Способ получения ликопина

 

Изобретение относится к молочной промышленности. Мицелиальные грибы Blakeslea trispora (+)Т, (-)Т, (+)904 ВКМF, (+) 903 ВКМF, (+) 812 ВКМF выращивают раздельно, а затем совместно на питательной среде. Питательная среда содержит в качестве источника углерода и азота - 4% соевой муки, и 1,75% кукурузной муки, источник фосфора -КН₂PO₄ в количестве 0,05%, подсолнечное масло в количестве 5% с добавлением 0,005% 2-амино-6-метилпиридина. Выращивание осуществляют в более аэробных условиях в течение 86-92 ч. Получают биомассу, экстрагируют ликопин подсолнечным маслом. Затем проводят кристаллизацию с использованием этанола и толуола с последующей колоночной хроматографией. Это позволяет увеличить выход ликопина.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ликопина.

В последние годы в научной литературе появился новый термин "антиоксидантные витамины" [1]. В первую очередь к ним относятся каротиноиды - природные ярко окрашенные пигменты, образуемые растениями, водорослями, прокариотами (бактериями) и низшими эукариотами (грибами). Среди этих каротиноидов, представляющих собой C₁₀-полиены, наибольшее внимание в настоящее время привлекает ликопин, имеющий темно-розово-фиолетовое окрашивание.

Основным свойством ликопина, вызывающим повышенный интерес, является его способность выступать в качестве очень мощного антиоксиданта, тормозящего развитие процесса перекисного окисления липидов. Это свойство ликопина позволило в последние годы найти ему широкое применение в медицине. Ликопин в виде различных лекарственных форм используют как профилактическое радиопротекторное средство [2], антиканцерогенный препарат, который применяют в комплексной профилактике ряда раковых заболеваний (рак простаты, легких, желудка), антисклеротическое средство при лечении атеросклероза, катаракты, ишемической болезни сердца.

Благоприятный эффект ликопина показан при использовании его как адаптогена при действии неблагоприятных климатических условий и смене часовых поясов.

Помимо значения ликопина как перспективного медицинского препарата, этот пигмент предполагается все шире использовать как краситель для пищевых изделий и в парфюмерии. Добавление ликопина в кондитерские изделия, к растительным маслам, к мазям и кремам обеспечивает не только окрашивающий эффект, но и оказывает оздоровительное действие.

До сих пор основным источником получения ликопина были растения, в частности специально отселекционированные сорта томатов. Однако, биотехнологии с использованием в качестве продуцентов ликопина низших грибов, обладают значительно большей эффективностью. В этом случае производству не грозит сезонность и угроза потери урожая от действия неблагоприятных погодных факторов или патогенных микромицетов. Кроме того, микробиологические производства обладают высокой и неограниченной товароемкостью, а также дают возможность получать ликопин в виде all-trans-формы [3].

Известны несколько способов получения ликопина с использованием в качестве продуцентов микроскопических грибов, в частности мукоровых гетероталличных (+) и (-) штаммов. В качестве стимуляторов синтеза ликопина используют гетероциклические азотсодержащие соединения - пиридин, имидазол, морфолин и их производные [4-6].

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ликопина [7], согласно которому продуцентами синтеза ликопина являются A-732-3 (+) и A-732-3 (-) штаммы Blakeslea trispora. Споровый материал выращивают на косячках картофельно-морковной среды в течение 6-7 сут при t=28-29^oC. Штаммы (+) и (-) Blakeslea trispora отдельно выращивают при t=28^oC на гидролизной среде, содержащей 47 г соевой муки и 23 г кукурузной муки (на 1 л воды), далее вносят 2,8 мл конц. H₂SO₄ и стерилизуют при 1 атм. 1,5 ч. После стерилизации устанавливают pH 6,7-6,8 и добавляют 0,5 г KH₂PO₄.

Двухсуточный, разбитый на отдельные фрагменты мицелий (+) и (-) штаммов в количестве 20% по объему помещают в негидролизованную мучную среду (кукурузно-соевую в соотношении 1:9 соответственно с 4% подсолнечного масла), добавляют аминометил-замещенные пиридины, в частности 2-амино-6-метилпиридин, в концентрации 0,005% и выращивают 72 ч на качалке. Выход ликопина, согласно спектрофотометрическому определению составляет 0,7 г/л [8]. Для получения кристаллического ликопина проводят экстракцию биомассы горячим (85^oC) подсолнечным маслом. После кристаллизации при охлаждении промывают препарат этанолом. Дальнейшая очистка ведется перекристаллизацией из толуола кипящим абсолютным этанолом. Получают 97% ликопин. Для получения ликопина, не содержащего примесей других каротиноидов, используют колоночную хроматографию на окиси алюминия.

Основным недостатком данного способа является низкий выход ликопина, что отрицательно сказывается на рентабельности производства.

Поэтому целью настоящего изобретения является повышение выхода ликопина и расширение числа продуцентов.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что мицелиальные грибы, относящиеся к порядку Phecomycetes, семейству Choanephoraceae - Blakeslea trispora T(+) и T(-) штаммы [9] BKMF, 904(+), 903(+), 812(+) выращивают раздельно на косяках картофельно-морковного агара в течение 10-14 сут при t= 24^oC. В этом случае споровым посевным материалом являются только споры, образованные в спорангиолях (СП-споры). В качестве инокулята используют 48-50-часовые мицелии (+) и (-) штаммов в соотношении 1:7 соответственно и количестве 20% по объему. Выращивание ведут на кукурузно-соевой среде с добавлением 5% подсолнечного, кукурузного или хлопкового масла и 20% 7 Б сусла, создавая более аэробные условия (отношение объема к объему колбы - 1: 8) в течение 80-96 ч. Стимулятор ликопинообразования - 2-амино-6-метилпиридин вносят с посевным материалом при 0 ч. Выход ликопина - 1,3-1,5 г/л.

Примеры конкретного выполнения способа получения ликопина.

Пример 1. Подготовка спорового посевного материала осуществляется следующим образом. На косяках картофельно-морковного агара раздельно выращивают (-)T штамм и (+) 812 BKMF штамм в течение 7 сут при t=24^oC. В этих условиях получают однородный споровый материал, представленный только СП-спорами. СП-споры используют для получения (+) и (-) мицелиев. В качестве инокулята используют 2-суточные мицелии, которые вносят в ферментационную колбу в соотношении 1: 7 и количестве 20% по объему среды. Ферментацию проводят на кукурузно-соевой среде с добавлением 20% 7 Б сусла, 5% подсолнечного масла и 2-амино-6-метилпиридина (0,005%) в течение 90 ч. Для ферментации используют соотношение объема среды к объему колбы 1:8 соответственно. Выход ликопина составляет 1,5 г/л среды.

Пример 2. То же, что в примере 1, но в качестве спорового посевного материала используют стилоспоры (+) и (-) T штаммов B.trispora, образующиеся при выращивании на КМА при 29^oC. Выход ликопина составляет 0,9 г/л среды.

Пример 3. То же, что в примере 1, но соотношение посевных (+) и (-) мицелиев составляет 1:9. Выход ликопина составляет 1,2 г/л среды.

Пример 4. То же, что в примере 1, но используют среду без добавления 20% 7 Б сусла. Выход ликопина составляет 1,3 г/л среды.

Пример 5. То же, что в примере 1, но используют среду, содержащую 4% подсолнечного масла. Выход ликопина составляет 1,25 г/л среды.

Пример 6. То же, что в примере 1, но ферментацию ведут 72-74 ч. Выход ликопина составляет 1,1 г/л среды.

Пример 7. То же, что в примере 1, но отношение объема среды к объему колбы составляет 1:5. Выход ликопина составляет 1,0 г/л среды.

Пример 8. То же, что в примере 1, но в качестве продуцентов ликопина используют (-)T и (+) 904 штаммы B.trispora. Выход ликопина составляет 1,3 г/л среды.

Пример 9. То же, что в примере 1, но в качестве продуцентов ликопина используют (-)T и (+)T штаммы B.trispora. Выход ликопина составляет 1,4 г/л среды.

Пример 10. То же, что в примере 1, но в качестве продуцентов ликопина используют (-)T и (+)903 штаммы B.trispora. Выход ликопина составляет 1,3 г/л среды.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить (практически в два раза) выход целевого продукта за счет нового способа получения спорового посевного материала, изменения сроков и условий культивирования, установления новых соотношений (+) и (-) мицелиев в посевном материале, расширения числа штаммов продуцентов.

Литература 1. Капитонов А. Б., Пименов А.М. Каротиноиды как антиоксидантные модуляторы клеточного метаболизма.// Успехи современной биологии, 1966, т. 116, в. 2, с. 179-193.

2. Капитонов А.Б., Пименов А.М., Обухова Л.К., Измайлов Д.М. Радиозащитная эффективность ликопина.// Радиационная биология. Радиоэкология, 1994, т. 34, N 3, с. 67.

3. Porter I.W., Zscheile F.P.// Arch. Biochem. 1946, V. 10, N 1, p. 537.

4. Ninet I. , Renaut J., Tissier R. Procede de production de lycopene. //Патент Франции, N 1.403.839, 1965.

5. Ninet I., Renaut J., Tissier R. Activation of the Biosynthesis of Carotenoids by Blakeslea trispora.// Biotechnol. Bioengineering, 1969, v. 11, p. 1195-1210.

6. Феофилова Е. П. Каратиноиды грибов: биологические функции и практическое использование.// Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т. 30, в. 2, с. 181-195.

7. Ивакин А.Ф. Феофилова Е.П., Киселева А.И., Гаврилов А.С., Панова Н.А. , Терешина В.М., Кардюкова Н.П. и др. Способ получения ликопина. //Положительное решение на заявку N 95104293 от 22.03.95 (прототип) Опубликовано в Бюл.Описаний, N 34 10.12.96 г.

8. Терешина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. Экспресс-метод определения содержания ликопина и β каротина, 1994, т. 63, в. 6, с. 1111-1116.

9. Феофилова Е.П. Прогресс в области экспериментальной микологии как основа для создания современных биотехнологий.// Микробиология, 1997, т. 66, в. 3, с. 302-309.

Формула изобретения

Способ получения ликопина, включающий использование спорового посевного материала, раздельное в течение 48 ч, а далее совместное выращивание (+) и (-) мицелиев гриба продуцента Blakeslea trispora на питательной среде, содержащей в качестве источников углерода и азота 4% соевой муки и 1,75% кукурузной муки, источник фосфора KH₂PO₄ в количестве 0,05%, подсолнечное масло с добавлением 0,005% 2-амино-6-метилпиридина, получение биомассы, экстракцию ликопина подсолнечным маслом, кристаллизацию с использованием этанола и толуола и последующую колоночную хроматографию в системе н-гексан - ацетон 50 : 1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют (+) Т, (-) Т, (+) 904 ВКМ F, (+) 903 ВКМ F, (+) 812 ВКМ F, штаммы Blakeslea trispora, в качестве посевного материала используют СП-поры, соотношение посевных (+) и (-) мицелиев составляет 1 : 7, выращивание осуществляют в более аэробных условиях в течение 86 - 92 ч, а подсолнечное масло для выращивания используют в количестве 5%.