Липопептиды, способ получения, лекарственное средство и штамм actinoplanes sp. dsm 7358 в качестве продуцента липопептидов

 

Использование: в медицине. Сущность изобретения: липопептиды формулы I: , где R₁ = 3,4-ненасыщенная или насыщенная или независимо от этого разветвленная или неразветвленная жирная кислота с длиной цепи от 12 до 15 включительно атомов углерода; способ их получения заключается в том, что культивируют Actinoplanes sp. DSM-7358 в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минерального вещества в аэробных условиях с последующим выделением посредством осаждения при pH 0,5 - 4,0 и очисткой на ионообменных смолах или хроматографии на гидрофобной матрице, причем обе хроматографии можно проводить альтернативно или последовательно в любой последовательности, лекарственное средство, обладающее антибиотической активностью против граммположительных бактерий, в особенности против бактерий, устойчивых к гликопептидам на основе активнодействующего вещества и соответствующего фармацевтического носителя, содержащее в качестве активного вещества липопептиды формулы I в эффективном количестве; штамм Actinoplanes sp. DSM-7358 в качестве продуцента липопептидов I. 4 с. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил. , 4 табл.

Для характеристики штамма Actinoplanes sp. DSM 7358 проводят сравнение близко родственных штаммов по методу ISP, разработанному Ширлингом и Готлибом (Int. J. of Sys. Bacteriol. 16, 3 (1966), стр. 313 - 340). Результаты сравнений, приведенные в таблице 1, показывают, что штамм Actinoplanes sp. DSM 7358 по своим морфологическим и физиологическим признакам отличается от других штаммов.

3a) Получение липопептида A 1437 B и D.

Ферментер на 500 л запускают в работу при следующих условиях: Питательная среда: 11 г/л сахарозы, 6 г/л мясного экстракта, 0,3 г/л экстракта дрожжей, 0,6 г/л сульфата магния, 0,1 г/л KH₂PO₄, 10 мкм FeCl₃·6H₂O, 0,6 г/л L-валина, pH 7,3 (перед стерилизацией) Продолжительность инкубации: 120 часов Температура при инкубации: 30^oC Скорость при перемешивании: 50 об/мин, Аэрационные условия: 150 л мин^-1 Путем повторного добавления этанольного раствора полиоли удается подавить процесс пенообразования. Производство штамма достигает максимума через 96 - 120 часов.

После окончания ферментации Actinoplanes sp. DSM 7358 культуральный бульон фильтруют при добавлении около 2% фильтрующего средства (например, целита®), культуральный фильтрат охлаждают до 4^oC и pH устанавливают на уровне 1,5. Через 4 часа продукт обрабатывают на центрифуге при 10000 об.(g) и образующий осадок повторно суспендируют в дистиллированной воде. Путем нейтрализации суспензии указанное вещество переходит в раствор. Последний вымораживают и лиофилизируют. Выход составляет около 1,5 г/л сырого продукта (= 750 г).

3b) Разделение сырого продукта методом йонной хроматографии (с получением B + D).

Хроматографическую колонку емкостью 3,2 л (10 см внутренний диаметр х 40 см высота) загружают DEAE-сефарозой Фаст-Флау и эквилибрируют 10 ммолями калийфосфатного буфера, pH 7,0 в 40% метанола (буфер A). Затем в колонке растворяют 25 г A 1437 B сырого продукта (полученного от аналогии с примером 3a) в 3,5 л воды, вводят в колонку и промывают 1 л воды, а затем 6 л буфера A. В прогоне и промывных водах остаются примеси сырого продукта. Затем вводят 10 - 100 ммолей фосфата калия, pH 7,0-градиента в 40% метаноле, 25 - 35 ммолями фосфата калия элюируют A 1437 D-пептид и с 40 - 55 ммолями выделяют антибиотик А 1437 B.

Соответствующие фракции очищают от метанола под вакуумом. Для очистки от солей используют проникающую дианионовую колонку HP-20, производства фирмы Мицубиси, Япония, емкостью 1 л, 9 л фракций, содержащих чистый B-пептид, подают в колонку, после чего промывают 3 л очищенной от солей воды. Элюируют смесью воды-изопропанола по градиентному методу (0 - 50% спиртовых компонентов). Путем промывания 15 - 25% изопропанола чистый A 1437 B очищают от носителя. Этот продукт из колонки специально собирают, концентрируют в вакууме и подвергают криогенной сушке. Получают 4,8 г A 1437 B 97%-ной чистоты. После соответствующего обессоливания A 1437 D-содержащих фракций получают 3,1 г антибиотика. Чистота составляет 98%.

4a) Получение липопептидов A 1437 A и C.

Процесс получения аналогичен описанному в п. 3a с той лишь разницей, что L-валин в питательной среде заменяют на 4 г/л лейцина и ферментацию проводят в 50 л биореакторе. Выход составляет 1,3 г/л сырого пептида (= 65 г).

4b) Выделение липопептидов A 1437 A и C.

10 г сырого продукта растворяют в 100 мл дистиллированной воды и обрабатывают в соответствии с представленной ниже схемой.

Схема обработки сырого продукта: 10 г сырого пептида в 100 мл дистиллированной воды.

↓ Адсорбация на Q-сефарозе в быстром потоке (фирма Фармазия) (5 х 20 см колонка)
↓
Элюирование со следующими градиентами: буфер A: NaH₂PO₄ 1 ммоль в 50% метаноле, pH 5,9; буфер B: NaH₂PO₄ 100 ммолей в 50% метаноле, pH 5,3; 20 мин.: буфер A 60 мин при 25% в буфере B, затем 30 минут при 25% в буфере B,
↓
Лиофилизация A 1437 A или C-фракций и растворение в элюенте.

↓
Удаление солей на биогеле P2 (100 - 200 меш) фирмы Биорад (колонка 7 х 20 см)
↓
1,6 г липопептида A 1437 A (80%-ный) 1,2 г липопептида A 1437 C (80%-ный)
↓
RP-хроматография на нуклеозиле ®C₁₈ (7 мкм) (колонка 20 х 250 мм, 200 мг загрузка)
Элюирование со следующими градиентами: буфер A: дистиллированная вода, 0,1% ТФА; буфер B: ацетонитрил; 10 мин: буфер B 60 мин - 90% буфер B при скорости потока 10 мл/мин.

↓
Лиофилизация A 1437 A или C-фракций
↓
150 мг A 1437 A (чистота более 95%)
5a) Получение липопептидов A 1437 E, F, G, и H.

Получение проводят, как описано в примере 3a, с той лишь разницей, что в среде получения вместо L-валина используют 1,5 г/л L-изолейцина и ферментацию проводят в 50 л биореакторе. Выход составляет 1,4 г/л сырого пептида (70 г).

5b) Разделение сырого продукта методом йонной хроматографии.

На колонке, описанной в примере 3a, и по методике, приведенной в примере 3a, проводят разделение 25 г сырого липопептида, выделенного в соответствии с примером 5 a; с 14 - 19 ммолями буфера элюируют липопептид A 1437 F (выход: 1,8 г); 18 - 25 ммолями буфера элюируют A 1437 E (выход: 1,3 г); 35 - 50 ммолями - соответственно A 1437 H (выход: 2,7 г) и 64 - 82 ммолями буфера элюируют A 1437 G (выход 1,9 г).

Соответствующие фракции соединяют и освобождают от метанола в вакууме.

5c) Очистка компонентов из примера 5b на реверсивной фазе RP-18.

Проникающую препаративную колонку для хроматографического анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) при высоком давлении емкостью 500 мл (5,1 см (внутренний диаметр) х 25 см высота) заполняют ликросорбом (Li Chrosorb) G RP-18,10 мкм и вводят солесосодержащий раствор a 1437 G с 1,9 г антибиотика. Элюируют способом линейного градиента с 5% ацетонитрила в 10 ммолях калийфосфатного буфера pH 7,0 и 36% ацетонитрила в 10 ммолях калийфосфатного буфера, pH 7,0. При использовании 24 - 26% ацетонитрила выделяют липопептид A 1437 G. После концентрирования в вакууме, удаления солей на 100 мл поглощающей смолы® дианион HP - 20 в смеси вода / 50% изопропанол после проведения криогенной сушки получают 1,1 г липопептида A 1437 G с чистотой 99%.

Соответствующую дополнительную очистку A 1437 H-раствора, полученного в соответствии с примером 5b, проводят с помощью градиента растворителя 10 - 50% ацетонитрила в 10 ммолях калийфосфатного буфера, pH 7,0. Элюирование антибиотика осуществляют с 37 - 39% частями растворителя. После концентрирования соответствующих фракций и обессоливания на ®дианионе HP - 20, а также последующей криогенной сушки получают 2,2 г липопептида A 1437 H чистотой более 98%.

5d) Очистка липопептидных антибиотиков A 1437 E и F из примера 5b на MCl-геле.

Полученный в соответствии с примером 5b солесодержащий A 1437 F-раствор с 1,8 г антибиотика подают в 1 л MCl-геля CHP 20P (производства Мицубиси Кэзей Корпорейшн). Колонка имеет следующие размеры: внутренний диаметр 6 см, высота 35 см. Поле загрузки носителя с подлежащим разделению продуктом промывают буфером A (5 ммолей калийфосфатного буфера pH 7,0 с 20% ацетонитрила) и элюируют по градиентному методу против буфера B (5 ммолей калийфосфатного буфера, pH 7,0 с 70% ацетонитрила). 34 - 35%-частей растворителя ведет к элюированию чистого антибиотика. После концентрирования в вакууме и обессоливания на ®дианионе PH-20 получают 1,4 г липопептида с чистотой более 98%. Аналогичная обработка сырого продукта A 1437 E из примера 5a дает 1 г липопептида A 1437 с чистотой более 98%.

6a) Получение липопептида A 1437 K.

Получение проводят, как описано в примере 4a, с той лишь разницей, что в среде получения вместо L-валина в питательном растворе используют 500 мг/л L- α -аминомасляной кислоты (или 1 г/л рацемата) и процесс ферментации проводят в биореакторе емкостью 10 л. Выход составляет 1,1 г/л сырого пептида (= 10 г).

6b) Выделение липопептида A 1437 K.

10 г сырого продукта растворяют в 100 мл дистиллированной воды и обрабатывают по приведенной ниже схеме.

Схема обработки (А 1437 К): 10 г сырого пептида в 100 мл дистиллированной воды, поглощение на Q-сефарозе в быстром потоке (3,5 х 17 см колонка); элюирование со следующими градиентами: буфер A: NaH₂PO₄ 1 ммоль в 50% метаноле, pH 5,9; буфер B: NaH₂PO₄ 100 ммолей в 50% метаноле, pH 5,3; 20 мин; буфер A - - -> 45 мин на 25% буфере, последующие 45 мин - при 25%-ном буфере B; лиофилизация A 1437 K-фракций.

Обессоливание на биогеле P2 (100 - 200 меш) (7 х 20 см колонка),
700 мг A 1437 K (60%-ный),
RP-хроматография (обращенно-фазовая хроматография) на нуклезиле
C₁₈ 7 мкм (20 х 250 мм колонка).

Загрузка: 50 мг предварительно очищенного продукта
Элюирование со следующим градиентом
буфер A: дважды дистиллированная вода, 0,1% ТФА,
буфер B: ацетонитрил
10 мин: буфер A /5% буфер B - -> через 60 мин - 70% буфер B при 10 мл/мин скорости потока
лиофилизация A 1437 K-фракций
5,6 мг A 1437 (>95%)
7a) Получение липопептидов A 1437 L и M.

Получение проводят по аналогии с примером 4a, но вместо L-валина в получаемую смесь вводят 500 мл/г L-норвалина (или 1 г/л рацемата) и ферментацию проводят в биореакторе емкостью 10 л. Выход составляет 1,2 г/л сырого пептида (= 12 г).

7b) Выделение липопептидов A 1437 L и M.

10 г сырого продукта растворяют в 100 мл дистиллированной воды и обрабатывают в соответствии с приведенной ниже схемой:
Схема обработки: 10 г сырого пептида в 100 мл дистиллированной воды; поглощение на Q-сефарозе в быстром потоке, (3,5 х 17 см колонка).

Элюирование со следующим градиентом:
Буфер A: NaH₂PO₄ 1 ммоль в 50% метаноле, pH 5,9,
Буфер B: NaH₂PO₄ 100 ммолей в 50% метаноле, pH 5,3,
20 мин: буфер A - - -> 45 мин 25% буфер B, последующие 45 мин - в 25% буфере B,
лиофилизация A 1437 L и M-фракций,
очищение от солей на биогеле P2 (100 - 200 меш) (7 х 20 см колонка)
900 мг A 1437 L и M (около 60%)
RP-(-обращенно-фазовая) хроматография на нуклезиле C₁₈ 7 мкм (20 х 250 мм колонка)
Загрузка: 50 мг предварительно очищенного продукта
элюирование со следующим градиентом: буфер A: дважды дистиллированная вода, 0,1% ТФА
буфер B: ацетонитрил
10 мин: буфер A/5% буфера B - - - через 60 мин на 70% буфере B при скорости потока 10 мл/мин,
лиофилизация A 1437 L и M-фракций 5,8 мг A 1437 (>95%-ный) 6,7 A 1437 M(>95%-ный)
8) HPLC-система (использование метода высокоэффективной жидкостной хроматографии при высоком давлении) для определения A 1437 липопептидов.

Приведенная ниже система дает возможность разделять и количественно дифференцировать липопептиды в смеси сырья или в культуральном фильтрате.

Время удерживания составляет от 11,5 минут (A 1437 E) до около 15,9 минут (A 1437 H).

Растворитель: A калий-фосфатный буфер, pH 7,0 10 ммолей, B ацетонитрил (см. табл. 2)
Колонка: Шандон ODS, гиперсил RP-18 (обращенно-фазовая хроматография) (120 х 4,6 мм с 20 х 4,6 мм предварительной колонкой) или
Нуклеозил 120 RP-18 обращенно-фазовая хроматография (120 х 4,6 мм с 20 х 4,6 предварительной колонкой),
Скорость потока: 1,5 мл/мин
Обнаружение: 210 нм,
Введение: 10 мкм
7) Сравнение между Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 и Actinoplanes spec. DSM 7358.

По описанному в примере 1b методу от обоих штаммов отбирают предварительную культуру, которую в дальнейшем используют для прививания производящей среды следующего состава:
Среда 1: как описано в примере 3a
Среда 2: как среда 1, но, однако, без L-валина
Среда 3: глюкоза 30 г/л, соевая мука 20 г/л, Fe₂(SO₄)₃ 0,3 г/л, MnCl₂·4H₂O 0,3 г/л и CoCl₂·6H₂O pH 7,3 соответственно по 100 мл среды в колбе Эрленмейера на 300 мл.

Инкубацию проводят при 30^oC во вращающейся встряхивающей машине. Через 48, 96 и 144 часа определяют концентрацию A 1437 липопептидов в фильтрате культуры методом HPLC высокоэффективной жидкостной хроматографии при высоком давлении (см. пример 6). В средах 2 и 3 при штамме Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 липопептидов не обнаруживают. В среде 1 через 144 часа удается определить очень незначительные количества некоторых липопептидов. Если в качестве основы использовать специфическую идентичную экстинкцию этих соединений в сравнении с A 1437 пептидами, то образующееся количество составит по меньшей мере в 100 раз (более 1 мг/л) низкую концентрацию A 1437 B, которую удалось получить при синтезе из штамма Actinoplanes spec. DSM 7358 в среде 1 за тот же период времени.

8) Активность A 1437 липопептидов.

Чувствительность относящихся микроорганизмов к A 1437 липопептидам определяют с помощью Агар - разбавление - теста. В качестве агара используют агар Бюллера-Хинтона с добавлением к нему в случае с S.pyogenes и Enterococcen 10% крови лошади. Содержащие антибиотик пластины прививают с помощью многоканального шприцевого устройства (5·10⁴ единиц/место стационарной культурой соответствующего штамма). Минимальную ингибирующую концентрацию МНК определяют при 37^oC. Минимальная ингибирующая концентрация представляет собой концентрацию антибиотика, при которой после 24-часовой инкубации не отмечается видимого роста микроорганизмов.

Результаты приведены в таблице 3. Используемый в качестве контрольного вещества амфомицин получают с фирмы Берингер Маннгейм (Германия).

Амфомицин производят на фирме в виде тонкого химиката
Соединения K, L M обладают активностью in vitro, сравнимой с активностью соединений A - H.

9a) Характеристика A 1437 D.

Липопептид A 1437 D выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Данные оптического вращения: +35^o (с = 0,1 метанол).

HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком давлении:
время удерживания: 15,1 минут.

Аминокислоты: 2 аспарагиновые кислоты, 1 аспарагин, 1 β -метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляные кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин
FAB-MS: m/e = 1303, 6952 /(M+H)⁺/
Молярная масса: 1302, 6884 (C₅₉H₉₄N₁₄O₁₉)
CID-MS: m/z = 356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982
ИК/KBr/:v = 3420 (шир.), см^-1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

9b) Характеристика A 1437 B
Липопептид A 1437 B выделяют в виде твердого аморфного продукта.

Значение оптического вращения: +27^o (с = 0,1, метанол)
HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком давлении:
время удерживания: 12,8 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицин, 2 2,3-диаминомасляные кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

FAB-MS: m/e = /(M+H)⁺/
Молярная масса: 1303 (C₅₉H₉₃N₁₃O₂₀)
CID-MS: m/z = 356, 407, 518, 521, 741, 762, 938, 982
ИК (KBr): δ = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

9c) Характеристика A 1437 C
Липопептид A 1437 C выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Значение оптического вращения: +30^o /с = 0,1, метанол/
HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком давлении:
время удерживания: 14,1 минут.

Аминокислоты: 2 аспарагиновые кислоты, 1 аспарагин, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

Молярная масса 1288 (С₅₈H₉₂N₁₄O₁₉).

CID-MS: m/z = 356, 392, 503, 503, 741, 747, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

9d) Характеристика A 1437 A.

Липопептид A 1437 A выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Оптическое вращение: +30^o /с = 0,1, метанол/
HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком давлении:
время удерживания: 11,8 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

молярная масса: 1289 (C₅₈H₉₁N₁₃O₂₀)
CID-MS: m/z = 356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

9e) Характеристика A 1437 F.

Липопептид A 1437 F выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Значение оптического вращения: +31^o /с = 0,1, метанол/,
HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком давлении:
время удерживания: 13,8 минут.

Аминокислоты: 2 аспарагиновые кислоты, 1 аспарагин, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

молярная масса: 1288 (C₅₈H₉₂N₁₄O₁₉)
CID-MS: m/z = 356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

9f) Характеристика A 1437 E.

Липопептид A 1437 E выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Высокоэффективная жидкостная хроматография:
время удерживания: 11,5 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

молярная масса: 1289 (C₅₈H₉₁N₁₃O₂₀)
CID-MS: m/z = 356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

9g) Характеристика A 1437 H.

Липопептид A 1437 H выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Значение оптического вращения: +32^o /с = 0,1, метанол/
HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография:
время удерживания: 15,9 минут.

Аминокислоты: 2 аспарагиновые кислоты, 1 аспарагин, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

молярная масса: 1316 (C₆₀H₉₆N₁₄O₁₉)
CID-MS: m/z = 356, 420, 531, 534, 741, 775, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

9h) Характеристика A 1437 G.

Липопептид A 1437 G выделяют в виде твердого аморфного вещества.

Значение оптического вращения: +34^o /с = 0,1, метанол/
HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография
время удерживания: 13,6 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколиновая кислота, 1 валин.

молярная масса: 1317 (C₆₀H₉₅N₁₃O₂₀)
CID-MS: m/z = 356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

9i) Характеристика A 1437 K.

Липопептид A 1437 K выделяют в виде твердого аморфного вещества.

HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография:
время удерживания: 12,5 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколин, 1 валин.

FAB-MS: m/z = /(M + H)⁺/
молярная масса: 1299 (C₅₈H₉₁N₁₃O₂₀).

CID-MS: m/z = 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981
IK (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

9j) Характеристика A 1437 L.

Липопептид A 1437 L выделяют в виде твердого аморфного вещества.

HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография:
время удерживания: 13,0 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколин, 1 валин.

FAB = = MS: m/e = /(M + H)⁺/
молярная масса: 1289 (C₅₉H₉₃N₁₃O₂₀).

CID-MS: m/z = 407, 518, 741, 761, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

9k) Характеристика A 1437 M.

Липопептид A 1437 M выделяют в виде твердого аморфного вещества.

HPLC: Высокоэффективная жидкостная хроматография:
время удерживания: 9,8 минут.

Аминокислоты: 3 аспарагиновые кислоты, 1 β - метиласпартат, 2 глицина, 2 2,3-диаминомасляных кислоты, 1 пролин, 1 пипеколин, 1 валин.

FAB-MS: m/e = /(M + H)⁺/
молярная масса: 1275 (C₅₇H₈₉N₁₃O₂₀).

CID-MS: m/z = 379, 490, 493, 724, 741, 938, 981
ИК (KBr): v = 3420 (шир.), см^-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

10) C13-химические сдвиги.

В таблице 4 представлены C-13-химические сдвиги CH-сигналов A 1437 B.

Для сравнения с ¹H-данными, NH-химические соединения NH-сигналов соответственно для Pip и Pro даются с указанием CaP-сдвигов соответствующих спиновых систем.

Формула изобретения

1. Липопептиды общей формулы I

где R¹ - 3,4-ненасыщенная, или насыщенная, или независимо от этого разветвленная или неразветвленная жирная кислота с длиной цепи 12 - 15 атомов углерода.

2. Липопептид по п.1, отличающийся тем, что R¹ имеет длину цепи 12 - 15 атомов углерода.

3. Липопептид по п.1, отличающийся тем, что R¹ имеет длину цепи с 12, 13, 14 или 15 атомами углерода.

4. Липопептид по п. 1, отличающийся тем, что R¹ означает : a) iC₁₃ - жирную кислоту, b) iC₁₄ - жирную кислоту, c) aiC₁₃ - жирную кислоту или d) aiC₁₅ - жирную кислоту.

5. Липопептид по п.5, отличающийся тем, что R¹ означает

6. Липопептид по п.4, отличающийся тем, что R¹ означает

7. Липопептид по п.4, отличающийся тем, что R¹ означает

8. Липопептид по п.4, отличающийся тем, что R¹ означает

9. Способ получения липопептидов по пп.1 - 8, заключающийся в том, что культивируют Actinoplanes sp. DSM 7358 в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные вещества в аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта и его очисткой.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что выделение осуществляют осаждением при pH 0,5 - 4,0.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что очистку осуществляют хроматографией на ионообменных смолах или хроматографией на гидрофобной матрице, при этом обе хроматографии можно проводить альтернативно или последовательно в любой последовательности.

12. Лекарственное средство, обладающее антибиотической активностью против грамм-положительных бактерий, в особенности против бактерий, устойчивых к гликопептидам на основе активнодействующего вещества и соответствующего фармацевтического носителя, отличающееся тем, что в качестве активнодействующего вещества она содержит липопептиды по пп.1 - 8 в эффективном количестве.

13. Штамм Actinoplanes sp. DSM 7358 в качестве продуцента липопептидов по пп.1 - 8.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8