Способ исследования структурно-функциональной организации днк рибосомального кластера эукариот

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии. Может быть использовано для синтеза последующего анализа структур внутреннего транскрибируемого и внешнего нетранскрибируемого спейсеров рибосомной ДНК эукариот широкого круга таксонов. Полимеразную цепную реакцию проводят с помощью универсальных праймеров: 5'-CTACTAGATGGTTСGATTAGTC-3', 5'-GTCCCTGCCGTTTGTACACA-3', для анализа внутреннего межгенного спейсера; 5'-AACTATGACTCTCTTAAGGT-3', 5'-TCCACCAACTAAGAACGGCC-3', для анализа внешнего межгенного спейсера. 2 табл., 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии, и может быть использовано для синтеза и последующего анализа структур внутреннего транскрибируемого и внешнего нетранскрибируемого спейсеров рибосомной ДНК эукариот.

Гены рибосомальных РНК (рДНК) эукариот локализуются кластерами высоко повторяющихся последовательностей, где каждый повтор содержит 18S, 5.8S и 28S рибосомальные гены. Внутри каждого повтора эволюционно консервативные районы (18S и 28S рДНК) разделены межгенными транскрибируемыми спейсерами, для которых характерна высокая вариабельность. Между 3' концом 28S и 5' началом 18S генов располагается протяженный нетранскрибируемый межгенный спейсер, для которого также характерен структурный полиморфизм. Анализ полиморфизма межгенных спейсеров позволяет изучать филогенетические отношения между близкородственными видами, а также изучать фиологению между популяциями внутри вида и между отдельными индивидумами.

Первичные последовательности структурных субъединиц рибосомальных повторов: 18S, 5.8S, 28S хорошо изучены у широкого круга организмов, тогда как первичная последовательность межгенных спейсеров - источник филогенетических данных - только недавно стала широко изучаться. Открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1] сделало возможным быструю амплификацию изучаемых участков ДНК из изначально малого количества стартового материала. Это в свою очередь позволило получать первичную последовательность ПЦР-продуктов, минуя процедуры клонирования.

Для проведения ПЦР-анализа используют праймеры - короткие ДНК-затравки, между которыми происходит синтез определенной последовательности. Для амплификации последовательностей межгенных спейсеров используют, как правило, праймеры, качественный состав которых определяется по нуклеотидной последовательности структурных субъединиц рибосомальных повторов, т.е. 18S и 28S рДНК. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью.

В качестве прототипа выбран способ исследования структурно-функциональной организации эукариотического организма, а именно Mumulus guttatus. Для изучения вариабельности рибосомального межгенного транскрибируемого спейсера внутри восьми подвидов Mumulus guttatus использовали пару праймеров следующего состава [2] : 5'-GAGACAACTCTCAACAACGG-3'; 5'-GAAAATAGGTTAATGGTTCC-3'.

Задачей изобретения является поиск универсальных праймеров, применимых для анализа структуры межгенных спейсеров рибосомной ДНК организмов широкого круга таксонов.

Поставленная задача решается посредством определения двух пар праймеров, а именно для амплификации внутреннего транскрибируемого межгенного спейсера рибосомной ДНК эукариот предложена пара праймеров следующего нуклеотидного состава: 5'-CTACTAGATGGTTCGATTAGTC-3' 5'-GTCCCTGCCGTTTGTACACA-3' Для амплификации внешнего нетранскрибируемого межгенного спейсера рибосомной ДНК эукариот предложена пара праймеров следующего нуклеотидного состава: 5'-AACTATGACTCTCTTAAGGT-3' 5'-TCCACCAACTAAGAACGGCC-3' Для определения универсальных праймеров были выявлены сверхконсервативные субпоследовательности 28S рДНК инфузории Tetrahymena pyriformis, которые можно использовать в качестве основы для подбора праймеров для работы методом ПЦР.

На фиг. 1 представлен результат сравнения субпоследовательностей 28S рДНК T. pyriformis с банком генов рДНК посредством компьютерной программы ImaGene при заданной 100%-ной степени сходства (40/40). Обнаружено три субпоследовательности 28S рДНК T. pyriformis, которые проявляли 100% сходство с определенным числом (от 40 до 70) последовательностей рДНК, представленных в EMBL базе данных. Более тонкий анализ проводился посредством программы FASTA. Результаты проведенной работы представлены в табл. 1. Как видно, три субпоследовательности рДНК T. pyriformis, протяженностью от 41 до 61 п. н. , имеют 100% сходство с соответствующими последовательностями рДНК таких различных организмов, как Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (растения), Saccharomyces cerevisiae (грибы), Caenorhabditis elefans (крупные черви), Xenopus leavis (земноводные), Homo sapiens (человек).

Аналогичный проход был использован для выявления праймеров, гомологичных 18S рибосомальной ДНК. Сверхконсервативные домены 18S рибосомальной ДНК представлены в табл. 2.

Описанные субпоследовательности 26S рДНК T. pyriformis послужили основой для создания предлагаемых праймеров для исследования методом ПЦР рДНК организмов различных таксонов, в том числе и тех организмов, первичная структура рДНК которых еще не определена.

Исследование струкурно-функциональной организации ДНК рибосомального кластера эукариот, а именно определение особенностей строения транскрибируемого и нетранскрибируемых спейсеров кластера рибосомальных генов широкого круга таксонов показано на следующих примерах.

Пример 1. Амплификация внутреннего межгенного спейсера рДНК.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе MiniCycler PT-150 (MJ Research, Inc, USA). Реакцию проводили в следующем режиме: хот-старт 95oC - 5 мин, далее 30 циклов по схеме: денатурация при 94oC в течение 1 мин, отжиг при 55oC - 2 мин, синтез при 72oC - 3 мин, стадию синтеза на конечной стадии проводили при 72oC в течение 9 мин.

Инкубационная смесь, конечным объемом 40 мкл содержала: 67 mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25oC), 1,5 mM MgCl2, 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween-20, 0,1 мкг каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 0,1 мкг ДНК-матрицы, 2 ед. ДНК-полимеразы Tag. Поверх смеси наслаивали 300 мкл минерального масла.

На фиг. 2 показан результат амплификации внутреннего спейсера рДНК представителей животного мира: 1 - таракан черный (B. orientalis); 2-, 3- таракан рыжий (B. germanica); 4 - дрозофила (D. melanogaster); 5 - двухточечная божья коровка (A. bipunctata); 6 - инфузория (T. pyriformis); 7 - горох полевой (P. sativum). Наличие продуктов амплификации во всех дорожках подчеркивает универсальность предлагаемых праймеров. Кроме того, на себя внимание структурный полиморфизм, который мы наблюдаем среди различных популяций тараканов, что говорит в пользу использования данных праймеров для анализа структуры рДНК.

Пример 2. Амплификация внешнего межгенного спейсера рДНК.

Инкубационная смесь, конечным объемом 40 мкл содержала: 67 mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25oC), 1,5 mM MgCl2, 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween-20, 0,1 мкг каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 0,1 мкг ДНК-матрицы, 2,5 ед. ДНК-полимеры Taq. Поверх смеси наслаивали 30 мкл минерального масла.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе MiniCycler PT-150 (MJ Research, Inc, USA). Реакцию проводили в следующем режиме: хот-старт 95oC - 5 мин, далее 30 циклов по схеме: денатурация при 94oC в течение 1 мин, отжиг при 55oC - 2 мин, синтез при 72oC - 3 мин, стадию синтез на конечной стадии проводили при 72oC в течение 9 мин.

На фиг. 3 показаны результаты амплификации внешнего спейсера рДНК представителей различных таксонов: 1-таракан рыжий (B. germanica), 2-горох полевой (P. satrivum).

Источники информации.

1. PCR (Merhods & Applications), 1993, v. 2, N. 4.

Ritland C. E., Ritland K., Straus N.A. // Mol. Biol. Evol. 1993. v. 10. P. 1273-1288.

Формула изобретения

Способ исследования структурно-функциональной организации ДНК рибосомального кластера эукариот широкого круга таксонов, предусматривающий проведение полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют последовательности ДНК со следующим нуклеотидным составом:
5'-CTACTAGATGGTTCGATTAGTC-3' 5'-GTCCCTGCCGTTTGTACACA-3'
для анализа внутреннего межгенного спейсера;
5'-AACTATGACTCTCTTAAGGT-3' 5'-TCCACCAACTAAGAACGGCC-3'
для анализа внешнего межгенного спейсера,

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к молекулярной биологии и может найти применение в медицине и молекулярной биологии для анализа экспрессии генов, диагностики и выявления механизмов патологий на генетическом уровне

Изобретение относится к молекулярной биологии и технологии рекомбинантных ДНК

Изобретение относится к способу определения наличия или отсутствия одной или нескольких последовательностей вариантных нуклеотидов посредством экстракопирования или его отсутствия и к наборам для определения

Изобретение относится к обеспечению клеток животного биологически активными веществами, более конкретно к способу переноса нуклеиновой кислоты в клетки животных

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается способа дифференциации различных вакцинных штаммов бруцелл, возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота и может быть использовано в научно-исследовательских и ветеринарных лабораториях

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики и может найти применение в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве для определения происхождения тех или иных образцов ДНК, диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, подтверждения родственных связей между отдельными индивидуумами, идентификации личности, характеристики пород животных или сортов растений

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к применению метода электрофоретического анализа для технологического контроля полноты инактивации убитых вакцин при использовании в качестве инактиватора сернокислой меди и предназначен для использования при производстве убитых вакцин в биологической промышленности и ветеринарии
Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 13-й и 21-й хромосом человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомной патологии, диагностику анеуплоидий при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека

Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к химии биологически активных веществ, конкретно к улучшенному способу получения стерильного раствора нативной натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, который может найти применение в медицинской практике, фармацевтической промышленности, биохимии, косметике и парфюмерии

Изобретение относится к химии биологически активных веществ, конкретно к способу получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из животного сырья, который может найти применение в медицинской практике, фармацевтической промышленности, биохимии, косметике и парфюмерии

Изобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики заболевания Ни-А, Hu-В-гепатита, Способ получения ДНК для диагностики Hu-А- Ни- В-гепатита заключается в том, что осуществляют стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22 мкм осаждают полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделяют осадок, растворяют его в буфере, встряхивают с фреоном в соотношении 1:1, отделяют фреоновую фазу, осаждают ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обрабатывают РНК- и ДНК- азой, фракционируют в градиенте хлористого цезия, отдел я ют фракции с плотностью Т,3 г/мл, диализуют, обрабатывают полученную фракцию протинозой К, экстрагируют 80%-ным фенолом и хлороформом, обрабатывают ДНК рестриктазой EcoRI, клонируют фрагмент ДНК в плазмиде pRR 322 или в лямбда-фагах
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии

Изобретение относится к медицине, в частности к трансфузиологии, гематологии и эпидемиологии, и может применяться для прямого генотестирования и генодиагностики
Наверх