АТЕ).

2. Время рекальцификации плазмы крови определяют в системе, содержащей 0,1 мл цитратной плазмы крови и 0,1 мл анализируемого препарата после добавления 0,1 мл 0,025 М раствора CaCl₂. Отмечают время образования сгустка. Удлинение времени образования сгустка в присутствии АПК выражают в антипрокоагулянтных единицах (АПКЕ), т.е. время рекальцификации в опыте делят на время рекальцификации в контроле (равный объем физиологического раствора).

3. Содержание простагландинов определяют используя набор реактивов и пропись фирмы "Amersham" (Англия) для радиоиммунологического анализа 6-Keto-PGF/альфа.

4. Противотромботическое действие АПК определяют на крысах с использованием метода тромбообразования в изолированном участке вены по Весслеру (Vessler, et. al.).

Степень блокады тромбообразования оценивали при интервале между введением раствора АПК и активированной стеклом сыворотки крови человека, составляющем 4 ч. Степень блокады тромбообразования выражали в относительно контроля (введение крысам равного объема физиологического раствора).

Пример 1. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Тестируют активность этого раствора (см. таблицу). Подкисляют раствор концентрированной муравьиной кислотой до значения pH 6,0. Затем прогревают в кипящей бане в течение 10 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость тестируют (см. таблицу). Как видно из таблицы, полученный АПК обладает высокой антитромбиновой активностью, превышающей исходную в 60 раз; значительно возросла активность ингибитора калликреина (в 60 раз) и возросло содержание простагландинов относительно исходного раствора. Сочетание этих активностей приводит к полному (100% ) блокированию тромбообразования в экспериментах на животных.

Пример 2. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Подкисляют его 0,1 н HCl до значения pH 5,4. Выпал осадок, т.е. произошло перераспределение активности между водной фазой и осадком, прогревают 5 мин. По данным таблицы видно, что препарат не соответствует целевому продукту.

Пример 3. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Снижают значение pH до 7,2, используя 0,1н HCl. Затем прогревают 5 мин в кипящей бане. Осадок не образовался. Значения активностей не превышают исходные (см. таблицу).

Пример 4. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Подкисляют до значения pH 6,0 концентрированной муравьиной кислотой. Затем в течение 2 мин прогревают в кипящей бане. Осадок не образовался. Полученный препарат по активности соответствует исходному (см. таблицу).

Пример 5. Готовят водный раствор препарата-прототипа. Доводят значение pH до 6,0 0,1н HCl. Прогревают в кипящей бане в течение 18 мин. Из таблицы видно, что в результате продолжительного прогревания произошла денатурация белковых компонентов исходного раствора.

Формула изобретения

Способ получения антипрокоагулянтного препарата из медицинских пиявок, включающий замораживание пиявок, лиофилизацию с последующим измельчением, отличающийся тем, что полученный порошок разбавляют водой, подкисляют до pH 5,8 7,0, прогревают на кипящей водяной бане в течение 3 15 мин, после чего собирают фильтрат.

РИСУНКИ

Рисунок 1