Рекомбинантный интерлейкин 2 человека


C07K1/20 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение
C07K1/14 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

 

Использование: медицина, научно-исследовательская практика. Сущность изобретения: из "тел включения", образующихся в результате экспрессии в бактериальных клетках рекомбинантного вектора, содержащего нативный ген ИЛ2 человека, путем солюбилизации в восстанавливающей среде с хаотропным агентом и последующей очистки при помощи осаждения, высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (ОФ-ВЭЖХ) и использованием кислого элюанта, разведения ИЛ2-содержащей фракции кислой средой и повторной ОФ-ВЭЖХ в кислой среде получен рекомбинатный ИЛ2 человека с аминокислотной последовательностью природной формы, но содержащий в положениях 58, 105 и 125 восстановленные цистеиновые остатки и обладающий при этом удельной активностью по меньшей мере 0,5 107 E/мг. 1 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл.

Данное изобретение касается биологически активного негликозилированного рекомбинантного человеческого интерлецкина-2 (называемого р-чИЛ2) в восстановленном виде.

Натуральный человеческий ИЛ2, которым является лимфокин, стимулирующий размножение активированных клеток Т, имеет три цистеина, находящихся в положениях 58, 105 и 125 последовательности аминокислот протеина. Цистеины в положениях 58 и 105 соединены между собой дисульфидным мостиком, а цистеин в положении 125 имеет свободную сульфгидрильную группировку (Robb, R.J и сотр. Proc. Natl. Acad. Sci USA. (1984) 81-6486-6490).

Способы получения человеческого ИЛ2 или его производных путем технологии рекомбинантного ДНК уже описаны. Например, Taniguchi, T и сотр. Nature (1983) 302 305-310 и Devos, R и сотр. Nucleic Acids Research (1983) 11 4307-4323, описывают клонирование гена человеческого ИЛ2 и его экспрессию в микроорганизмах, а Ju, C и сотр. J. Brol. Chem (1987) 262 5723-5731 получили экспрессию рекомбинантных производных ИЛ2. С другой стороны, известно, что когда ИЛ2 накапливается в микроорганизме в виде нерастворимых гранул, то он находится в восстановленной форме, содержащей 3 тиольных группы, и лишен активности (заявка на японский патент Я6 1257931). Поэтому считалось, что для того, чтобы получить активный ИЛ2, надо было прибегнуть к окислению восстановленного протеина, находящегося в гранулах. Для этого после растворения протеина в денатурирующей среде образование дисульфидного мостика 58-105, которое требуется для ренатурации, осуществляли в контролируемой окисляющей среде. Описаны различные способы окисления, такие как окисление только кислородом (самоокисление воздухом) или в присутствии ионов двухвалентной меди, или окисление слабым окислителем, таким как тиол, или же окисление смесью тиол - дисульфид (Tsuji, T. и сотр. Biochemistry (1987) 26 3129-3134).

После окислительной ренатурации необходимо проводить очистку хроматографией для удаления продуктов окисления, соответствующих образованию изомерных внутримолекулярных мостиков 58-125 и 105-125, а также межмолекулярных мостиков, неактивность которых была доказана экспериментом и которые могут быть разделены хроматографией с обратной фазой согласно Wang. A и сотр. Science (1984) 224 1431-1433 или Browing J.L и сотр. Anal Biochem (1986) 155 123-128.

Получение окисленного гомогенного рекомбинатного ИЛ2, имеющего подходящую биологическую активность, исходя из протеина, накопленного в виде гранул, выдвигает технические проблемы в независимости от употребляемого способа, так как оно требует нескольких стадий очистки, что проводит к понижению выхода целевого продукта.

Заявителем разработан новый интерлейкин-2 человека, для получения которого не требуется стадии повторного окисления.

Таким образом, изобретение касается получения негликозилированного рекомбинантного человеческого интерлейкина 2, имеющего, с одной стороны, следующую последовательность аминокислот: а также аллели и производные этой последовательности, где X - метионин или атом водорода и где три цистеина в положении 58, 105 и 125 находятся в восстановленном виде, а с другой стороны, проявляющего биологическую активность, сравнимую с активностью окисленного ИЛ2 с той же последовательностью и содержащего дисульфидный мостик в положении 58-105.

Аллели и производные включают последовательности, модифицированные заменой, делецией или вставкой одной или нескольких аминокислот, других чем цистеины 58, 105, 125, таким образом, эти продукты сохраняют биологическую активность, характерную для восстановленного ИЛ2. Осуществление таких модификаций хорошо известно в технологии рекомбинантной ДНК, например, методами направленного мутагенеза, которые перечислены Lather, R.F и Lecog, J.P в журнале Genetic Engineering Acad Press (1983) 31-50 или Smith, M и G.Mam.S Genetic Engineering Principles and Methods Plenum Press (1981) 31-32. Под восстановленной формой подразумевают, что остатки цистеинов, которые принадлежат ИЛ2, содержат свободную сульфгидрильную группировку, наличие которой определяется, например, спектрофотометрически с дитиодипиридином в качестве тиольного реактива. Биологическая активность восстановленной формы, полученной по изобретению, определяется сравнительно с соответствующей окисленной формой, содержащей дисульфидный мостик 58-105, путем измерения размножения лейкемических клеточных линий СТЛЛ-2 мышей, зависимых от ИЛ2, при помощи колориметрического теста с солью тетразолия (Mossmann. T.J.Immunol Meth. (1983) 65 55-63).

Изобретение относится к способу получения негликозилированного рекомбинантного ИЛ2 человека, имеющего, с одной стороны, следующую последовательность аминокислот: а также аллели или производные этой последовательности, где X - метионин или атом водорода и три цистеина которой в положении 58, 105 и 125 находятся в восстановленной форме, а с другой стороны, проявляющего биологическую активность по меньшей мере 0,5 107 E/мг. Единица активности ИЛ2 определяется как количество, которое дает 50% максимального ответа в опыте. В качестве эталона употребляют образец Biological Response Modifier Program (BRMP) reference Reagent human IL2 (Jurkat), поставляемый National Cancer. Institute (NCI).

Более конкретно изобретение относится к получению негликозилированного рекомбинантного интерлейкина-2 человека, имеющего следующую последовательность аминокислот: где X - метионин или атом водорода и три цистеина которой в положении 58, 105 и 125 находятся в восстановленной форме, и проявляющего биологическую активность, сравнимую с активностью природного ИЛ2 человека.

Под сравнимой активностью подразумевают такую же специфическую активность, что у природного ИЛ2, выделенного из лейкемических клеток Jurkat, т.е. 1,3 107 E/мг (ссылка ВРМР), или активность, различающуюся максимум на 25% от этой специфической активности.

Последовательность восстановленного ИЛ2 согласно изобретению может содержать дополнительный N-концевой метионин в зависимости от трансформированного микроорганизма, такого как E.coli, в котором он экспрессирован. В предпочтительном варианте выполнения способа предпочитают последовательность, содержащую метионин, но можно также употреблять смесь продукта, содержащего метионин, с продуктом, не содержащим метионин, или продукт, не содержащий метионин.

Способ получения негликозилированного рекомбинатного восстановленного ИЛ2 человека включает извлечение ИЛ2, накопленного в виде гранул в микроорганизме, трансформированном растворением в восстановительной среде при помощи хоатропного агента, а затем очистку осаждением с последующей жидкостной высокоэффективной хроматографией с обратной фазой при помощи кислого элюента, затем по желанию главную элюированную фракцию хроматографии подвергают охлаждению до температуры порядка -20oC, а затем отделяют водную фазу, которую разбавляют в кислой среде, а затем хроматографируют на другой колонке жидкостной высокоэффективной хроматографии с обратной фазой в кислой среде и выделяют ИЛ2.

Рекомбинантный ИЛ2, полученный в виде гранул, благодаря высокому выходу экспрессии в трансформированном микроорганизме, таком как E.coli, может быть растворен известными методами при помощи концентрированного раствора хаотропного агента, такого как раствор соли гуанидина 6-8 M, а затем очищен жидкостной высокоэффективной хроматографией с обратной фазой (называемой ниже ОФ-ВЭЖХ) на носителях, имеющихся в продаже, предпочтительно на привитой двуокиси кремния, такой как C3, C4, C8 или C18, кислым элюентом, имеющим pH 1-4.

ИЛ2 может быть элюирован из колонки при помощи транспортирующей системы, состоящей из органической кислоты, такой как уксусная кислота или трифторуксусная кислота (обозначаемая ниже ТФУ), и органического растворителя, такого как ацетонитрил. Главная фракция, элюция которой определяется спектрофотометрически при 280 нм, является исходным продуктом для возможной стадии охлаждения. Под охлаждением подразумевается, что данная главная фракция, собранная при комнатной температуре, вводится в среду, где температура порядка -20oC, при которой постепенно образуется твердая водная фаза, из которой можно удалить всплывшую фракцию декантацией.

Таким образом, отделенная водная фаза является после разбавления исходным продуктом для ОФ-ВЭЖХ в кислой среде, описанной ниже. Разбавление водной фазы ведется в кислой среде с pH 1-4, предпочтительно от 2 до 3. Разбавленную водную фазу хроматографируют на колонке с обратной фазой, используя носители, находящиеся в торговле, такие как привитые двуокиси кремния C3, C4, C8 или C18, имеющие поры подходящего размера для использования с протеинами, например, с диаметром по меньшей мере 150 . Для элюции ИЛ2 используется градиент увеличения концентрации низшего спирта, смешивающегося с водой и содержащего органическую кислоту.

Возможная стадия охлаждения ведется, в частности, в водном растворе ацетонитрила, содержащего около 0,1% трифторуксусной кислоты, разбавление осуществляют при помощи водного раствора органической кислоты, такой как лимонная кислота, а ИЛ2 элюируется на второй хроматографии при помощи раствора, включающего изопропанол, воду и органическую кислоту, такую как лимонная кислота.

Водный раствор ацетонитрила, содержащий около 0,1% ТФУ кислоты, который представляет собой предпочтительную смесь, направляемую на возможную стадию охлаждения, соответствует главной фракции, элюированной на первой хроматографии. Особенно предпочтительно разбавление водной фазы вести сразу, либо после возможного разделения, либо после первой хроматографии. Это разбавление осуществляют введением предпочтительно не менее 2 объемов воды, содержащей 0,5-2% органической кислоты, такой как муравьиная, уксусная, пропионовая, трифторуксусная или лимонная кислоты, более предпочтительно введением около 2 объемов воды, содержащей 0,5% лимонной кислоты.

Вторая хроматография состоит в том, что водную фазу, которая может быть отделена после стадии охлаждения, а затем разбавления, направляют на ОФ-ВЭЖХ с использованием носителей, имеющихся в продаже, таких как привитые двуокиси кремния C3, C4, C8 или C18 с диаметрами пор не менее 150 . Предпочтительным носителем является привитая двуокись 04 VYD 300 , состоящая из силикагеля, имеющего бутильные группы, привитые ковалентным образом, поры которого имеют диаметр 300 и частицы которого имеют средний размер 15 - 20 мкм. Элюция ИЛ2 ведется при помощи транспортирующей системы, включающей спирт, такой как пропанол или изопропанол, и органическую кислоту, такую как муравьиная, уксусная, пропионовая, трифторуксусная или лимонная кислоты.

Предпочтительная смесь включает изопропанол, воду и лимонную кислоту, предпочтительно 0,5-2%-ную, особенно предпочтительно 0,5%-ную, и обеспечивает при помощи системы градиента с увеличивающейся концентрацией изопропанола элюирование меньшей фракции, содержащей приблизительно 48% изопропанола, а затем большой фракции, содержащей около 59% изопропанола, причем эта последняя фракций содержит активный негликозилированный рекомбинантный ИЛ2 человека в восстановленной форме.

Изобретение относится таким образом к негликозилированному рекомбинантному ИЛ2 человека в восстановленной форме, полученному по способу, описанному выше.

Упомянутая полученная фракция может храниться при температуре от около 0oC до -20oC. Она устойчива в этих условиях. Можно также удалить изопропанол азотропной перегонкой в вакууме. Полученный раствор может храниться при температуре 4oC или же сразу выделяют ИЛ2 лиофилизацией.

Если способ осуществляют без охлаждения главной фракции и отделения водной фазы, то полученную разбавленную главную фракцию хранят при 4oC. Она устойчива и служит исходным сырьем второй хроматографии.

Когда дозируют тиольные группы, то ИЛ2, полученный по изобретению, имеет 3 свободные сульфгидрильные группировки и проявляет специфическую активность, равную 0,7-1,3 107 E/мг в опыте размножения линий СТЛЛ-2, т.е. сравнимую с той, которая проявляется нативным ИЛ2. Эта активность оправдывает применение негликозилированного рекомбинантного ИЛ2 человека в восстановленной форме, описанного выше, в качестве лекарства таким же образом, как и нативный ИЛ2 при ряде показаний, где нужна его иммуномодулирующая активность, а также его противоопухольная активность, которые были описаны например Fleteher M. и сотр. Lymphokine Research 6 (1987) 47-57 и которые касаются, например, размножения лимфоцитов Т, индуцирования цитотоксичности клеток NK (природная клетка-киллер) и клеток LAK (лимфокин, активизирующий клетку-киллер), восстановления клеточного иммунитета, защитного эффекта против инфекции в случае иммунного дефицита или вспомогательного эффекта по отношению к вакцинам. Введение может быть прямым или же в ассоциации с соответствующим методом иммунотерапии, которая описана Rosenberg S.A. и сотр. N. Engl.J.Med. (1985) 313, 1485-1492.

Также как и нативный ИЛ2 ИЛ2, полученный по изобретению, может употребляться один или в ассоциации с другими средствами иммуномодулирования, таким как интерферон альфа, интерферон гамма или с другими терапевтическими средствами.

Негликозилированный рекомбинантный ИЛ2 человека в восстановленной форме может употребляться для приготовления фармацевтических составов, содержащих его в качестве активного начала.

Состав может быть твердым или жидким. Интерлейкин-2 изобретения может входить в рецепт смеси, составленный известными методами для приготовления фармацевтического состава, где ИЛ2 смешивают с фармацевтически приемлемым носителем. Этот состав содержит эффективное количество ИЛ2 с соответствующим количеством носителя, пригодного для человека. Фармкомпозиция может быть получена из кислого водного раствора ИЛ2 согласно изобретению после удаления изопропанола азеотропной перегонкой в вакууме, к которому прибавляют наполнитель, растворимый в воде, и который лиофилизируют. Под словом наполнитель понимают вещество, растворимое в воде и которое не изменяет начального pH, когда смесь составлена. Примеры наполнителей, которые могут быть введены, даны в следующем порядке: глюкоза, рибоза, сахароза, мальтоза, трегалоза или восстановленные сахара, такие как маннит. Предпочитают маннит. Маннит прибавляют в концентрациях от 10 до 50 мг/мл, предпочтительно порядка 50 мг/мл, когда концентрация ИЛ2 находится между 0,05 мг/мл в зависимости от используемой дозы. Раствор, который был стерильно отфильтрован в отсутствии кислорода, распределяют по ампулам-дозаторам и затем лиофилизируют. Лиофилизированная смесь может быть заново восстановлена введением в ампулу дистиллированной воды, подходящей для парентеральной инъекции.

Состав по изобретению может быть введен внутривенным путем через болюс или непрерывный перфузией, внутримышечным путем, интраперитональным путем, внутриплевральным путем или подкожной инъекцией. Эффективная доза ИЛ2, которая зависит от пути введения и от самого лечимого больного, обычно находится между 1 106 E/М2/24 и 40 106 E/М2/24 ч, предпочтительно порядка 20 106 E/М2/24 ч для взрослого или ребенка. Ежедневная доза зависит также от продолжительности введения, и не надо ограничиваться указанными выше дозами.

Для введения методом перфузии фармацевтический состав, в частности, содержит негликозилированный рекомбинантный ИЛ2 человека в восстановленной форме, воду и органическую кислоту, такую как лимонная кислота. Такой состав может быть получен из лиофилизированного фармацевтического состава изобретения, который растворяют в присутствии подходящего носителя, который способствует устойчивости активного начала во время перфузии, например, глюкозы.

По предпочтительным условиям разбавляют лиофилизированную смесь дистиллированной водой, вводя ее в пузырек для перфузии, содержащий глюкозу при концентрации в 50 мг/мл, в объеме, определяемом в соответствии с вводимой дозой.

Данные ниже фигуры иллюстрируют некоторые стороны изобретения.

Фиг. 1а является хроматограммой-анализом ОФ-ВЭЖХ сырого экстракта гуанидина 8М примера 1.

Фиг. 1б является хроматограммой-анализом ОФ-ВЭЖХ стандартных ИЛ2, восстановленного и окисленного.

Фиг. 2 является хроматограммой-анализом ОФ-ВЭЖХ "повторного раствора" примера 1.

Фиг. 3 является хроматограммой ОФ-ВЭЖХ "главной фракции после стадии охлаждения примера 1.

Фиг. 4 является хроматограммой-анализом ОФ-ВЭЖХ фракции "59" примера 1.

Фиг. 5 является гелем электрофореза SDS-PAGE примера 2.

Фиг. 6а и 6б являются пептидными картами примера 2.

Фиг. 7а и 7б является кривыми КД примера 2.

Фиг. 8 является кривой митогенного эффекта на лимфоциты человека примера 3.

Фиг. 9 является кривой токсичности, полученной по отношению к линиям К 562 и DAUDI.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.

Пример 1. Очистка биологически активного восстановленного р-чИЛ2 из гранул.

Гранулы получены центрифугированием культур штамма E.coli, трансформированного при помощи плазмида, включающего кодирующую последовательность природного ИЛ2 и способного накапливать ИЛ2 в форме гранул внутри клеток, как это описывает, например, SATO, T и сотр., J.Biochem. (1987) 101 525-534. Клетки, полученные в ферментере объемом 10 л, подвергают разрыву в гомогенизаторе Manton Gaulin.

Исходя из этих клеточных остатков, выделенных и промытых, (90-170 г сырого веса) ИЛ2 растворяют в 2,5 объемах буферного раствора Трис, HCl 20 мМ pH 8, содержащего хлоргидрат гуанидина (Гу, HCl) 8М и дитиотреитол (ДТТ) 100 мМ. Количество растворенного ИЛ2 (1,5-2,5 г) определяют при помощи аналитической ОФ-ВЭЖХ на колонке C4 VYDAC (0,46 x 15 см) 300 , 5 мкм, при скорости 2 мл/мин, с линейным градиентом ацетонитрила (от 30 до 70% за 10 мин), содержащего 0,1% ТФУ, спектрофотометрическую детекцию проводили при 280 нм или 210 нм, площадь пика которой определяли при 280 нм после калибровки со стандартом ИЛ2 (фиг. 1а и фиг. 1б). ИЛ2 затем осаждают понижением до 2М концентрации Гу, HCl, в присутствии ДТТ.

После промывки осадка при помощи 0,1%-ного водного раствора ТФУ до получения pH всплывшей части ниже 5,0 ИЛ2 растворяют в водном растворе, содержащем 20% ацетонитрила и 0,1% ТФУ. Полученный новый раствор, который содержит по аналитической ОФ-ВЭЖХ (фиг. 2) более чем 85% восстановленного ИЛ2, проявляет биологическую активность ниже 0,01 107 E/мг восстановленного ИЛ2 и имеет содержание сульфгидрильных групп в количестве 2,85 СГ/моль восстановленного ИЛ2. Фракцию полученного раствора, соответствующую около 200 мг ИЛ2 по ОФ-ВЭЖХ, разбавляют до доведения концентрации ацетонитрила ниже 10% в 0,1%-ном ТФУ, а затем переносят в колонку C4 VYDAC (5,7 x 30 см). ИЛ2 элюируют с расходом в 100 мл/мин при помощи линейного градиента ацетонитрила (30-80% за 40 мин), содержащего 0,1% ТФУ, при концентрации около 60% ацетонитрила в большом пике, обнаруженном фотометрически при 280 нм, и анализируют с помощью ОФ-ВЭЖХ. Собранную "главную фракцию", которая содержит восстановленный ИЛ2, подвергают затем стадии медленного охлаждения от комнатной температуры до -20oC 1oC и удаляют декантацией верхнюю органическую фазу, богатую ацетонитрилом. Нижнюю фазу, содержащую много воды и содержащую также ИЛ2, можно хранить в замороженном виде. После размораживания полученный раствор после разбавления двумя объемами 0,5%-ного водного раствора лимонной кислоты, переносят на колонку C4 VYDAC (5,7 x 30 см), которую запускают с линейным градиентом изопропанола (20-70% за 40 мин), содержащим 0,5% лимонной кислоты, с расходом 50 мл/мин. Эффлюент, наблюдаемый спектрофотометрически при 280 нм, показывает последовательную элюцию малого пика при концентрации около 48% изопропанола (фракция "48") и главного пика при концентрации около 59% изопропанола (фракция "59") (фиг. 3). Фракцию "59" собирают. Она стабильна при хранении при 0oC в течение по меньшей мере 24 ч в отсутствии воздуха.

После удаления изопропанола азеотропной перегонкой в вакууме фракцию "59" анализируют аналитической ОФ-ВЭЖХ и обнаруживают однородный пик (фиг. 4), элюированный при 60% ацетонитрила, тогда как окисленный ИЛ2 (эталон) элюируется при около 57% ацетонитрила (фиг. 1б). Фракция "59", которая после удаления изопропанола содержит ИЛ2 при концентрации выше 1 мг/мл, и ее pH равен 30,5, может храниться при 4oC, в отсутствии воздуха, в течение по крайней мере одной недели, либо ее сразу лиофилизируют или смешивают для получения фармацевтического состава. Анализируют биологическую активность лиофилизированной фракции "59" в тесте "ин витро" на размножение клеток CTLL-2. Ее специфическая активность равна 1,30,5 107 E/мг и сравнима с активностью природного ИЛ2.

Содержание свободных сульфгидрильных групп по фракции "59", лиофилизированной определенной колориметрическим методом с дитиодипиридином, составляет 2,94 СГ/моль, сравнительно с 0,76 СГ/моль для эталонного окисленного ИЛ2.

150 - 300 мг, оттитрованные аналитической ОФ-ВЭЖХ, восстановленного р-ИЛ2 человека, содержащего 3 группы СГ, биологически активного, однородного по ОФ-ВЭЖХ, получены из фракции "59" в бродильном чане емкостью 10 л.

Пример 2. Очистка восстановленного биологических активного р-ИЛ2.

Действуют, как в примере 1, за исключением того, что не подвергают "главную фракцию" стадии охлаждения, а затем отделению путем декантации, а сразу разбавляют ее 2 объемами 0,5%-ного водного раствора лимонной кислоты. Фракция "59" собирается и обрабатывается, как в примере 1.

Пример 3. Физико-химическая характеристика биологически активного восстановленного р-ИЛ2 человека.

Восстановленный р-ИЛ2, находящийся во фракции "59" примера 1, изучается по следующим свойствам.

1) Однородность Электрофорез SDS PAGE ведется на геле с двумя фазами /гель концентрации и гель миграции, соответственно с 5% и 15% акриламида/, содержащем 10% SDS.

Образец предварительно нагревается в течение 2 мин при 100oC в буферном растворе, содержащим 3% SDS и 5% меркаптоэтанола.

Миграция с буферным раствором, содержащим 1% SDS, дает окраску серебром, которая проявляет одну полосу, соответствующую чистоте выше 99% на осадок в 2 мкг (фиг. 6).

2) Молекулярный вес, определяемый электрофорезом В восстановительной среде определяют кажущийся МВ, составляющий около 15 кДа, который соответствует вычисленному МВ 15420 (фиг. 5).

3) Аминокислотный состав Образец, содержащий 25 мкг восстановленного p-ИЛ2 человека согласно изобретению в 0,5 мл воды, вводят в стеклянную трубку для гидролиза, в которую прибавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты, содержащей 31,7% ТФУ и 4,8% тиогликолевой кислоты. Трубку запаивают в вакууме, а затем ведут гидролиз при 155oC в течение 40 мин.

Продукт гидролиза затем упаривается досуха под уменьшенным давлением. Остаток растворяют в 0,7 мл цитратного буферного раствора с pH = 3, а затем анализируют аминокислоты на колонке Interaction AA 511 (0,46 x 15 см) при помощи градиента pH (от 3 до 5) и хлорида натрия (от 0 до 70 г/л) в буферном растворе цитрата, при 60oC, с расходом 0,5 мл/мин и с детекцией путем флуоресценции после отвода с ортофталальгидом на выходе из колонки. Результаты даны в табл. 1.

Значения являются средними числами, полученными для 2 гидролизов (повторенных) и 2 хроматограмм, соответственно повторенных. Состав соответствует составу нативного ИЛ2, содержащего дополнительный N-концевой метионин.

4) N-концевая аминокислотная последовательность
N-концевая последовательность идентифицирована методом микропоследовательностей, используя автоматический способ деградации Эдмана. Анализ 15 мкг восстановленного биологически активного p-ИЛ2 человека согласно изобретению на микропоследователе с газовой фазой Applied Biosystems 470А, спаренном с ВЭЖХ 120А, позволил идентифицировать следующие аминокислоты ФТГ (фенилтиогидантоины), приведенные в табл. 2.

Последовательно 20 N-концевых остатков находится в соответствии с теоретическим порядком последовательностей нативного ИЛ2. Обнаружено около 10% ИЛ2 без метионина.

5) Пептидная карта, полученная с бромистым цианидом
700 мг восстановленного ИЛ2 согласно изобретению (около 53 нмоль) растворяют в 4 мл 70%-ной муравьиной кислоты и прибавляют 5,6 мг бромистого цианида. Раствор перемешивается одну ночь при комнатной температуре, разбавляют водой, а затем подвергают лиофилизации. Реакционную смесь анализируют при помощи ОФ-ВЭЖХ на колонке Bondapack С18 ОФ (0,46 x 20 см) посредством градиента концентрации ацетонитрила, изменяющегося от 0 до 70%, содержащего 0,1% ТФУ, при скорости 1 мл/мин, при комнатной температуре и со спектрофотометрической детекцией при 220 нм. Пептидная карта восстановленного p-ИЛ2 человека (фиг. 6а) показывает фрагментацию, отличающуюся от фрагментации окисленного ИЛ2 эталона (фиг. 6б).

6) Круговой дихроизм
Спектры кругового дихроизма (КД) определяют при комнатной температуре на сектрографе Jobin Yvon Mark V. Пробу восстановленного p-ИЛ2 человека, лиофилизированного после ОФ-ВЭЖХ, проведенного с линейным градиентом изопропанола, в котором заменили 0,5% лимонной кислоты по примеру 1 на 0,1% муравьиной кислоты, и последующего удаления отгонкой изопропанола и лиофилизации, поглощают уксусной кислотой с концентрацией 1 мг/мл. Используемые емкости составляют 0,01 см и 0,5 см соответственно для пептидной области (185-250 нм) и для ароматической области (260-320 нм). Спектр растворителя вычисляется из спектра ИЛ2 для каждой пробы. Результаты даны в эллиптичности 0 (средний вес на остаток ИЛ2=116).

Фиг. 7а показывает спектр КД в удаленном УФ: биологически активный, восстановленный p-ТЛ2 человека согласно изобретению имеет спектр, который указывает на присутствие упорядоченной вторичной структуры. Определение % спирали альфа показывает на малозначимую разницу с окисленным этанолом ИЛ2 (% спирали альфа 50%).

Фиг. 7б показывает спектр КД в ближнем УФ: окисленный ИЛ2 эталона имеет показательный КД, который указывает на асимметрическую окружающую среду для ароматических остатков, тогда как восстановленный p-ИЛ2 человека согласно изобретению имеет КД мало показательный, но различный.

Пример 4. Биологическая активность
Биологическая активность восстановленного p-ИЛ2 человека согласно изобретению оценивается опытами в условиях in vitro или "ex vivo".

1) Активность in vitro на клетках человека
а. Опыт лимфобластического превращения
Кроме пролиферативной активности на клеточных поколениях мышей, таких как СТЛЛ-2, которая позволяет осуществить биологическую дозировку ИЛ2, восстановленный p-чИЛ2 согласно изобретению проявляет митогенный эффект, зависящий от дозы, сравнимый с эффектом, проявляемым окисленным ИЛ2 эталона на нормальные циркуляционные человеческие лимфоциты, который измеряется введением насыщенного тритием тимидина в ДНК (фиг. 8).

б. Индукция цитотоксичности одноядерных клеток
Опыт ведется на инкубированных циркуляционных одноядерных клетках человека в присутствии ИЛ2, и цитотоксический эффект определяется по отношению к опухолевым целевым клеткам соответственно эритролейкемического поколения К 562 (чувствительного к клеткам NK ) и поколения DAUDI, произведенного от лимфомы B (резистентной к клеткам NK), путем измерения высаливания CR 51 за 4 ч.

Результаты, выраженные в литических единицах на 106 клеток (ЛЕ/10н6), показывают, что восстановленный p-ИЛ2 человека согласно изобретению проявляет способность в зависимости от дозы соответственно увеличивать активность NK или наводить цитотоксичность лимфоцитов T по отношению к опухолевым целям, которая может быть сравнима с известной активностью природного ИЛ2 (фиг. 9).

2) Активность "ex vivo" на мышах (стимулирование брюшинных макрофагов)
У нормальной мыши Balb/c и MRL -+/+ внутрибрюшинная последовательная инъекция сначала рекомбинантного гамма интерферона крысы при субоптимальных дозах (100-300 Е), а затем спустя 24 ч восстановленного p-ИЛ2 человека согласно изобретению инициирует окислительные механизмы фагоцитарных клеток, определяемые измерением хемилюминесценции в присутствии сложного эфира форбола (РМА), клеток, взятых из брюшинной полости мышей, умерщвленных спустя 24 ч после инъекции ИЛ2. Эффект, зависящий от дозы, сравним с эффектом, наблюдаемым с окисленным ИЛ2 эталона.

Результаты приведены в табл. 3.

Пример 5. Фармацевтический состав для инъекции
Водный раствор восстановленного p-ИЛ2 человека, соответствующего фракции "59" согласно изобретению, из которой удаляли изопропанол азеотропной перегонкой в вакууме, разбавляют по мере необходимости при помощи дегазированного и насыщенного азотом водного раствора маннита из расчета 100 мг восстановленного ИЛ2/мл и 50 мг/мл маннита. После фильтрации на мембране толщиной 0,22 мкм, стерильного распределения 1 мл в склянки и лиофилизации склянки-дозы закупоривают в атмосфере азота и хранят при температуре в 4oC до употребления.

Пример 6. Фармацевтический состав для непрерывной перфузии.

Водный раствор восстановленного p-ИЛ2 человека, соответствующего фракции "59" изобретения, из которой удален изопропанол азеотропной перегонкой в вакууме, разбавляют по мере необходимости при помощи дегазированного и насыщенного азотом водного раствора маннита из расчета 500 мкг восстановленного ИЛ2/мл и 50 мг/мл маннита. После фильтрации на мембране толщиной 0,22 мкм, стерильного распределения 1 мл в склянки лиофилизации склянки-дозы закупоривают в атмосфере азота и хранят при температуре 4oC до употребления. Затем содержание каждой склянки растворяют введением 1 мл стерильной дистиллированной воды. Растворы, соответствующие 7 склянкам-дозам (около 35106 единиц), вводят в контейнер Виафлекс R, содержащий 500 мл раствора для перфузии 5%-ного Травенол RГлюкозы.


Формула изобретения

1. Рекомбинантный интерлейкин 2 (ИЛ 2) человека, полученный из гранул продукта экспрессии бактериальных клеток после трансформации их вектором, содержащим нативный ген ИЛ 2 человека, путем солюбилизации в восстанавливающей среде с хаотропным агентом и последующей очистки при помощи осаждения, высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (ОФ-ВЭЖХ) и использованием кислого элюанта, разведения ИЛ 2-содержащей фракции кислой средой и повторной ОФ-ВЭЖХ в кислой среде, включающий цистеины в положениях 58, 103 и 125 в восстановленной форме, имеющей мол. м. около 15 кД и аминокислотную последовательность Х-Ала-Про-Тре-Сер-Сер Сер-Тре-Лиз-Лиз-Тре-Глн -Лей-Гли-Лей-Глу-Гис-Лей-Лей-Лей-Асп-Лей-Глн-Мет-Иле-Мет-Лей -Тре-Фен-Лиз-Фен-Тир-Мет-Про-Лиз-Лиз-Ала-Тре-Глу-Лей-Лиз-Гис -Лей-Глн-Гис-Лей-Глу-Глу-Глу-Лей-Лиз-Про-Лей-Глу-Глу-Вал -Лей-Асн-Лей-Ала-Глн-Сер-Лиз-Асн-Фен-Гис-Лей Арг-Про-Арг-Асп -Лей-Иле-Сер-Асн-Иле-Асн-Вал-Иле-Вал-Лей-Глу-Лей-Лиз-Глу-Сер-Глу-Тре -Тре-Фен-Мет-Цис-Глу-Тир-Ала-Асп-Глу-Тре-Ала-Тре-Иле-Вал -Глу-Фен-Лей-Асн-Арг-Трп-Глн-Сер-Иле-Иле-Сер-Тре-Лей-Тре или аналогичную последовательность, которая содержит в положениях, отличных от 58, 105 и 125, аминокислотные замены делеции или вставки, не влияющие на биологическую активность, где Х является метионином или водородом, и обладающий митогенной, пролиферативной, макрофагстимулирующей и индуцирующей цитотоксичность моноядерных клеток активностями нативного ИЛ-2 человека.

2. Интерлейкин 2 по п. 1, отличающийся тем, что проявляет специфическую активность по крайней мере 0,5 107 ЕД/мг.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к цефалоспоринацетилгидролазному гену, белку, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую указанным геном и представляющему собой мультимер, предпочтительно тетрамер или октамер, а также к методу получения указанного белка

Изобретение относится к области органической химии, к антибактериальным средствам и может найти применение в медицине и ветеринарии

Изобретение относится к технологии рекомбинантных ДНК, а именно к способам использования такой технологии для определения последовательности ДНК и соответствующей последовательности аминокислот иммунного интерферона человека и для его получения
Изобретение относится к области пептидной химии, в частности к способу получения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина - предшественника дипептида аспартама
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гибридного белка 1 -тимозин-фактор некроза опухолей

Изобретение относится к медицине

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота

Изобретение относится к области получения протеина экстракцией из природных источников
Наверх