Способ получения стимулятора иммунитета при различных заболеваниях

 

Способ предназначен для получения иммуностимулятора из культуральной жидкости штампа-продуцента Vibrio cholerae. Способ включает культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с подпиткой глюкозой, аэрацией и перемешиванием в процессе культивирования. В конце логарифмической фазы роста продуцента обезвреживают вибрионы с последующим выделением токсина из супернатанта культуральной жидкости. В процессе культивирования продуцента поддерживают температуру в первые 2-3 ч 36-37^oC, в последние 5-6 ч - 34,25-35,75^oC, рН соответственно 7,3 - 7,9 и 7,8 - 8,2. Осуществляют в расчете на 1 л питательной среды подпитку глюкозой в первые 4-5 ч 5-7 мл/мин, следующие 2 ч - 7,5-12,5 мл/мин, последние 1-2 ч - 15-20 мл/мин, дополнительную подпитку питательной среды аммиаком в первые 2-4 ч - 3 мл/мин. При культивировании осуществляют аэрацию первые 3 ч - 400 мл/мин, следующие 3-4 ч 500 мл/мин, последние 1-2 ч - 500-600 мл/мин. Для превращения токсина в анатоксин к культуральной жидкости добавляют формалин до конечной его концентрации 0,6 об.%. Супернатант культуральной жидкости отделяют и выдерживают при температуре 10-12^oC в течение 25-34 сут при рН 6,7-7,3 и постоянной концентрации формалина не менее 0,2 об. %. После выдерживания двукратно осаждают анатоксин при насыщении супернатанта сульфатом аммония соответственно до 38 и 80 об.%, полученный осадок отделяют, ресуспендируют и очищают с помощью диализа. Способ позволяет получить экологически безвредный, нетоксичный, высокоактивный иммуностимулятор, позволяет повысить выход целевого продукта и упростить процесс получения. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области получения иммуностимулятора с антибактериальным действием, и может быть использовано в иммунофармакологии при получении биопрепаратов для лечения гнойных инфекционных, а также других заболеваний с нарушением иммунной системы.

Известен способ получения иммуномодулятора - холерного токсина (Finkelstein R. A. et Lospalluto J.J. Crystalline cholerae toxin and toxoid //Science. -1972.-V. 175.- N 4021.- P. 185-202), в котором получают холерный токсин глубинным культивированием V. cholerat в синказной среде в условиях аэрации в течение 24 ч. при 30^oC. Обеззараживание выросшей культуры проводят добавлением 0,1 об.% β -пропиолактана на 2 ч. Клетки удаляют центрифугированием. Осаждение токсина осуществляют сульфатом аммония (70 г на 100 мл центрифугата), элюат концентрируют ультрафильтрацией, очищают гельфильтрацией через агарозу, ультрафильтрацией и рехроматографированием на колонках с сефадексом G-75 с последующим концентрированием ультрафильтрацией.

Недостатками способа являются высокая токсичность и нестабильность получаемого продукта, а также малая производительность при сложной технологии получения Известен также способ получения иммуномодулятора (Germanier R., Furer E. , Varallyay S. Inderbitzen T. Preparation of a purified antigenic cholera toxoid//Infect. Immun. -1976. v.13N6.-p. 1692) для получения его используют сходную технологию, с тем различием, что осаждение токсина проводят с помощью гидроокиси алюминия, Недостатки этого способа совпадают с недостатками предыдущего аналога Наиболее близким техническим решением по изготовлению иммуностимулятора из культуральной жидкости Vibrio cholera является способ (Mekalanos S.S., Collier R.S., Romig W.R. Purifikation of cholera toxin and its subunit: Hew methods of preparation and the use of hypertoxinigenic mutants, Infect and Immunity, 1978, v. 20, p.552 - 558).

Данный способ заключается в следующем. Культивируют токсигенный штамм Vibrio cholerae 569 В на питательной среде из ферментативного гидролизата казеина, содержащей аминный азот - 200 мг %, фосфат натрия однозамещенного - 0,05 об.%, хлорид натрия - 0,5 об.%, пептон - 0,1 об.% с подпиткой глюкозой и аэрацией при 30^oC в течение 7 ч., для обезвреживания добавляют азид натрия, удаляют центрифугированием биомассу продуцента - V. cholerae. Из супернатанта получают холерный токсин - холероген с помощью ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе или других катионнообменных смолах.

Недостатком способа является то, что конечный продукт, получаемый этим способом, - холероген - является высокотоксичным препаратом (20 LB/mg), что ограничивает возможность его использования для лечения людей. Одновременно он нестабилен, чувствителен к воздействию различных внешних факторов (температура, pH и т. п.). Метод достаточно сложен, характеризуется малой производительностью и малым выходом готового продукта.

Целью изобретения является получение экологически безвредного (нетоксичного) иммуностимулятора при повышении выхода продукта и упрощения процесса получения.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе получения иммуностимулятора из культуральной жидкости штамма продуцента Vibrio choler. , включающем культивирование последнего на питательной среде с подкормкой и аэрацией в процессе культивирования с образованием холерного токсина - холерогена, обезвреживание и отделение полученной биомассы продуцента, выделение продукта из супернатанта культуральной жидкости с последующем очисткой; перед выделением продукта проводят детоксикацию полученного холерогена с превращением в анатоксин.

Кроме того, заявляется вариант способа с детоксикацией холерогена в анатоксин формалином.

Заявляется, кроме того, конкретные варианты осуществления способа с возможностью подпитки питательной среды аммиаком в начальной фазе культивирования и изменения режимов подпитки и аэрации в сторону нарастания.

Заявляется также конкретный вариант выделения и очистки продукта сульфатом аммония постадийно с постепенным нарастанием концентрации: на начальной стадии порядка 36-38 об.% насыщения и удалением балластного осадка с последующим выделением из центрифугата продукта путем осаждения с конечной концентрацией сульфата аммония порядка 80 об.% насыщения.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом: Культивируют в реакторе токсигенный штамм Vibrio cholerae, например 569B или КМ-76, или КМ-68 и др. на питательной среде, обеспечивающей активное токсинообразование, например, на бульоне Хоттингера, на бульоне из ферментативного гидролизата казеина, мясном бульоне. Обеспечивают в реакторе щелочную pH с подкормкой глюкозой и аэрацию. В конце культивирования в реактор добавляют формалин для обеззараживания V. cholerae и в дальнейшем детоксикации холерного токсина, превращению его в анатоксин. Выдерживают культуру с формалином при щелочной pH, при комнатной температуре до полной инактивации штамма-продуцента порядка 12-16 ч. Обезвреженную культуру центрифугируют до получения безмикробного супернатанта, содержащего холерный токсин; выдерживают супернатант до превращения его в анатоксин порядка 20-40 дней при температуре охлаждения с поддержанием режима pH 6,7-7,3 и концентрации формалина не менее 0,2 об.%. Выделение и очистку анатоксина из супернатанта проводят путем фракционного осаждения сульфатом аммония. При первой фазе фракционирования добавляют сульфат аммония к детоксицированному супернатанту до полного растворения до 36-38 об. % насыщения. Отделяют балластную фракцию (осадок) центрифугированием. Подвергают осаждению центрифугат (надосадочная жидкость) добавлением сульфата аммония порядка 80 об.% насыщения, выдерживают 18-20 ч., центрифугируют. Собирают осадок, отделяют нерастворимые примеси, например, сепарированием, подвергают диализу.

Пример 1. V.cholerae 569B выращивали в реакторе на бульоне pH 1,9-8,0 из ферментативного гидролизата казеина, содержащего 200 мг % аминного азота, 0,5 об. % хлорида натрия, 0,05 об.% натрия фосфорнокислого двухзамещенного. Перед посевом и в первые 3ч культивирования устанавливали температуру (36,0±0,5)^oC, в конце последних 4-5 ч. - 34,25-35-75^oC. Поскольку в данном примере в среду из казеинового гидролизата добавляли в реактор 40%-ную глюкозу в первые 3 ч. культивирования по 7 мл/мин, в последние постепенно увеличивали от 7,5 до 20 мл/мин на 1 л среды; аммиак - в первые 3 ч. по 3 мл/мин на 1 л среды. Подавали в реактор воздух в первые 3 ч. по 0,4 л/мин, постепенно увеличивая до 0,6 л/мин на 1 л среды к концу культивирования. Поддерживали pH растущей в бульоне культуры в первые 3 ч. в пределах 7,3-7,5, в последние - 7,6-7,8. При падении pH ее исправляли регулированием подачи глюкозы и аммиака. Через 8 ч. культивирования в реактор добавляли 37-40%-ный раствор формальдегида до конечной концентрации формалина 0,6 об.%. Культуру с формалином при pH 8,0 выдерживали 15 ч. при 20^oC. Центрифугировали инактивированную культуру при 13000 об/мин. Выдерживали безмикробный центрифугат, содержащий формалина 0,2 об.% при близкой к нейтральной pH (6,7-7,0) 30 сут. при температуре около 10^oC. Нивелировали концентрацию формалина в центрифугате добавлением формальдегида для снижения остаточной токсичности и исключения прорастания посторонней микрофлорой. При падении pH добавляли 10%-ный раствор натрия гидроокиси. Выделение и очистку анатоксина проводили двухкратным фракционным осаждением сульфатом аммония. Добавляли к центрифугату сульфат аммония из расчета 273-279 г на 1 л среды до 38 об.% насыщения. Отделяли центрифугированием осадок - балластную фракцию. Центрифугат (надосадочную жидкость) подвергали повторному осаждению, сульфат аммония добавляли из расчета 319-322 г на 1 л до 80 об.% насыщения, через 18-20 ч. выдерживания при комнатной температуре, центрифугировали. Собирали осадок, разводили в дистиллированной воде, подвергали диализу, удаляли нерастворимые фракции сепарированием. Выход продукта составлял 280 мг белка с 1 л среды.

Полученный иммуностимулятор был нетоксичным, не вызывал у крольчат "феномен холерогенности", характерный для холерного токсина, обладал специфической активностью - в каждой пробе по Крейгу давал положительную реакцию в разведении 1:32000 - 1:64000.

Пример 2. В реакторе выращивали токсигенный штамм Vibrio cholerace КМ-68 на аналогичной питательной среде, pH 8,1-8,2. Препарат готовили по аналогичной примеру 1 технологии с изменением некоторых режимов культивирования в реакторе: первые 2 ч. при 36,5-37,5^oC, последующие 5-6 ч. - при 34-35^oC, режима подкормки глюкозой первые 4 ч. по 5 мл; и подачи воздуха: 2 ч. по 0,4 л/мин; поддержании pH среды в первые 3 ч. в пределах 7,6-7,9, в последние часы - 8,0-8,2; режимов инактивирования в реакторе выросшей культуры продукта: 6 ч. при 18^oC; отделение обезвреженной биомассы продуцента центрифугированием при 8000 об/мин; поддержание в течение 25 дней pH центрифугата 7,1-7,3; при осаждении и очистке анатоксина добавление к центрифугату на первой фазе сульфата аммония по 285-289 г на 1 л, на второй - по 325-327 г на 1 л.

Выход продукта составил 300 мг белка с 1л среды. Полученный иммуностимулятор был нетоксичным, не обладал холерогенностью для крольчат, был активным - в кожной пробе по Крейгу давал положительную реакцию в разведении 1: 128000.

Пример 3. В реакторе выращивали токсигенный штамм Vibrio cholerae КМ-76 по технологии, не отличающейся от примера 1. Выход продукта 290 мг на 1 мл среды.

Полученный иммуностимулятор был также безвредным, нетоксичным, не обладал холерегонностью, обладал высокой активностью - давал положительную реакцию в кожной пробе по Крейгу с разведении 1:520.000.

Более высокая активность продукта, приготовленного по примеру 3, объясняется большей токсигеностью штамма V. cholerae КМ-76. Не исключена возможность получения в будущем V. cholerae - суперпродуцентов холерного токсина (анатоксина).

Приведенные примеры свидетельствуют об обоснованности заявленного способа, предусматривающего промышленное изготовление иммуностимулятора (см. таблицу).

Формула изобретения

Способ получения иммуностимулятора из культуральной жидкости штамма-продуцента Vibrio cholerae, включающий культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с подпиткой глюкозой, аэрацией и перемешиванием в процессе культивирования, затем обезвреживание вибрионов в конце логарифмической фазы роста продуцента с последующим выделением токсина из супернатанта культуральной жидкости, отличающийся тем, что в процессе культивирования продуцента поддерживают температуру в первые 2 - 3 ч 36 - 37^oC, в последние 5 - 6 ч 34,25 - 35,75^oC, pH 7,3 - 7,9 и 7,8 - 8,2, осуществляют в расчете на 1 л питательной среды подпитку глюкозой в первые 4 - 5 ч 5 - 7 мл/мин, следующие 2 ч 7,5 - 12,5 мл/мин, последние 1 - 2 ч 15 - 20 мл/мин, дополнительную подпитку питательной среды аммиаком в первые 2 - 4 ч 3 мл/мин, аэрацию первые 3 ч 400 мл/мин, следующие 3 - 4 ч 500 мл/мин, последние 1 - 2 ч 500 - 600 мл/мин, для превращения токсина в анатоксин к культуральной жидкости добавляют формалин до конечной его концентрации 0,6 об.%, затем супернатант культуральной жидкости отделяют и выдерживают при температуре 10 - 12^oC в течение 25 - 34 суток при рН 6,7 - 7,3 и постоянной концентрации формалина не менее 0,2 об.%, после выдерживания двукратно осаждают анатоксин при насыщении супернатанта сульфатом аммония соответственно до 38 и 80 об.%, полученный осадок отделяют, ресуспендируют и очищают с помощью диализа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.05.2003

Извещение опубликовано: 20.10.2004        БИ: 29/2004

---