Способ выделения ловастатина

 

Изобретение предназначено для выделения антибиотика ловастатина. Способ основан на выделении его из образца бродильного бульона, мицелия или фильтрата Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135) путем экстракции бутил-ацетатом. Затем проводят концентрацию экстракта при температуре выше 40^oC. За нею следует прямая кристаллизация ловастатина в лактонной форме из бутилацетата. Способ является технологически более безопасным. Достигаемый выход около 60% при чистоте 90%. 3 з.п.ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и к способу выделения гиполипемического активного вещества ловастатина из бродильного бульона. Ловастатин вырабатывается как вторичный метаболит гриба Aspergillus terreus (US 4231938), хранящегося в Американской Коллекции Типированных Культур под номерами АТСС 20541, АТСС 20542, и Monascus ruber хранящегося в Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Министерства международной торговли и промышленности, Япония (DE 3006216 А1) под номером Ferm 4822.

Известны также другие виды микроорганизмов, вырабатывающих ловастатин, например мутант микроорганизма Aspergillas terreus и Aspergillus oryzae обозначенный АТСС 74135.

Ловастатин химически представляет собой 5-лактон 1',2',6',7',8а',-гексагидро-3,5-дигидрокси-2, '6'диметил-8'-2''-метил- 1''-оксобутокси)-1-нафталин гептановой кислоты (Stubbs и др., 1986) формулы [1].

Активная форма ловастатина также является кислотой, которая химически представляет собой 1,2,6,8,8а-гексагидро- β,δ -дигидрокси-1-нафталин гептановую кислоту (Alberts и др., 1980) формулы [2].

Лактонная форма ловастатина применяется в качестве агента, снижающего уровень холестерина в крови (Scott M.G. и Vega G.L., 1985). Она ингибирует биосинтез мевалоновой кислоты посредством ингибирования З-гидрокси-З-метилглутарилкофермент А-редуктазы (HMG-СоА-редуктаза, E.C.1.1.1.34) (Zubay и др., 1964).

После завершения ферментации ловастатин присутствует в бульоне в форме лактона (соединение I) и в форме кислоты (соединение II). Наиболее близким по технической сущности к заявленному является способ выделения [3], в котором ловастатин экстрагируют из бульона этилацетатом. Этот экстракт концентрируют перегонкой в вакууме. Поскольку ловастатин присутствует как в лактонной, так и в кислотной форме, и только лактон представляет коммерческий интерес, кислотную форму необходимо превратить в лактон. Лактонизацию выполняют посредством нагревания с вертикальным холодильником этого концентрата в толуоле при 106^oC течение 2 ч. После завершения лактонизации раствор концентрируют до малого объема. Чистое вещество получают посредством очистки концентрата на колонках с силикагелем в присутствии растворителей, таких как этилацетат или н-гексан. Собранные фракции снова концентрируют в вакууме, и затем чистый ловастатин кристаллизуется в лактонной форме.

Благодаря сложной многоэтапной процедуре и жестким условиям выделения, выходы ловастатина обычно низкие. Используются различные растворители, частью проявляющие токсичность, такие как бензол, толуол, ацетонитрил или этилацетат. Следовательно, работа с этими растворителями угрожает здоровью людей, занятых в этом процессе, и представляет проблему для окружающей среды.

Задачей изобретения является создание эффективного и экономичного способа выделения ловастатина. Помимо этого, необходимо уделить внимание вопросам здоровья рабочих, занятых выделением ловастатина, и окружающей среде.

Поставленная задача достигается способом, включающим экстракцию ловастатина из сырья, полученного на основе гриба-продуцента ловастатина, концентрирование экстракта при пониженном давлении и кристаллизацию целевого продукта, при этом экстракцию ловастатина проводят бутилацетатом из культуральной жидкости, ее фильтрата или мицелия гриба-продуцента, а концентрирование экстракта ведут при температуре выше 40^oC. В способе изобретения используют гриб-продуцент, предпочтительно относящийся к роду Aspergillus, в особенности к виду Aspergillus terreus или Aspergilius oryzae. Наиболее предпочтительно, когда в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

В соответствии со способом изобретения ловастатин может быть получен исключительно в лактонной форме. Неожиданно было обнаружено, что применяемый растворитель, т. е. бутилацетат, обладает свойствами, облегчающими достижение этой цели. А именно, в процессе лактонизации выделяется вода и ее необходимо удалять из реакционной среды. Поскольку бутилацетат обладает более высокой температурой кипения и не образует в значительной степени азеотропных смесей с водой при данных условиях, практически вся вода, которая образуется в процессе лактонизации, может быть удалена.

Благодаря способу изобретения возможно значительное сокращение времени выделения ловастатина. Поскольку бутилацетат можно применять для экстрагирования ловастатина из образца, и в то же время для выполнения лактонизации могут быть устранены токсические эффекты других растворителей. Этот процесс можно воспроизвести в промышленных масштабах с конечными выходами около 60%, независимо от того, производится ловастатин микроорганизмами интрацеллюлярно или экстрацеллюлярно, в лактонной или в кислотной форме.

Выделенное вещество является тем же веществом, которое выделяют в соответствии с ранее известными способами. Структура подтверждена ИК-спектроскопией (фиг. 1), масс-спектроскопией (фиг. 2), ЯМР (фиг. 3) и УФ-спектроскопией (фиг. 4).

Пример 1. Бродильный бульон (1000 мл), полученный ферментацией в течение 120 ч Aspergillus terreus (АТСС 20452) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135), имеющий pH 4,8 и содержание ловастатина 300 мкг/мл (лактон+кислота), подкисляют HCl (36%) до pH 3-5. Бродильный бульон затем охлаждают до температуры ниже 20^oC, добавляют бутилацетат и экстрагируют при этой температуре в течение 4 ч. После завершения экстракции его центрифугируют и разделяют водную и органическую фазы. Мицелий и водную фазу удаляют, а органическую фазу подвергают дальнейшей обработке. Ее концентрирование осуществляют перегонкой при пониженном давлении 85-88 м бар при температуре 58-60^oC до объема 50 мл. Одновременно с концентрированием проводят лактонизацию. Концентрат затем охлаждают до температуры ниже 20^oC и оставляют на несколько часов для кристаллизации ловастатина. Полученный сырой продукт подвергают перекристаллизации. Получают ловастатин (170 мг) в лактонной форме, очищенный более чем на 90%.

Пример 2. Ферментационный бульон (1000 мл), полученный ферментацией в течение 120 ч Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135), имеющий pH 4,73 и содержание ловастатина 190 мкг/мл (лактон+кислота) в фильтрате и 15 мкг/мл в мицелии, подкисляют HCl (36%) до pH 3-5. Бульон фильтруют через фильтр Оливера. Мицелий удаляют, фильтрат охлаждают до температуры ниже 20^oC и добавляют половину объема бутилацетата. Экстракцию осуществляют в течение 1 ч, дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Получают ловастатин (79 мг) в лактонной форме, очищенный более чем на 90%.

Пример 3. Ферментационный бульон (1000 мл), полученный ферментацией в течение 120 ч Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135), имеющий pH 4.78 и содержание ловастатина 5 мкг/мл (лактон+кислота) в фильтрате и 300 мкг/мл в мицелии, подкисляют HCl (36%) до pH 3-5 и центрифугируют. Фильтрат удаляют, к мицелию добавляют 4-кратный объем бутилацетата и охлаждают его до температуры ниже 20^oC. Экстракцию осуществляют в течение 4 ч с последующим центрифугированием. Мицелий отделяют, а фильтрат обрабатывают, как в примере 1. Получают ловастатин (90 мг) в лактонной форме, очищенный более чем на 90%.

Формула изобретения

1. Способ выделения ловастатина, включающий экстракцию его из сырья, полученного на основе гриба - продуцента ловастатина, концентрирование экстракта при пониженном давлении и кристаллизацию целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию ловастатина проводят бутилацетатом из культуральной жидкости, ее фильтрата или мицелия гриба-продуцента, а концентрирование экстракта ведут при температуре выше 40^oC.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют гриб-продуцент, относящийся к роду Aspergillus.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют гриб-продуцент, относящийся к виду Aspergillus terreus или Aspergillus oryzae.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus terreus ATCC 20542 или Aspergillus oryzae ATCC 74135.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4