Фитопрепарат биогенного действия

 

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам на основе биологически активных веществ растительного происхождения, и может быть использовано в качестве средства, оказывающего противовоспалительное, иммуномодулирующее, анаболическое действие. Фитопрепарат биогенного действия содержит экстракт люцерны (50 - 90 мас.%) и наполнители, в качестве наполнителей глюконат кальция, сахарозу, стеарат кальция и тальк (9,6 - 53,0 мас.%). Изобретение обеспечивает расширение сферы применения препарата за счет отсутствия у него противопоказаний и побочного действия. 9 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам на основе биологически активных веществ растительного происхождения, и может быть использовано в качестве средства, оказывающего противовоспалительное, иммуномодулирующее, анаболическое действие.

Ближайшим аналогом изобретения является биогенный стимулятор "Биосед", представляющий собой водный экстракт свежей травы очитка большого. Препарат усиливает процессы обмена и регенерации, оказывает общетонизирующее и противовоспалительное действия. Применяют его также как вспомогательное средство для стимуляции обменных и регенерационных процессов в офтальмологической, стоматологической, хирургической и терапевтической практике (Машковский М.Д. Лекарственные средства. -М.: Медицина.-1993.-Ч. 2.-С. 175). Однако "Биосед" обладает побочным эффектом, так как при его применении могут отмечаться гиперемия и уртикальная сыпь, а также он имеет противопоказания (ахилия и злокачественные новообразования), что ограничивает сферу его применения.

Задача изобретения - расширение арсенала средств биогенного действия.

Технический результат - расширение сферы применения препарата за счет отсутствия у него противопоказаний и побочного действия.

Указанный технический результат достигается тем, что фитопрепарат биогенного действия содержит в качестве основы конденсированный экстракт люцерны и в качестве наполнителей глюконат кальция, сахарозу, стеарат кальция и тальк при следующем соотношении компонентов, мас.%: Конденсированный экстракт люцерны (в пересчете на 100% сухое вещество) - 50-90 Глюконат кальция - 4-25 Сахароза - 5-25 Стеарат кальция - 0,2-1 Тальк - 0,4-2 Конденсированный экстракт люцерны получают путем обработки сена - травы люцерны экстрагентом, содержащим растворимые соли металлов в мг на 1 кг растительной массы, например, в следующем соотношении: Mo-8,0; Ba-10,0; Pb-20,0; Co-1,05; V - 1,0; Cr-0,5; Zn-200; Fe-300; 0 Sn - 40,0 (патент СССР N 1839723, A 23 K1/00) или Mo - 4,0; Ba - 5,0; Pb - 10,0; Co - 1,05; Zn - 200; Fe - 300,0; Sn - 50,0. Он представляет собой смоловидную массу или сухие гранулы с остаточной влажностью 10 - 15%, из которых приготавливают 50%-ный раствор.

Заявляемый фитопрепарат получают следующим образом. 50%-ный раствор конденсированного экстракта люцерны тщательно перемешивают в фарфоровой ступке с порошком глюконата кальция до однородной массы. Массу выкладывают в кассеты из нержавеющей стали и сушат при температуре (45±5)^oC в течение 36 ч. Затем высушенную массу измельчают, просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм и смешивают с предварительно измельченной смесью сахарозы, стеарата кальция и талька до получения однородной таблеточной смеси. Порошок, полученный таким образом, хорошо таблетируется, сохраняя активность и свойства, предъявляемые ГФ XI издания. Готовый препарат представляет собой таблетки от кофейного до темно-коричневого цвета, горьковато кофейного вкуса и специфического запаха.

Пример 1. Для получения 1 кг таблеточной массы фитопрепарата в фарфоровой ступке тщательно перемешивают 900,0 г конденсированного экстракта травы люцерны и 44,0 г глюконата кальция до получения однородной массы и высушивают при (45±5)^oC в течение 36 ч. Затем массу измельчают, просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм и перемешивают измельченной смесью 50,0 г сахарозы, 2,0 г стеарата кальция и 4,0 талька до получения однородной таблеточной смеси. Затем полученную смесь таблетируют.

Пример 2. Технология приготовления препарата аналогична описанной в примере 1. Для смешивания берут 500,0 г конденсированного экстракта люцерны; 220,0 г глюконата кальция; 250,0 г сахарозы; 10,0 стеарата кальция и 20,0 г талька.

Башкирским госмедуниверситетом проведены экспериментальные испытания специфической и общей фармакологической активности предлагаемого фитопрепарата.

Противовоспалительное действие фитопрепарата изучали на модели каррагенированного воспаления лапок крыс (I серия опытов) и на модели вживления ватного тампона в подкожную клетчатку крыс (II серия). I серия опытов проведена на трех группах крыс по 6 в каждой. Предварительно у всех животных определяли онкометрический объем лапок. Затем животные 1-й группы получали внутрь таблетки фитопрепарата в дозе 50 мг/кг, 2-й группы - ортофен в дозе 10 мг/кг (ЕД₅₀), а 3-я группа была интактной. Далее у всех животных вызывали воспаление лапок субплантарным введением 0,1 мл 1%-ной суспензии каррегенина и определяли объем воспаленных лапок через 3, 6, 24, 48 и 72 ч. (табл. 1).

Вторую серию опытов проводили на трех группах крыс по 10 в каждой. Под легким нембуталовым наркозом (30 мг/кг) всем животным в подкожную клетчатку вживляли ватные тампоны весом 50 мг. Далее в течение 7 дней 1-я группа животных получала внутрь таблетки фитопрепарата в дозе 50 мг/кг, 2-я группа - ортофен в дозе 10 мг/кг, а 3-я была интактной. Затем животных забивали декапитацией, извлекали ватные тампоны, взвешивали их и высушивали в термостате при 60^oC в течение 3 дней и взвешивали повторно. По разнице веса "влажного" и "высушенного" тампона судили о влиянии препаратов на экссудативную фазу воспаления, а по разнице веса "высушенного" и исходного веса тампона судили о влиянии препаратов на пролиферативную фазу воспаления (табл. 2).

Таким образом, фитопрепарат обладает выраженной противовоспалительной активностью, проявляя антифлогистическую, антиэкссудативную и антипролиферативную активность.

Для оценки влияния фитопрепарата на иммунную систему были использованы следующие методы: 1. Определение весовых коэффициентов селезенки и тимуса.

У умерщвленных методом кранио-цервикальной дислокации животных брали тимус и селезенку, определяли их массу на торционных весах, а затем находили весовой коэффициент по формуле: 2. Определение числа антителообразующих клеток (АОК).

Влияние фитопрепарата на первичный гуморальный иммунный ответ оценивали путем подсчета АОК в селезенке по методу N.K.Eine и A.A.Nordin (1963) в модификации A.Y.Cunningham (1965).

В качестве корпускулярного антигена использовали отмытые эритроциты барана (ЭБ). Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением 5 · 10⁸ ЭБ на 20,0 массы мыши в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. На 5-й день животных умерщвляли, селезенки гомогенизировали в 10 мл раствора Хенкса (НПО "Иммунопрепарат"), суспензию пропускали через фильтр. Производили подсчет спленоцитов в камере Горяева и рассчитывали их число во всей селезенке. Смесь для заполнения камеры готовили путем добавления к 0,6 мл раствора Хенкса 0,1 мл 10% взвеси ЭБ в физиологическом растворе, 0,1 мл взвеси спленоцитов и 0,2 мл комплимента морской свинки (НПО "Иммунопрепарат"), разведенного в соотношении 1: 5 изотоническим раствором хлорида натрия. Затем камеры инкубировали в термостате при 37^oC в течение 1 ч. После инкубации подсчитывали число зон гемолиза в каждой камере, что соответствует числу АОК. Рассчитывали число АОК во всей селезенке и на 10⁶ спленоцитов.

3. Клеточный иммунный ответ изучали на модели гиперчувствительнсоти замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана по P.H.Lagrange et al (1974). Мышей сенсибилизировали подкожным введением 2 · 10⁷ ЭБ в 0,2 мл физиологического раствора хлорида натрия. Через 4 дня животным вводили под кожу правой стопы 10⁸ ЭБ в объеме 0,02 мл. В левую лапу вводили такой же объем изотонического раствора хлорида натрия. Через 24 ч мышей умерщвляли методом кранио-цервикальной дислокации, отрезали лапки на уровне голеностопных суставов и взвешивали на торзионных весах. Затем находили % прироста массы опытной лапки по по сравнению с контрольной.

4. Функциональную активность макрофагов и нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте. У мышей получали кровь и взвесь перитониальных макрофагов, добавляя гепарин в конечной концентрации 50 ЕД/мл.

Для постановки спонтанного НСТ-теста смешивали равные объемы крови либо взвеси перитонеальных макрофагов и 0,1% раствор нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе, инкубировали при 37^oC в течение 30 мин. Затем готовили препараты, которые окрашивали метиловым зеленым. Для постановки индуцированного НСТ-теста брали 0,05 мл крови либо взвеси перитонеальных клеток 0,05 мл взвеси грибов Candida albicans и 0,1 мл раствора нитросинего тетразолия. Следующие этапы соответствовали методике спонтанного НСТ-теста.

В каждом препарате подсчитывали 100 полиморфноядерных лейкоцитов либо макрофагов и определяли, в каком количестве из них имеются включения диформазона темно-синего цвета, что и соответствовало проценту активированных фагоцитов.

5. Фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов изучена относительно Candida albicans. Взвесь перитонеальных макрофагов получали промыванием брюшной полости умерщвленных мышей гепаринизированным забуференным физиологическим раствором. В качестве источника нейтрофилов использована гепаринизированная кровь. Суспензию лейкоцитов смешивали с взвесью убитых грибов Candida albicans в физиологическом растворе из расчета 10 микробных тел на 1 лейкоцит и инкубировали при 37^oC в течение 30 мин. Затем из смеси готовили мазки, которые фиксировали и красили по Романовскому-Гимза. Подсчитывали % фагоцитировавших лейкоцитов и интенсивность фагоцитоза (фагоцитарный индекс) - количество кандид, поглощенных одним фагоцитом (Пастер Е.У. и др., 1989).

Результаты опытов обрабатывали статистически с использованием критерия Стъюдента. Опыты провели на 286 белых беспородных мышах обоего пола. Фитопрепарат вводили энтерально в дозах 3 и 300 мг/кг, в одной серии была использована доза 30 мг/кг. Эталонным препаратом служил продигиозон в дозе 30 мкг/мышь (табл. 3-8).

Как показали исследования, введение препарата после иммунизации ЭБ как однократно, так и в течение 4 дней вызвало снижение массы и весового коэффициента селезенки. Наблюдается и снижение соответствующих показателей для тимуса (табл.3) за исключением весового коэффициента для тимуса при 4-кратном введении 300 мг/кг препарата. Введение препарата до иммунизации не оказало влияния на эти показатели. Количество ядросодержащих клеток в селезенке существенно не меняется ни при одном режиме введения (табл.4). Это позволяет сделать вывод, что соединение не проявляет лимфотоксичное действие, а изменяет другие показатели, например кровенаполнение органа. На гуморальный иммунный ответ излучаемый препарат оказывает супрессорное действие при введении в индуктивную фазу (табл.4). В то же время препарат не изменяет числа АОК в селезенке при курсовом введении как до, так и после введения антигена, что связано с влиянием на T-, а не на B-лимфоциты, так как при введении в течение 4 дней после иммунизации (индуктивная и продуктивная фаза) депрессии иммунного ответа не выявлено.

С целью уточнения механизма действия препарата на первичный гуморальный иммунный ответ препарат вводили энтерально в дозе 300 мг/кг через час после антигена. В качестве гипоиммунной использовали дозу эритроцитов барана 2·10⁷ на 20,0 мыши, нормоиммунной 2·10⁸, гипериммунной 2·10⁹ (Sibirjak S.V. et al, 1991). В проведенной серии опытов достоверное угнетение иммунного ответа в контроле наблюдали лишь при использовании гипоиммунной сенсибилизирующей дозы. Гипериммунная доза вызывала только тенденцию к снижению числа АОК в селезенке. Препарат, оказывая супрессорное действие в условиях нормоиммунизации на число АОК как на 10⁶ спленоцитов, так и на всю селезенку, утрачивает эту способность при гипо- и гипериммунизации (табл.5).

Как показали исследования, четырехкратное введение препарата после сенсибилизации достоверно подавляло реакцию ГЗТ (табл.6). Минимальная доза вызывала тенденцию к супрессии ГЗТ при однократном применении. Четырехкратное введение препарата в дозе 300 мг/кг снижало способность полиморфноядерного лейкоцита к адаптации под воздействием стимулятора (Candida albicans), что проявляется в подавлении индуцированного НСТ-теста (табл.7). Однократное введение фитопрепарата не влияет на НСТ-тест, так как компенсаторная реакция не успевает развиться.

Введение препарата внутрь в дозе 300 мг/кг в течение 4 дней до определения фагоцитоза не оказало влияния как на нейтрофильный, так и на макрофагальный фагоцитоз (Candida albicans) (табл.8).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об иммуномодулирующей активности фитопрепарата.

Анаболизирующее действие фитопрепарат изучали на 18 половозрелых крысах-самцах линии Вистар, которые разделили на 3 группы по 6 в каждой. 1-я группа животных получала внутрь препарат в дозе 200 мг/кг, 2-я группа - метилурацил в той же дозе в течение 30 дней, а 3-я группа была интактной. Затем животных взвешивали и забивали декапитацией, собирали кровь, отпрепарировали m. levator ani, взвешивали на торзионных весах и из указанных мышц готовили гомогенаты. Об анаболизирующем действии препарата судили по увеличению массы тела и массы m. levator ani по изменению содержания белка в сыворотке крови и в мышце (табл.9). Белок определяли по Лоури (Колб В.Р., Камышников В.С., 1976).

Таким образом, фитопрепарат статистически достоверно увеличивает массу мышц и уровень белка в крови, а также массу тела животных.

Установлено, что предлагаемый фитопрепарат не обладает эмбриотоксичностью.

Формула изобретения

1. Фитопрепарат биогенного действия для перорального применения, содержащий растительный экстракт и наполнители, отличающийся тем, что в качестве растительного экстракта содержит конденсированный экстракт люцерны при следующем соотношении компонентов мас.%:
Конденсированный экстракт люцерны - 50,0 - 90,0
Наполнители - 9,6 - 53,0
2. Фитопрепарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве наполнителя содержит глюконат кальция, сахарозу, стеарат кальция и тальк при следующем соотношении компонентов мас.%:
Конденсированный экстракт люцерны - 50,0 - 90,0
Глюконат кальция - 4,0 - 25,0
Сахароза - 5,0 - 25,0
Стеарат кальция - 0,2 - 1,0
Тальк - 0,4 - 2,0е

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8