Способ анализа липопротеинов в плазме или сыворотке крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния

 

Изобретение относится к технологии анализа биологических материалов, а именно к способам определения фракционного состава (ФС) липопротеинов (ЛП) в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) для последующей диагностики состояния организма человека. Способ включает приготовление основного образца, представляющего собой цельную плазму или сыворотку крови с добавлением в этот образец рентгеноконтрастного вещества и дополнительного образца для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения. Дополнительный образец представляет собой водный растворитель белков с добавлением того же рентгеноконтрастного вещества. Оба образца облучают коллимированным рентгеновским излучением и проводят измерение интенсивности рассеяния I(h) излучения в диапазоне малых углов с последующей математической обработкой. В качестве рентгеноконтрастного вещества используют инертные к белкам вещества. Дополнительно измеряют полную интенсивность P_o рентгеновского пучка с последующим определением концентраций C_к1 отдельных фракций липопротеинов. Это позволит определить абсолютные значения концентраций отдельных фракций липопротеинов. 2 ил., 3 табл.

Изобретение относится к технологии анализа биологических материалов, а именно к способам определения фракционного состава (ФС) липопротеинов (ЛП) в плазме или сыворотке крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) для последующей диагностики состояния организма человека или животного.

Липопротеиновые комплексы, содержащиеся в плазме крови и представляющие собой устойчивые коллоидные растворы, включают липиды и апопротеины. Для каждого типа липопротеина специфична его белковая часть - апопротеин, которая определяет свойства комплекса в целом и его клинико-физиологическое значение. Липидная часть менее специфична, так как разные липопротеины содержат одни и те же липидные вещества, но в разных соотношениях. Исследовав липидный состав плазмы, можно лишь приблизительно оценить ее липопротеиновый состав.

Различают четыре группы, или семейства, липопротеинов. Наиболее крупные частицы у хиломикронов и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), они богаты триглицеридами, содержат апопротеины, обозначаемые латинской буквой C. Менее крупные частицы - липопротеины низкой плотности (ЛПНП), которые содержат апопротеины группы B, при электрофорезе попадают главным образом в β -полосу. Самые мелкие частицы - это липопротеины высокой плотности (ЛПВП), в состав которых входят апопротеины A, при электрофорезе они попадают в α -полосу.

Поскольку современная лабораторная иммунодиагностика не располагает простыми и надежными методами количественного определения индивидуальных липопротеинов по их апопротеинам, используют косвенные методы: электрофорез, осаждение гепарином и определение содержания отдельных липидов (Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. проф. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, с. 240-248) [1].

В плазме крови человека присутствуют четыре основных класса липидов: 1) холестерин и его эфиры; 2) триглицериды; 3) фосфолипиды; 4) неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК). Первые три класса веществ образуют комплексы с апопротеидами и входят в состав липопротеинов, НЭЖК главным образом адсорбированы на альбумине. Наибольшее клиническое значение имеет определение холестерина и триглицеридов. Клиническое значение НЭЖК значительно скромнее; фосфолипидам крови сейчас также не придают большого клинического значения. Для определения холестерина используются обычно характерные для него цветные реакции, триглициды определяют по количеству входящего в их состав глицерина, НЭЖК - титрометрическим методом, а фосфолипиды - по входящему в их состав фосфору.

Перспективен метод инфракрасной спектроскопии, позволяющий одновременно определять концентрацию нескольких различных липидов [1]. Самым точным методом определения холестерина считается ферментативный, основанный на действии холестериноксидазы, в результате чего образуется холестенон и перекись водорода. Оба эти вещества могут быть определены сравнительно простыми методами: холестенон - по изменению светопоглощения при длине волны 240 нм, а перекись водорода - методами, которые используются при определении глюкозы. Сложность ферментативного метода определения холестерина определяется дефицитом соответствующих ферментов, которые трудно очисть от каталазы, разрушающей перекись водорода, а также тем, что фермент активен лишь в отношении свободного холестерина, поэтому эфиросвязанный холестерин должен быть предварительно гидролизован.

Известен способ определения холестерина α -липопротеинов (нормальная величина 0,9-1,9 ммоль/л). Для этого вначале липопротеины, обладающие электрофоретической подвижностью β и пре- β , осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и удаляются центрифугированием, при этом хиломикроны всплывают, образуя пленку. В растворе остаются только α -липопротеины, в которых содержание холестерина определяют любым из описанным методов, например ферментативным с последующей спектрофотометрией или экстракционным методом по реакции с хлорным железом после экстракции изопропанолом [1]. Содержание холестерина α -липопротеинов в крови здоровых людей мало меняется с возрастом и не подвержено колебаниям вследствие различных других причин. Величины ниже 0,9 ммоль/л свидетельствуют о нарушении липидного обмена и угрозе развития атеросклероза. Повышение содержания холестерина α -липопротеинов, как и повышение общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброкачественным состоянием.

Известно определение фракций липопротеинов методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Предварительно липопротеины окрашивают. Для этого к 0,3 мл исследуемой сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и 0,05 мл трис-буфера pH 6,7, после чего смесь перемешивают и оставляют на 1 ч в темноте. После этого 0,03-0,05 мл препарата наносят на поверхность уже сформированного геля и подвергают электрофорезу в направлении сверху вниз в колонке, заполненной четырьмя слоями полиакриламидного геля. Нижний слой геля самый мелкопористый, верхний самый крупнопористый. Липопротеины в зависимости от размера их молекул задерживаются в разных участках геля. Электрофорез проводят в течение 1-4 ч при силе тока 4-5 мА на трубку. После окончания электрофореза гель фиксируется, сушится и сканируется с помощью специального устройства (сканера) [1]. Для получения количественных результатов при электрофоретическом разделении липопротеинов в геле акриламида используют варианты денситометрии и элюции. Однако на практике при фенотипировании гиперлипидемий используют визуальные оценки электрофореграмм: констатируют увеличение или уменьшение количества хиломикрон, ЛПНП ( β ) или ЛПОНП (пре- β -фракции) и ЛПВП ( α -ЛП) при сравнении с нормой.

К недостаткам данного способа относится использование значительного числа реактивов, дополнительного оборудования и сложных методик приготовления красителей, геля, а также необходимость сканирования. Кроме того, этот метод не является количественным, трудно воспроизводим, а распределение (разделение) ЛП на фракции происходит по сложноопределяемому параметру - электрофоретической подвижности. Общее время анализа может составлять 7 - 12 ч. Однако именно этот метод принят ВОЗ как основной из-за его относительной экспрессности и распространенности данного оборудования. Метод используется для диагностирования дислипопротеинемий (ДЛП).

Известен способ определения ФДС ЛП крови методом ультрацентрифугирования (УЦ), заключающий в предварительном окрашивании ЛП суданом черным, помещении окрашенного образца плазмы (сыворотки) крови в специальные пробирки и разделение ЛП на фракции при центрифугировании в течение 24 - 48 ч. Скорость вращения ротора центрифуги должна составлять 40 тыс. оборотов в минуту и более (Попов А.В., Андреева Л.И., Кузнецов А.С. Вопросы мед. химии, 1975, т. 21, N 4, с. 434-437) [2].

К недостаткам данного способа относится необходимость использования значительного числа реактивов, использование дополнительного оборудования и длительность анализа. Кроме того, этот способ также не является количественным, плохо воспроизводим, а разделение на фракции происходит тоже по сложноопределяемому параметру - плавучей плотности. Следует отметить, что для более качественного разделения на фракции ЛП в данном способе перед началом анализа в буфер образца добавляют соли типа NaBr для обеспечения в образцах заданной плотности, что также приводит к использованию дополнительных реактивов в значительном количестве, а объем образца может составлять 10-20 мл. После процесса разделения ЛП на фракции в ультрацентрифуге по данному способу проводится сканирование разделенных фракций оптическим методом с помощью специального приспособления, что приводит к усложнению способа: использованию дополнительного оборудования и увеличению продолжительности анализа. Общее время анализа ЛП по данному способу может составлять более 40 ч.

Известен способ определения ФС ЛП крови методом спектроскопии оптического смешения (СОС), заключающимся в предварительном отделении ЛП крови от других белков плазмы с помощью высокоскоростного ультрацентрифугирования в течение 24-48 ч, просвечивании образца ЛП в кювете лазерным излучением и измерении спектра рассеянного излучения вблизи длины волны лазерного излучения, математической обработки полученного при измерении физического сигнала (спектра) - I (λ) с помощью ЭВМ, определении ФС ЛП по размерам (радиусам ЛП) - N(R) (Климов А.Н., Шмелев Г.Е. и соавт. Биофизика, 1982, т. 27, N 3, с. 458-462) [3].

Недостатком данного способа является необходимость предварительного отделения ЛП плазмы крови от других белков крови, для чего используется дорогостоящее оборудование и в связи с этим увеличивается общая длительность анализа до 25-50 ч. Возможны изменения ФС ЛП при выделении ЛП в процессе УЦ. Данный способ также не дает количественных данных по ФС ЛП. Кроме того, метод СОС имеет низкое разрешение по размерам частиц ЛП, так как используется оптический диапазон длин волн ( λ = 4000 - 8000А), а размеры ЛП: 50-600 А. Все это приводит к низкой точности определения ФС ЛП крови, особенно в отношении ЛП малого размера - ЛПВП. Следует отметить также пониженную информативность метода СОС вследствие косвенных оценок размера ЛП через так называемый гидродинамический радиус частиц (R), который определяется из коэффициента диффузии и стоксовского приближения.

Известен способ анализа структуры отдельных фракций ЛП, заключающийся в предварительной подготовке образцов для анализа путем отделения исследуемых фракций ЛП от других белков плазмы крови с помощью препаративного ультрацентрифугирования, а также приготовление буферной смеси, используемой для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения. В образец и буфер вводят рентгеноконтрастное вещество (РКВ) с последующим их просвечиванием коллимированным рентгеновским пучком и измерением малоугловых рентгенограмм рассеяния от образца и буферной смеси. После математической обработки полученных данных на ЭВМ вычисляют структурные параметры ЛП. С помощью данного способа оценивается степень гомогенности и полидисперсности выделенных фракций ЛП плазмы крови (Laggner P. and Mul- ler K.W. Quart. Rev. of Biophysics, 1978, v. 11, N 3, p. 371-425) [4].

Недостатком данного способа является то, что при этом способе исследуются (анализируются) структуры только отдельных фракций и буфракций ЛП. Для этого исследуемые фракции ЛП отделяют от других белков плазмы крови, используя дополнительное оборудование (ульрацентрифуга), в течение 24-48 ч. В данном способе для анализа ЛП не может быть использована цельная плазма крови из-за не учета вклада в рентгенограмму рассеяния ЛП мешающего рассеяния от других белков крови (альбумин, α,β,γ -глобулины и др.). Общее время анализа по данному способу 26-51 ч и более.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ анализа липопротеинов в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния, включающий приготовление основного образца, представляющего собой цельную плазму или сыворотку крови с добавлением в этот образец РКВ, и дополнительного образца для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения, представляющего собой водный растворитель белков плазмы крови с добавлением того же РКВ, которое вводят в сухом виде в количестве, достаточном для получения в образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек липопротеинов и свободных белков плазмы крови, облучение обоих образцов коллимированным рентгеновским излучением и измерение интенсивности рассеяния (I(h)) рентгеновского излучения в диапазоне малых углов с последующей математической обработкой, включающей вычитание фонового рассеяния от дополнительного образца и вычисление параметров фракционного состава липопротеинов функции D_v(R), причем в качестве РКВ используют инертные к белкам вещества с плотностью (ρ) более 1,5 г/см³ и значением массового коэффициента ослабления рентгеновского излучения (μ_a) , удовлетворяющем условию μ_a< k·d_opt·λ³[см²/г], где d_opt - оптимальная толщина слоя анализируемого образца [см]; λ - длина волны рентгеновского излучения [см]; k = 6·10²⁵ [1/г·см²] - размерный коэффициент (Заявка на патент РФ N 93056527/14, кл. G 01 N 23/201, опубл. 1993) [5].

Недостатком способа-прототипа является то, что он позволяет определять значения ФС отдельных фракций ЛП и их суммарные значения только в относительных единицах, но не позволяет определять абсолютные значения концентраций, отдельных фракций ЛП, что снижает точность диагностирования состояния организма человека или животного или фенотипирования заболеваний, так как для этого необходимо количественное сравнение значений концентраций фракций ЛП в принятых единицах измерения для норм и патологий.

Задачей предлагаемого технического решения является создание такого способа анализа ЛП в плазме крови методом МУРР, который позволил бы определять абсолютные значения концентраций отдельных фракций липопротеинов непосредственно в цельной (нативной) плазме или сыворотке крови.

Указанная задача решается тем, что в способе анализа ЛП в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния, включающем приготовление основного образца, представляющего собой цельную плазму или сыворотку крови с добавлением в этот образец рентгеноконтрастного вещества и дополнительного образца для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения, предоставляющего собой водный растворитель белков, с добавлением того же рентгеноконтрастного вещества, которое вводят в сухом виде в количестве, достаточном для получения в образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек липопротеинов в плазме крови и свободных белков плазмы крови, облучение обоих образцов коллимированным рентгеновским излучением и измерение интенсивности рассеяния (I(h)) излучения в диапазоне малых углов с последующей математической обработкой, включающей введение поправок на фоновое рассеяние от дополнительного образца, поглощение, коллимацию и вычисление параметров фракционного состава липопротеинов, причем в качестве рентгеноконтрастного вещества используют инертные к белкам вещества с плотностью (ρ) более 1,5 г/см³ и значением массового коэффициента ослабления рентгеновского излучения (μ_a) , удовлетворяющем условию μ_a< k·d_opt·λ³[см²/г], где d_opt - оптимальная толщина слоя анализируемого образца [см]; λ - длина волны рентгеновского излучения [см]; k=6·10²⁵[г^-1·см^-2] - размерный коэффициент, согласно изобретению, кроме измерения интенсивности рассеяния (I(h)) излучения в диапазоне малых углов от обоих образцов дополнительно измеряют полную (суммарную) интенсивность (P₀) рентгеновского пучка с последующим определением концентраций (C) отдельных фракций липопротеинов по следующей формуле: где C_kl - концентрация липидных ядер одной из фракций липопротеинов (ЛПВП, ЛПНП или ЛПОНП);
ΔR_i - интервал между двумя соседними точками по шкале радиусов липидных ядер в распределении их по размерам, определяемом из рентгенограммы МУРР;
k, l - номера точек в распределении, соответствующие началу и окончанию отдельной фракции липопротеинов (определяются из вида распределений и априорных данных о диапазонах размеров липопротеинов во фракциях);
R_i - радиус липидных ядер липопротеинов;
P₀ - интенсивность рентгеновского пучка (импульс · с^-1 · см^-1);
I(0) - интенсивность рассеяния от анализируемого образца липопротеинов в нулевой угол (h=0), (импульс · c^-1);
M_i - молекулярная масса сферических ядер липопротеинов (Д - дальтон); (M_i= V·ρ_л/1,66 = 2,4·R³_i, для липидов);
Q₀ - аппаратная константа, учитывающая параметры съемки рентгенограмм и специфику рассеивающих свойств липидов;
D_v(R_i) - значения функции распределения ядер липопротеинов по размерам (вычисляются по определенному алгоритму на ЭВМ с использованием измеренных рентгенограмм МУРР (I(h)) от анализируемого образца при тех же параметрах съемки, при которых измеряют значение P₀).

Определение ФС ЛП в цельной плазме крови становится возможным за счет доведения с помощью РКВ в исследуемых образцах плотности водного растворителя белковых компонентов плазмы крови до плотности, равной плотности белков (1,27 г/см³). При этом обеспечивается получение такого образца цельной плазмы крови, в котором "видимыми" для рентгеновского рассеяния становятся только ядра липопротеинов, ФС которых и определяется. Использованием в качестве РКВ инертных к белкам веществ обеспечивается снижение систематических погрешностей анализа за счет отсутствия взаимодействий ЛП с РКВ. При использовании РКВ, плотность которых меньше 1,5 г/см³, т.е. близка к средней плотности белков (ρ = 1,27 г/см³), резко снижается концентрация липопротеинов в образце плазмы крови за счет значительного разведения образца при добавлении РКВ. При использовании РКВ, массовый коэффициент (μ_a) ослабления рентгеновского излучения которых больше значения, удовлетворяющего условию
μ_a> k·d·λ³[см²/г],
резко возрастает длительность процесса измерения I (h) вследствие сильного поглощения рассеянного излучения рентгеноконтрастным веществом. Таким образом, при использовании предлагаемых рентгеноконтрастных веществ достигается минимальное поглощение рассеянного рентгеновского излучения при минимальном разведении исследуемого образца плазмы крови. Вследствие этого статистические и систематические погрешности сводятся к минимуму.

Измерение такого физического параметра как P₀(суммарная интенсивность рентгеновского пучка) позволяет определить по выше приведенной формуле абсолютные суммарные их концентрации в цельной (нативной) плазме крови.

На фиг. 1 приведен график рентгенограммы МУРР в координатах I(h) · h⁴, h, полученной от образца плазмы крови в диапазоне углов 0,01 < h < 0,11 (с введенными поправками на фон, сглаживание и коллимацию). На фиг. 2 изображен график функции Dv(R) - распределения частиц (сферические липидные ядра ЛП) по размерам (фракции ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП) в диапазоне R=10-300 А (здесь R - радиус частиц).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Берут точно отмеренный объем образца нативной плазмы или сыворотки крови (50-100 мкл) и такой же объем образца буферной (дополнительный образец) смеси (физраствора), используемого в качестве водного растворителя белковых компонентов плазмы крови, и смешивают отдельно каждый образец с предварительно взвешенной сухой массой выбранного рентгеноконтрастного вещества c ρ > 1,5 г/см³ и с μ_a< k·d_opt·λ³ [см/г] (так как μ_a~ λ³ ). Например, для λ = 1,54A (CuK α -излучение) μ_a< 22 см²/г , а d_opt определяется как d_opt= 1/μ , где μ - линейный коэффициент ослабления рентгеновского излучения слоем образца исходной плазмы крови без РКВ. Для физраствора без РКВ μ = 10 см^-1 , а d=0,1 см. В качестве РКВ могут быть использованы, например, сахароза, соли LiNO₃, NaNO₃ и другие вещества, а также их смеси, удовлетворяющие вышеприведенным условиям. Далее образцы встряхивают до полного растворения РКВ. Причем количество РКВ в этих образцах должно быть достаточным для получения в них плотности (ρ) растворителя белковых компонентов плазмы крови, равной плотности белков, белковых оболочек ЛП и свободных белков плазмы крови, т.е. ρ = 1,27 г/см³ (или ρ = 0,418 эл/А³ ). Для этого используют расчетную формулу [2]:

где
M - масса используемого РКВ; V - объем пробы образца; ρ₁ - плотность плазмы (или растворителя) крови; ρ₂ - требуемая конечная плотность пробы; ρ₃ - плотность сухого РКВ, используемого для увеличения плотности проб.

Например, для образца плазмы крови объемом V=50 мкл требуется сухой сахарозы (ρ = 1,59 г/см³) , используемой в качестве РКВ, массой M=67 мг.

Такая процедура подготовки образцов плазмы (сыворотки) крови и буферной смеси для анализа позволяет после проведенных измерений интенсивностей рассеяния (I(h)) от этих препаратов исключить рассеяние от всех присутствующих в плазме крови белков, включая рассеяние и от белковых компонент (апопротеиновых оболочек) ЛП. Далее последовательно помещают приготовленные образцы плазмы и буфера с РКВ в специальную кювету малоуглового дифрактометра и производят облучение коллимированным рентгеновским излучением, измерение интенсивностей рассеяния (I(h)) в диапазоне малых углов 0,01 < h< 0,11, где h = 4πsinΘ/λ; 2Θ - угол рассеяния в радианах; λ - длина волны используемого рентгеновского излучения в A. После измерения интенсивностей I(h) проводят предварительную математическую обработку полученных данных, включая вычитание фонового поглощения образцами. Поскольку известно, что структуры всех фракций ЛП крови имеют внешнюю форму, близкую к сферической, с липидными ядрами в центре и белковыми оболочками, то полученная после предварительной математической обработки интенсивность рассеяния I(h) содержит информацию только о близких к сплошным сферам липидных ядрах ЛП (например, о фракциях ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП с размерами от 10 до 300 А по радиусу R). Далее строят график (фиг. 1) рентгенограммы МУРР в координатах I(h) · h⁴, h, полученной от образца плазмы крови в диапазоне углов 0,01 < h < 0,11 (с введенными поправками на фон, сглаживание и коллимацию).

Кроме того, дополнительно измеряют полную (суммарную) интенсивность (P₀) рентгеновского пучка, например, методом движущейся щели с использованием специального устройства, имеющегося в комплекте дифрактометра фирмы "Siemens".

На заключительном этапе анализа по предлагаемому способу проводят еще одну математическую обработку данных (интенсивностей рассеяния (I(h)) с помощью специальной вычислительной программы на ЭВМ, используя известный алгоритм, основанный на Фурье-преобразовании (Letscher J.H.,Schmidt P.W., J.Appl. Phys., 1966, v. 37, p. 649-655), получая в итоге значения функции D_v(R) - функции распределения частиц (сферических липидных ядер ЛП) по размерам. График этой функции, изображенный, например, на фиг. 2, передает количественную информацию о фракционном составе ЛП плазмы крови, поскольку известно, что белковые оболочки у всех фракций ЛП примерно одинаковы и их толщина составляет 20-22А.

Концентрации (C_kl) отдельных фракций липопротеинов в плазме крови человека вычисляют (с использованием ЭВМ) по формуле

Пример. Количественный анализ ФС ЛП в реальных образцах плазмы крови пациентов методом МУРР.

В эксперименте использовали кровь, взятую из пальца, следующих пациентов: пациент 1 (мужчина, 35 лет, нормолипидемия, контроль), пациент 2 (мужчина, 45 лет), пациент 3 (женщина, 36 лет) и пациент 4 (женщина, 55 лет).

Объем использованных для анализа образцов цельных сывороток крови - 0,05 мл. В качестве РКВ использовалась сухая сахароза (ρ = 1,59 г/см³) . Плотность буфера 1,27 г/см³. Общее время анализа одного образца составило 1,5 ч. Для измерения интенсивностей МУРР использовали малоугловой рентгеновский дифрактометр фирмы SIEMENS (Германия). В табл. 1 и ниже по тексту приведены экспериментальные данные и значения аппаратных констант, используемых для количественного определения ФС ЛП плазмы крови пациентов 1-4 по предлагаемому способу в соответствии с формулой


P_o=14,19·10⁷ (имп·c^-1·c^-1 - полная интенсивность рентгеновского пучка;
ΔR_i= 5·A = 5·10^-8 см;
Q_o= 3,3·10⁷мг²/см - аппаратная константа, учитывающая параметры съемки рентгенограмм и специфику рассеивающих свойств липидов (толщина образца, расстояние от образца до приемной щели детектора, электронная плотность растворителя и липидов и т.п.).

На фиг. 1 приведены данные МУРР (в виде графика), измеренные от образца сыворотки крови пациента 1 по предложенному способу. Вычтено фоновое рассеяние, проведено сглаживание, введены поправки на поглощение и коллимацию. На фиг. 2 представлен график вычисленной из данных МУРР фракции D_v(R), характеризующий ФС ЛП анализируемого образца плазмы крови пациента 1 (фракции ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП). Аналогичные графики для остальных образцов сыворотки крови (пациенты 2-4) не приведены.

В табл. 2 представлены количественные результаты анализов ФС ЛП плазмы крови пациентов 1-4. Полученные в результате анализа по предлагаемому способу данные о ФС ЛП плазмы крови 4-х пациентов, приведенные в табл. 2, хорошо соответствуют данным о суммарных концентрациях липидов ЛП крови, получаемым способом - аналогом [1], основанном на методе инфракрасной спектроскопии, позволяющем одновременно определять концентрацию нескольких различных липидов. В табл. 3 для сравнения приведены контрольные значения концентраций липидных ядер ЛП для здоровых людей в возрасте 35-55 лет.

Из вышеизложенного следует, что предлагаемый способ является экспрессным и позволяет в отличие от известных аналогов и прототипа определять абсолютные концентрации отдельных фракций липопротеинов непосредственно в цельной (нативной) плазме или сыворотке крови.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине, пищевой промышленности и в научных исследованиях.

Формула изобретения

Способ анализа липопротеинов в плазме или сыворотке крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния, включающий приготовление основного образца, представляющего собой цельную плазму или сыворотку крови, с добавлением в образец рентгеноконтрастного вещества и дополнительного образца для учета фонового рассеяния рентгеновского излучения, представляющего собой водный растворитель белков с добавлением того же рентгеноконтрастного вещества, которое вводят в сухом виде в количестве, достаточном для получения в образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек липотротеинов в плазме крови и свободных белков плазмы крови, облучение обоих образцов коллимированным рентгеновским излучением и измерение интенсивности рассеяния I(h) излучения в диапазоне малых углов с последующей математической обработкой, включающей вычитание фонового рассеяния от дополнительного образца и вычисление параметров фракционного состава липопротеинов, причем в качестве рентгеноконтрастного вещества используют инертные к белкам вещества с плотностью более 1,5 г/см³ и значением массового коэффициента ослабления рентгеновского излучения μ_a, удовлетворяющем условию
μ_a< K·d_opt·λ³,
где d_opt - оптимальная толщина слоя анализируемого образца, см;
λ - длина волны рентгеновского излучения, см;
K = 6 · 10²⁵ г^-1 · см^-2 - размерный коэффициент,
отличающийся тем, что кроме измерения интенсивности рассеяния I(h) излучения в диапазоне малых углов от обоих образцов дополнительно измеряют полную (суммарную) интенсивность P_о рентгеновского пучка с последующим определением концентрации C_k1 отдельных фракций липопротеинов по следующей формуле:

где C_k1 - концентрация одной фракции липопротеинов;
ΔR_i - интервал между двумя соседними точками по шкале радиусов липидных ядер в распределении их по размерам, определяемом из рентгенограммы МУРР;
k, 1 - номера точек в распределении, соответствующие началу и окончанию отдельной фракции липопротеинов (определяются из вида распределений и априорных данных о диапазонах размеров липопротеинов во фракциях;
R_i - радиус липидных ядер липопротеинов;
P_o - интенсивность рентгеновского пучка, импульс · с^-1 · см^-1;
I(0) - интенсивность рассеяния от анализируемого образца липопротеинов в нулевой угол (h = 0), импульс · с^-1;
M_i - молекулярная масса сферических ядер липопротеидов (Д - дальтон), M_i = V · ρ_λ /1,66 = 2,5 · R_i³ - для липидов;
Q_o - аппаратная константа, учитывающая параметры съемки рентгенограмм и специфику рассеивающих свойств липидов;
D_v(R_i) - значения функции распределения ядер липопротеинов по размерам (определяются с помощью вычислений по определенному алгоритму на ЭВМ с использованием измеренных рентгенограмм МУРР (I(h)) от анализируемого образца при тех же параметрах съемки, при которых измеряют значение P_o.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3