Способ иммунодиагностики миастении

 

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммуноневрологии, и позволяет упростить и удешевить способ при высокой точности и специфичности. Определяют в сыворотке крови больного титр противоацетилхолиновых антител. Исследуют исходную кровь больного, добавляя к 0,1-0,2 мл сыворотки в разведениях, кратных 2, 0,1 - 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных ацетилхолином, инкубируют смесь в течение 50-60 мин при Т- 37-37,5^oC, а затем 22-24 ч. при комнатной температуре. Подобным же образом исследуют кровь больного через 30 мин после подкожного введения ему раствора прозерина. При снижении исходного титра в 4 и более раз диагностируют миастению. 4 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуноневрологии.

Известен способ диагностики миастении путем введения больному раствора прозерина с последующим исследованием эффекта его воздействия, заключающийся в том, что исследуют кровь до и после введения раствора прозерина, выделяют лейкоциты, соединяют их с эритроцитами барана, нагруженными ацетилхолином с последующим подсчетом в мазке розеткообразующих лимфоцитов и при снижении их исходного числа в 2 и более раз диагностируют миастению. (Авт. св. N 1363074, кл. G 01 N 33/48, 1987, Быкова А.А., Юшкова Т.А., Гаришина М.Ф. Опубл. в N 48 от 30.12.87).

Недостатками способа являются: техническая сложность постановки, необходимость наличия микроскопа, клеточных красителей, этилового спирта и других дорогостоящих реактивов.

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение и удешевление способа диагностики миастении при высокой точности и специфичности.

Задача достигается путем определения в сыворотке крови больного титра противоацетилхолиновых антител. Исследуют исходную кровь больного, добавляя к 0,1-0,2 мл сыворотки крови в разведениях, кратных 2, 0,1-0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных ацетилхолином, инкубируют смесь в течение 50-60 мин при температуре 37-37,5^oC, а затем 22-24 ч при комнатной температуре.

Подобным же образом исследуют кровь больного через 30 мин после подкожного введения ему раствора прозерина. При снижении исходного титра в 4 и более раз диагностируют миастению.

Способ осуществляют следующим образом: из вены больного в сухую центрифужную пробирку забирают кровь в количестве 1,5 мл. Кровь центрифугируют для получения сыворотки. Затем сыворотку инактивируют в течение 30 мин при температуре +56^oC. Одноразовый планшет для постановки реакции промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия. После этого в каждую лунку вносят по 0,1-0,2 мл фосфатного буферного раствора pH = 7,2. Затем в первую лунку вносят 0,1-0,2 мл исследуемой сыворотки и методом переноса готовят разведения сыворотки, кратное 2. Затем в каждую лунку, кроме последней, вносят по 0,1-0,2 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного ацетилхолинового диагностикума. В последней лунке содержится только фосфатный буферный раствор pH = 7,2 и эритроцитарный диагностикум (контроль на разбавитель). Планшет встряхивают и инкубируют в течение 50-60 мин при температуре 37-37,5^oC в термостате, затем в течение 22-24 ч при комнатной температуре.

Результаты оценивают визуально согласно оценке классической реакции непрямой гемагглютинации. Подобным же образом исследуют кровь больного через 30 мин после подкожного введения ему раствора прозерина. Результаты оценивают визуально и при снижении исходного титра в 4 и более раз диагностируют миастению.

Для доказательства специфичности реакции используют торможение гемагглютинации ацетилхолина. С этой целью к 1 мл сыворотки больного добавляют 1 мг ацетилхолина и выдерживают смесь 30 мин при температуре 37-37,5^oC, после чего реакцию ставят по вышеописанной методике.

Эритроцитарный ацетилхолиновый диагностикум готовят по следующей методике: свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида pH = 7,2, центрифугируя взвесь в течение 5 мин при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5%-ную взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора натрия хлорида pH = 7,2. При глутаризации смешивают 5%-ную взвесь эритроцитов с 0,25%-ным свежеприготовленным раствором глутарового альдегида в соотношении 1:1. Выдерживают смесь при 37-37,5^oC в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от глутарового альдегида забуференным изотоническим раствором натрия хлорида pH = 7,2 и этим же раствором доводят объем до первоначального (5%-ная взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранят при 4^oC в течение 6 мес.

Для сенсибилизации эритроцитов ацетилхолином 1 мл и 5%-ной суспензии глютаровых эритроцитов дважды отмывают фосфатным буферным раствором pH = 6,4. К осадку глютаровых эритроцитов добавляют 1 мл раствора ацетилхолина (200 мг сухого вещества, растворенного в 1 мл фосфатного буферного раствора pH = 6,4). Смесь перемешивают, инкубируют при температуре 37^oC 30 мин, периодически встряхивая. Затем дважды отмывают в 5 мл фосфатного буферного раствора pH = 7,2, после чего взвесь доводят до первоначального объема этим буферным раствором. Диагностикум разводят до 1%-ной суспензии фосфатным буферным раствором pH = 7,2.

Результаты проведенных исследований приведены в табл. 1-4.

Примеры практического использования способа Пример 1. Больная К., 32 года, больна с сентября 1993 года, когда впервые отметила, что не может зажмурить глаза из-за слабости круговых мышц. К врачу не обращалась. Через 6 мес. присоединилось затруднение при глотании, пища попадала в нос. Состояние больной постепенно ухудшалось. В апреле 1995 года больная обратилась к неврологу по месту жительства, где диагностирован рассеянный энцефаломиелит. После проведенного курса гормональной терапии отметила незначительное улучшение. При дальнейшем клиническом наблюдении в ноябре 1995 года был поставлен диагноз миастения, глоточно-лицевая форма.

В неврологическом статусе: "маскообразное" лицо, симптом "ресниц" с двух сторон, парез VII и XII пар черепных нервов слева центрального характера, глоточный рефлекс не вызывается, голос с носовым оттенком; сухожильные рефлексы живые, равные; двусторонняя гипотрофия и гипотония жевательных мышц. Проведенная с диагностической целью классическая прозериновая проба дала отрицательный результат.

Заявляемым способом было проведено иммунологическое исследование исходной крови больной и крови, взятой через 30 мин подкожного введения 0,3 мл и 0,05%-ного раствора прозерина. Для чего к разведениям сыворотки больной от 1: 2 до 1:1024 в объеме 0,1 мл добавляли 0,1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных ацетилхолином, после чего смесь инкубировали при температуре 37^oC в течение 50 мин, затем при комнатной температуре в течение 24 ч. Исходный титр противоацетилхолиновых АТ составил 1:64, после введения прозерина титр снизился до 1:16.

Таким образом, с помощью заявленного способа подтвержден клинический диагноз миастении.

Пример 2. Больная Л., 56 лет, считает себя больной с января 1990 года, когда постепенно стала отмечать двоение. Через год присоединились птоз и косоглазие слева. В августе 1993 года присоединилось поперхивание жидкой пищей, появился носовой оттенок голоса. В январе-феврале 1994 года появилась общая слабость, повышенная утомляемость, стала испытывать затруднения при подъеме по лестнице. За это время неоднократно обращалась к врачам разных специальностей, но диагноз поставлен не был. В сентябре 1995 года обратилась в поликлинику ОКБ. В неврологическом статусе: расходящийся страбизм слева, птоз слева до середины зрачка, диплопия, отсутствие конвергенции, глоточный рефлекс снижен, мягкое небо фонирует слабо; сила в костях снижена до 3 баллов, сухожильные рефлексы живые, равные. Проведенная с диагностической целью классическая прозериновая проба дала отрицательный результат.

Диагностирована миастения, генерализованная форма. Заявляемым способом было проведено иммунологическое исследование исходной крови больной и крови, взятой через 30 мин после подкожного введения 0,3 мл 0,05%-ного раствора прозерина. Для чего к разведениям сыворотки больной от 1:2 до 1:1024 в объеме 0,2 мл добавляли 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных ацетилхолином, после чего смесь инкубировали при температуре 37,5^oC в течение 60 мин, затем при комнатной температуре в течение 22 ч. Исходный титр противоацетилхолиновых АТ составил 1: 1024, после введения прозерина титр снизился до 1:128.

Таким образом, с помощью заявляемого способа подтвержден клинический диагноз миастении.

Пример 3. Больная К., 66 лет, считает себя больной с 1984 года, когда впервые после стресса, на фоне повышенного артериального давления опустились веки. Обратилась к неврологу по месту жительства. Диагностирована миастения, глазная форма. В течение 10 дет принимала антихолинэстеразные препараты без эффекта. В январе 1996 года поступила в клинику нервных болезней для уточнения диагноза.

В неврологическом статусе: двусторонний птоз до верхней трети зрачка, недостаточность конвергенции с двух сторон; сухожильные рефлексы оживлены, больше слева.

Заявляемым способом проведено иммунологическое исследование крови больной: исходный титр противоацетилхолиновых АТ составил 1:8, после введения прозерина он повысился до 1:64. Иммунологический анализ не подтвердил диагноза миастении.

При дальнейшем клиническом наблюдении диагноз миастении был отвергнут и поставлен диагноз: миастеноподобный синдром, как последствие острого расстройства мозгового кровообращения в области ствола мозга.

Пример 4. Больной Б., 38 лет, предъявляет жалобы на боли в пояснице с иррадиацией по наружной поверхности правого бедра и голени, онемение наружного края правой стопы. Боли усиливаются при движении. Болен 5 лет, обострения бывают 1-2 раза в год после физических нагрузок.

При осмотре отмечался вертебральный синдром в виде ограничения объема движений в поясничном отделе позвоночника, резкой сглаженности поясничного лордоза, правостороннего сколиоза, дефанса мышц поясницы; положительный симптом Ласега и Нери справа, гипестезия по наружной поверхности правой голени. Коленные рефлексы живые, равные. Левый ахиллов рефлекс снижен, правый не вызывается.

На рентгенограмме пояснично-крестцового отдела позвоночника определяются косвенные признаки грыжи диска L4. Клинический диагноз: остеохондроз поясничного отдела позвоночника, грыжа диска L4, компрессионно-корешковый синдром справа.

При иммунологическом исследовании крови заявляемым способом титр противоацетилхолиновых АТ составил 1:8, после введения прозерина титр увеличился до 1:128. Данные иммунной прозериновой пробы для миастении не характерны.

Пример 5. Донор В. (женщина), 32 года, практически здорова.

При исследовании крови заявляемым способом фоновый титр противоацетилхолиновых АТ был равен 1:4, после введения прозерина титр увеличился до 1: 32. Иммунная реакция для миастении не характерна.

Преимущества заявляемого способа заключаются в его технической простоте, отсутствии необходимости для его выполнения сложной аппаратуры и дорогостоящих реактивов. Способ обладает высокой точностью и специфичностью.

Формула изобретения

Способ иммунодиагностики миастении путем взятия крови из вены больного до и через 30 мин после подкожного введения ему раствора прозерина, отличающийся тем, что 0,1 - 0,2 мл сыворотки крови больного в разведениях, кратных 2, соединяют с 0,1 - 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных ацетилхолином, смесь выдерживают при температуре 37 - 37,5^oС в течение 50 - 60 мин и при комнатной температуре в течение 22 - 24 ч и при снижении титра противоацетилхолиновых антител по сравнению с исходным в 4 и более раз диагностируют миастению.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2