Способ определения концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты
Способ может быть использован в медицине и в биохимических лабораторных методах исследования. Способ повышает чувствительность и точность определения малонового диальдегида в биологическом материале. Используют минимальное количество сыворотки крови или гомогената (0,2-0,5 мл), растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии тритона Х-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в мин), реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляют трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7: 3).
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в биохимических лабораторных методах исследования.
Цель изобретения - повышение чувствительности и точности определения малонового диальдегида в биологическом материале. Поставленная цель достигается тем, что для анализа используются минимальное количество сыворотки крови или гомогената (0,2 - 0,5 мл), растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии тритона X-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в мин), реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляется трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7:3). В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении pH протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм. Приготовление рабочих растворов. Рабочий раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБК) готовили путем растворения навески ТБК 864 мг в 100 мл смеси, содержащей 1% раствор тритона Х-100 и 8,2 М раствор этанола. Остальные растворы готовили на бидистиллированной воде. Пример 1. Определение скорости перекисного окисления липидов в отсутствие прооксиданта. 1,5 мл сыворотки или гомогената ткани инкубировали 30 мин при температуре 40oC, при постоянном перемешивании с частотой 120 качаний в 1 мин. Реакцию останавливали 0,2 мл 3 мМ раствором дигидрокверцетина. Затем к исследуемому образцу последовательно добавляли 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение проводили при 15oC в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5 - 10 мл смеси этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контролем служила пробирка, в которую добавляли все эти же растворы, только вместо сыворотки или гомогената добавляли бидистиллированную воду. В расчетах МДА использовали молярный коэффициент экстинкции = 156 мМ-1см-1. Пример 2. Определение скорости перекисного окисления липидов в присутствии прооксидантов. Инкубационную смесь, содержащую 0,5 мл сыворотки или гомогената ткани, 0,2 мл 1 мМ раствор FeSO4 и 0,3 мл 1% раствора тритона Х-100, помещали на водяную баню с температурой 40oC на 30 мин, с постоянным перемешиванием с частотой 120 качаний в 1 мин. Реакцию останавливали 0,2 мл 3 мМ раствором дигидрокверцетина. Затем к исследуемому образцу последовательно добавляли 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение проводили при температуре +15oC в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5 - 10 мл смеси этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контролем служила пробирка, в которую добавляли все эти же растворы, только вместо сыворотки или гомогената добавляли бидистиллированную воду. В расчетах концентрации МДА использовали молярный коэффициент экстинкции = 156 мМ-1см-1. Расчет концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови проводят по формуле: где D1 - оптическая плотность образца с сывороткой; D2 - оптическая плотность контроля; U1 - объем сыворотки, взятой на определение, мл; U2 - конечный объем смеси, мл; l - длина кюветы, см; - коэффициент экстинкции 156 мМ-1см-1. Расчет концентрации малонового диальдегида в гомогенатах ткани проводят по формуле: где D1 - оптическая плотность образца с гомогенатом; D2 - оптическая плотность контроля; U1 - объем гомогената, взятого на определение, мл; U2 - конечный объем смеси, мл; U3 - общий объем гомогената, мл; P - навеска ткани, г; l - длина кюветы, см; - коэффициент экстинкции 156 мМ-1см-1; 10 - коэффициент перевода в мл. Описание прототипа [1]. Метод применяется для определения скорости процессов перекисного окисления липидов в изолированных системах. Существуют две его разновидности: в одной определяется скорость спонтанного, во второй - скорость перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот (НЖК), индуцированного прооксидантами. В случае определения скорости спонтанного неиндуцированного перекисного окисления изолированный препарат биомембран или гомогенат инкубируют в аэробных условиях без каких-либо добавок или воздействий, стимулирующих процессы перекисного окисления. Пример 1. Определение скорости перекисного окисления в отсутствие прооксидантов. Инкубационную смесь, содержащую 50 мМ трис-HCl буфер (pH 7,4) и суспензию клеточных органнелл или тканевой гомогенат в количестве 1 - 10 мг белка/мл, помещают в водяную баню (t = 37o) и инкубируют при постоянном встряхивании. Пробы объемом 1,9 мл отбирают в центрифужные пробирки через различные сроки инкубации. Реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 100% раствора ТХУ, 0,2 мл 5 М HCl и 2,0 мл 0,75% ТБК. Затем смесь нагревается в горячей водяной бане в течение 15 мин и центрифугируется. Оптическая плотность измеряется при 535 нм. Молярный коэффициент экстинкции = 156 мМ-1см-1. Пример 2. Определение скорости перекисного окисления в микросомальной фракции в присутствии прооксидантов. В качестве прооксидантов добавляются НАДФН или аскорбиновая кислота, а также ионы Fe2+ (или Fe3+). Для НАДФН-стимулируемой ферментной системы обязательным является добавление пирофосфата или нуклеотидов с пирофосфатными группировками. В случае аскорбат-зависимой системы вполне достаточно одних ионов Fe2+ (Fe3+). Состав инкубационной смеси: белок микросом 0,5 - 1,0 мг/мл; трис-HCl буфер 40 мМ (pH 7,4); восстановленный НАДФ 1 мМ или аскорбат 0,8 мМ; Fe(NH4)2(SO4)26H2O 12 мкМ; Na4P2O710H2O 20 мМ. В некоторых случаях используют вместо НАДФН глюкозо-6-фосфатдегидрогеназную НАДФ-генерирующую систему, содержащую 0,3 мМ НАДФ+, 8мМ MgCl2, 9 мМ глюкозо-6-фосфат Na, 50 мМ никотинамид и 1 - 2 мкг глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в пробе. Объем пробы 1,0 мл. Инкубацию проводят на водяной бане (t = 37oC) в течение 20 мин при постоянном встряхивании сосудов. Реакцию останавливают добавлением 1,0 мл 30% ТХУ и осадок удаляют центрифугированием в течение 10 мин при 6000 об/мин (Владимиров Ю.А., Арчаков И.М. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972, с. 241 - 242). Предполагаемые недостатки прототипа 1. ТБК плохо растворима в воде и при комнатной температуре выпадает в осадок, поэтому каждый раз ТБК необходимо разогревать на кипящей водяной бане, что связано с тратой времени и энергии. 2. ТХУ не может полностью остановить протекание свободнорадикальных реакций, поэтому для полной остановки реакции необходимо использовать антиоксидант (дигидрокверцетин), который и предложен в данной заявке. 3. Интенсивность реакции ПОЛ очень сильно зависит от частоты перемешивания инкубационной смеси, на что в прототипе внимание не обращают. 4. Липидные фракции образца плохо растворимы в водной среде, для преодоления этого недостатка предлагается использовать тритон Х-100. 5. Триметиновый комплекс, образующийся в реакции ТБК с малоновым дидиальдегидом, но достаточно стабилен и может быстро претерпевать изменение. Для его стабилизации нами предложено использовать трилон Б. 6. Денатурированные формы белка удаляются с помощью ТХУ с последующим центрифугированием. Нами предложено производить их растворение смесью этанола с хлороформом.Формула изобретения
Способ определения концентрации малонового диальдегида (МДА) с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК), включающий инкубацию определяемого образца, проведение реакции МДА с ТБК определение концентрации МДА в образце, отличающийся тем, что, с целью интенсификации и повышения селективности реакции, растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии тритона Х-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в минуту), реакцию останавливают дигидрокверцетином, перед определением оптической плотности образца добавляется трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7 : 3).
Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к прогнозированию развития аллергических заболеваний среди детского населения
Способ определения токсичности крови рыб // 2108580
Способ лечения ишемической болезни сердца // 2107910
Изобретение относится к медицине, в частности, к кардиологии, и может быть использовано для лечения любых клинических вариантов ишемической болезни сердца
Изобретение относится к оптико-электронной промышленности и может быть использовано для комплексного исследования параметров взвеси частиц микронных и субмикронных размеров (10-8 - 10-4 м): распределения частиц по группам с определенными размерами, химического состава частиц, скоростей изменения этих характеристик
Способ оценки микросомальной системы печени при действии ксенобиотиков алкилирующего типа // 2104539
Изобретение относится к области исследования или анализа материалов особыми способами, а именно к способам исследования крови при действии ксенобиотиков, и может быть использовано для оценки микросомальной системы печени после воздействия малых доз иприта и люизита при реальных путях поступления ОВ (отравляющих веществ) в организм, а также при решении задач по уничтожению ХО (химического оружия) в районах военно-химических объектов, в частности по обследованию здоровья населения и обслуживающего персонала в местах по хранению и уничтожению ХО
Способ прогнозирования цирроза печени у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени // 2104538
Изобретение относится к медицине, а именно гепатологии, и предназначено для прогнозирования цирроза печени у больных с хроническими диффузными поражениями органа
Способ диагностики сахарного диабета // 2104537
Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, и может быть использовано для проведения дифференицальной диагностики инсулинзависимого и инсулиннезависимого диабета, состояния их компенсации
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано при проведении больным с неблагоприятным прогнозом адъювантных методов терапии
Способ оценки состояния больного // 2103692
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии и может быть использовано для диагностики и прогнозирования состояния больного в послеоперационном периоде и при развитии острого воспалительного процесса
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии, терапии
Изобретение относится к медицине, кардиологии
Способ агглютинации частиц для одновременного исследования нескольких аналитов в одном образце // 2111488
Изобретение относится к стабильному кинетическому способу одновременного определения присутствия нескольких аналитов в одном образце среды на основе агглютинаци частиц
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной ортопедии, иммунологии, может быть использовано в ветеринарии
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и может быть использовано для диагностики нарушений функционального состояния желудка на фоне возникновения дуоденогастрального рефлюкса (ДГР)
Изобретение относится к судебной медицине, криминалистике и аналитической технике, может быть использовано для диагностики алкогольного опьянения, а также в судебно-медицинской экспертизе при обследовании на предмет отравления низкомолекулярными алифатическими спиртами (C1-C5)
Способ диагностики рассеянного склероза // 2112242
Изобретение относится к медицине, а именно к невралогии