Способ получения состава для моделирования афтозного стоматита у животных

 

Способ может быть использован для изучения этиологии и потогенеза заболеваний слизистой оболочки полости рта. Получают гомогенат гомологичной ткани слизистой оболочки полости рта животных и смешивают ее в соотношении 1:1 со стимулятором. Стимулятор состоит из вазелинового масла, ланолина и автоклавированной сухой вакцины ВЦЖ. Гомогенат перед смешиванием со стимулятором подвергают двукратному центрифугированию с последующими периодами отстоя. После первого периода отстоя удаляют верхнюю прозрачную фракцию гомогената. Оставшийся состав повторно центрифугируют и отстаивают. После чего верхнюю фракцию отделяют и смешивают со стимулятором, в который предварительно добавляют автоклавированную высушенную нижнюю фракцию гомологичной ткани. Первое и второе центрифугирование проводят при различных частотах вращения. 3 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и может быть использовано при получении состава для моделирования стоматита у животных с целью изучения этиологии и патогенеза заболеваний слизистой оболочки полости рта.

Известен способ моделирования поражения слизистой оболочки полости рта у животных путем 3-4 кратного ежедневного подкожного введения четыреххлористого углерода в дозе 0,5 мл/кг [1]. Однако, при использовании четыреххлористого углерода, заболевание слизистой оболочки воспроизводится лишь на фоне общей патологии всего организма. Элементы поражения по своим морфологическим проявлениям нетипичным для афтозного стоматита у человека.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения антигенной смеси для моделирования стоматита [2], который выбран за прототип. Согласно этому способу состав для провокации афтозного стоматита у животных (антигенную смесь) получают следующим образом. Берут слизистую оболочку полости рта от свежезабитых крыс, часть ее смешивают с равным количеством физиологического раствора и измельчают эту смесь в гомогенизаторе. Оставшуюся часть гомологической ткани автоклавируют. Готовят стимулятор, состоящий из стерильного вазелинового масла и ланолина (в соотношении 2:1), к которому добавляют автоклавированную сухую вакцину БЦЖ из расчета 5 мг вакцины на 1 мл стимулятора. В подготовленный таким образом стимулятор добавляют автоклавированную гомологическую ткань из расчета 1% от объема стимулятора. Подготовленный таким образом гомогенат и стимулятор смешивают в соотношении 1:1 и получают антигенную смесь, которую в количестве 1 мл вводят подкожно в 4-5 различных точек живота крыс. Повторную иммунизацию проводят через 8 суток антигенным составом, приготовленным аналогичным способом. Отчетливое поражение полости рта у животных наступает на 30-35 день эксперимента. При этом, выход зараженных животных составляет в среднем 50-65%.

Недостатком состава, полученного известным способом является отсутствие стабильности в показателях по количеству животных с афтозными проявлениями в полости рта, их малый процент, а также длительность скрытого периода.

Задача, на решение которой направлен предлагаемый способ, - устранение указанных недостатков, а именно, повышение стабильного количества животных с афтозными проявлениями в полости рта, а также сокращение сроков эксперимента за счет уменьшения скрытого периода.

Поставленная цель достигается способом получения состава для моделирования афтозного стоматита у животных, включающим получение гомологичной ткани слизистой оболочки полости рта животных, смешивание ее с равным количеством физиологического раствора, измельчение этой смеси в гомогенизаторе с последующим смешиванием гомогената в соотношении 1:1 со стимулятором, состоящим из вазелинового масла, ланолина (в соотношении 2:1) и автоклавированной сухой вакцины БЦЖ 0,005 г на 1 мл стимулятора), в котором, в отличие от прототипа, гомогенат перед смешиванием со стимулятором подвергают двукратному центрифугированию с последующими периодами отстоя, причем после первого периода отстоя уделяют верхнюю прозрачную фракцию гомогената, оставшийся состав повторно центрифугируют и отстаивают, после чего верхнюю фракцию отделяют и смешивают со стимулятором, в который предварительно добавлена атоклавированная высушенная нижняя фракция гомологичной ткани, в количестве 2% от объема стимулятора.

Кроме того, поставленная цель достигается способом, при котором первое центрифугирование проводят при частоте вращения 17 тысяч об/мин, а второе - при 6 тысячах об/мин.

Поставленная цель достигается также тем, что первое центрифугирование проводят в течение 30 мин при 4^oС, а второе - в течение 15 мин при той же температуре.

Cпособ осуществляется следующим образом. Получают гомологичную ткань слизистой оболочки полости рта от свежезабитых крыс, добавляют к этой массе физиологический раствор и измельчают ее в гомогенизаторе. Полученные гомогенат подвергают первичному центрифугированию при температуре 4^oС, частоте вращения 17 тыс. об/мин в течение 30 мин, после чего дают смеси отстояться. В процессе отстоя происходит разделение смеси на две фракции: верхнюю прозрачную и нижнюю, представляющую собой суспензию. Верхнюю фракцию удаляют. Анализ показал, что количество белка в ней 3,3 мг/мл. Далее проводят повторное центрифугирование оставшейся суспензии гомологичной ткани в течение 15 мин при той же температуре. При этом, частота вращения составляет 6 тыс. об/мин. После повторного центрифугирования снова дают смеси отстояться. В процессе отстоя смесь вновь разделяется на две фракции: верхнюю, представляющую собой суспензию и нижнюю, представляющую собой густую массу с большим количеством остаточной ткани. Анализ верхней фракции показал, что количество белка в ней составляет 4,42 мг/мл. Именно эту фракцию используют для смешивания со стимулятором, в соотношении 1:1. Стимулятор представляет собой смесь стерильного вазелинового масла, ланолина и автоклавированной сухой вакцины БЦЖ. Для повышения антигенных свойств полученного состава нижнюю фракцию высушивают, автоклавируют и добавляют к стимулятору.

С целью проверки эффективности полученного состава для моделирования афтозного стоматита у животных была проведена серия опытов на животных (крысах).

Пример. Для проведения опытов на 100 крысами необходимо сепарировать слизистую оболочку полости рта у 60 свежезабитых крыс, что позволит получить 30 г гомологичной ткани, которую смешивают с 30 г физиологического раствора и измельчают в гомогенизаторе. Полученный гомогенат центрифугируют в течение 30 мин при температуре 4^oС и частоте вращения 17 тыс. об/мин. Дают смеси отстояться в течение 5 мин. В процессе отстоя смесь разделяется на две явно выраженные фракции: верхнюю прозрачную и нижнюю, представляющую собой суспензию. Верхнюю фракцию удаляют. Вес удаленной фракции составляет 10 г. Оставшиеся 50 г суспензии подвергают повторному центрифугированию в течение 15 мин при той же температуре и частоте вращения 6 тыс. об/мин, после чего вновь дают смеси отстояться. В процессе отстоя смесь разделяется на две явно выраженные фракции: верхнюю, представляющую собой суспензию и нижнюю, представляющую собой осадок с большим количеством остаточной ткани. Фракции разделяют между собой. Количество верхней фракции составил около 41 мл, а нижней - около 9 мл. Анализ показал, что количество белка в верхней фракции составляет 4,42 мг/мл. Нижнюю фракцию высушивают и автоклавируют. Для приготовления стимулятора используют стерильное вазелиновое масло и ланолин в соотношении 2:1. К 40 мл этой смеси добавляют 0,2 г автоклавированной сухой вакцины БЦЖ (0,005 г на 1 мл стимулятора) и высушенную автоклавированную нижнюю фракцию гомологичной ткани. Многократные опыты показали, что вес высушенной нижней фракции составляет около 0,8-0,9 г. Приготовленный таким образом стимулятор количеством около 41 мл смешивают с суспензией, полученной после вторичного центрифугирования в соотношении 1:1. Получается 81-82 мл готового состава.

Для проверки его эффективности вводили полученный состав в количестве 0,8 мл подкожно в 4-5 различных точек живота крыс. Повторную иммунизацию проводили через 8 сут, при этом для приготовления антигенной смеси используют описанный выше способ.

Выраженные поражения слизистой оболочки полости рта наблюдались у 85% животных на 23-25 день с момента первого введения вещества.

При этом имеет место изолированное поражение слизистой оболочки полости рта у животного, не отягощенное какой-либо другой патологией и имеющее конкретную, а именно аутоиммунную основу. По своим патоморфологическим проявлениям моделируемое у крыс поражение напоминает хронический афтозный стоматит у человека.

Формула изобретения

1. Способ получения состава для моделирования афтозного стоматита у животных, включающий получение гомологичной ткани слизистой оболочки полости рта животных, смешивание ее с равным количеством физиологического раствора, измельчение в гомогенизаторе с последующим смешиванием гомогената в соотношении 1 1 со стимулятором, состоящим из вазелинового масла, ланолина (в соотношении 2 1) и автоклавированной сухой вакцины БЦЖ (0,005 г на 1 мл стимулятора), отличающийся тем, что гомогенат перед смешиванием со стимулятором подвергают двукратному центрифугированию с последующими периодами отстоя, причем после первого периода отстоя удаляют верхнюю прозрачную фракцию гомогената, оставшийся состав повторно центрифугируют и отстаивают, после чего верхнюю фракцию отделяют и смешивают со стимулятором, в который предварительно добавлена автоклавированная высушенная нижняя фракция гомологичной ткани.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество автоклавированной высушенной нижней фракции гомологичной ткани составляет 2% от объема стимулятора.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первое центрифугирование проводят при частоте вращения 17000 мин^-1, а второе при 6000 мин^-1.

4. Способ по каждому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что первое центрифугирование проводят в течение 30 мин при температуре 4^oС, а второе в течение 15 мин при той же температуре.