Фармацевтические композиции, содержащие антрациклиновые гликозиды, связанные с полимерным производным

 

Лиофилизованная композиция, состоящая из конъюгата, состоящего из сополимера на основе N - алкилметакриламида и антрациклинового гликозида, соединенного с сополимером через пептидный спейсер, и сосолюбилизирующего агента и необязательно содержащая наполнитель. Также целевой фрагмент может быть связан с сополимером конъюгата через пептидный спейсер. Раствор для инъекции конъюгата получают при восстановлении лиофилизованной композиции. Композиция применима для улучшения состояния пациента, имеющего опухоль. 2 с. и 10 з.п.ф-лы, 16 табл.

Изобретение относится к стабильным лиофилизованным композициям, содержащим связанные с полимером антрациклиновые гликозиды.

Антрациклиновые антибиотики являются одними из наиболее эффективных и широко используемых противоопухолевых агентов. Наиболее известными членами этого класса соединений являются доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин и идарубицин, которые используют в клинике для лечения различных опухолей. Несколько новых производных было синтезировано с целью получения аналогов с повышенной активностью и/или пониженной токсичностью и некоторые из них уже прошли клинические испытания.

Антрациклиновые антибиотики обладают хорошей активностью против человеческих новообразований, включая некоторые твердые опухоли. Токсические побочные эффекты, включая кардиомиопатию, возникновение которых относят к суммарной дозе лекарства, ассоциируются с приемом этих лекарств.

При введении в свободной форме антрациклины обнаруживаются в организме повсеместно с незначительной предпочтительной аккумуляцией активного лекарства в ткани опухоли.

Были сделаны многочисленные попытки повысить терапевтический индекс и специфичность антрациклинов или путем модификации способа их подачи, или путем использования различных систем подачи лекарства, таких как липосомы, микросферы, антитела и т.п.

В качестве потенциальных носителей лекарства были предложены синтетические полимеры на основе N-алкилметакриламида, где алкильная группа может содержать одну или более гидроксильных групп: см. патенты США 4062831, 4097470 и EP-187547. Такие полимеры растворимы в водной среде и обладают хорошей биосовместимостью.

Сополимеризация N-алкилметакриламида, у которого алкильная группа содержит одну или более гидроксильных групп, с п-нитрофениловыми эфирами N-метакрилолилолигопептидами дает полимер, содержащий олигопептидные боковые цепи, заканчивающиеся реактивными п-нитрофенильными сложноэфирными группами, которые позволяют связывать многие лекарства, содержащие первичную аминогруппу, такие как антрациклиновые гликозиды и необязательно целевые фрагменты, содержащие первичные аминогруппы.

Образованные таким образом конъюгаты полимерантрациклиновый гликозид, следовательно, состоят из инертного полимерного носителя, которым является сополимер на основе N-алилметакриламида, объединенный через пептидные спейсеры с антрациклиновым гликозидом и необязательно целевым фрагментом. Предпочтительно инертным полимерным носителем является N-(2-оксипропил)метакриламид (HPМA).

Олигопептидные спейсеры отщепляются только после интернализации в клетках липосольными тиолзависимыми протеиназами (см., например, Дункан Р. с сотр. в Makromol. Chem., 184, 1997 - 2005, 1983).

Целевые фрагменты, необязательно имеющиеся внутри полимерной структуры, могут взаимодействовать со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Например, галактоза взаимодействует с рецепторами, локализованными на плазменной мембране печени/клеток. Таким образом, лекарство специфически подается в ткань опухоли, такой как гепатома.

Было показано, что указанные конъюгаты полимерантрациклиновый гликозид обладают противоопухолевой активностью in vivo и пониженной токсичностью: например, примерно в 10 раз больше доксорубицина может быть введено в виде конъюгата без заметных признаков токсичности (см., например, Дункан Р. с сотр. в Br. J. Cancer 57, 147 - 156, 1987; Дункан Р. с сотр. в J. Controlled Release 10, 51 - 64, 1989; Кассиди Дж. с сотр. в Biochem. Pharmacol. 38, 875 - 880, 1989).

Также был описан синтез вышеупомянутых конъюгатов (см. например, Ринова Б. с сотр. в Biomatirials 10, 335 - 342, 1989).

Конкретными конъюгатами между НРМА сополимером и антрациклиновыми гликозидами являются: (i) конъюгат, состоящий из x мол.% звеньев формулы (A), y мол.% звеньев формулы (B) и z мол.%, звеньев формулы (C) (cм. в конце описания); и (ii) конъюгата, состоящего из x мол.% звеньев формулы (A) выше, y мол. % звеньев формулы (B) выше, z мол.% звеньев формулы (D) и w мол.% звеньев формулы (C) выше (cм. в конце описания).

Для простоты показаны только конъюгаты доксорубицина. Конъюгат (i) обозначен "PK1", у него x варьирует от 85 до 98 мол.%, y варьирует от 1 до 10 мол. % и z варьирует от 0 до 14 мол.%. Конъюгат (ii) обозначен "PK2", в нем x варьирует от 80 до 97 мол.%, y варьирует от 1 до 10 мол.%, z варьирует от 0 до 18 мол.% и w варьирует от 1 до 10 мол.%. В каждом конъюгате антрациклиновый антибиотик связан с НРМА сополимером тетрапептидной последовательностью, присоединенной к амину сахара антрациклина пептидной связью. Такая связка является устойчивой y к кислотному гидролизу, но гликозидная связь между амином сахарного кольца и агликоновым фрагментом гидролизуется относительно легко, выделяя свободный агликон.

Конъюгаты (i) и (ii) могут быть показаны в виде формул d и b (см. в конце описания).

Как показано Сеймуром Л.У. с сотр. в Biochemical Pharmacology 39, 1125 - 1131, 1990, после внутривенного введения мышам фармакокинетика доксорубицина значительно изменяется при его конъюгировании с НРМА сополимером: наблюдаемые высокие начальные уровни свободного доксорубицина в плазме после введения свободного лекарства отсутствуют в случае конъюгатов доксорубицина с полимером и последующие высокие уровни свободного доксорубицина, наблюдаемые в других тканях, также снимаются. Напротив, время полувыведения циркуляцией полимерных конъюгатов доксорубицина примерно в 15 раз больше, чем для свободного лекарства. Первоначальный пиковый уровень свободного доксорубицина в сердце снижен в 100 раз после введения конъюгированного лекарства.

Поскольку известно, что высокие уровни антрациклинов в сердечной ткани коррелируют с повреждением ткани и кумулятивностью, замедленное кардиотоксическое действие, снижение сердечных уровней, наблюдаемое после введения конъюгата сополимера НРМА доксорубицина являются очень важным результатом и могут рассматриваться как снижение токсичности и повышение эффективности, сообщенные в литературе для полимерконъюгированных лекарств: например, недавние исследования с использованием крыс показали заметное снижение токсичности конъюгата доксорубицина с НРМА сополимером без признаков какого-либо снижения пропускной способности сердца до 20 недель после введения лекарства. В этом исследовании доксорубицин был введен в дозе 4 мг/кг, которая является летальной при введении крысам неконъюгированной формы лекарства (более детально см. Юнг Т.К. с сотр. в "Proceeding of the British Assotiation for Cancer Research Meeting", Глазго, Соединенное Королевство, 10 апреля 1989 г.).

Значительное снижение содержания доксорубицина в сердце при использовании стабильного ковалентно полимерконъюгированного лекарства должно быть отнесено к тому факту, что эти конъюгаты являются стабильными в кровотоке и расщепляются внутриклеточно.

Подобные конъюгаты НРМА сополимердауномицин, использованные для лечения саркомы Уолкера у крыс Вистар, смогли показать как улучшение терапевтического ответа по сравнению со свободным дауномицином, так и значительное увеличение свободного дауномицина, определяемого в опухоли после введения полимерконъюгированного лекарства (см. Кассиди Дж. c сотр. в Biochem. Pharmacol. 38, 875-880, 1989). Предполагают, что такая пассивная метка опухоли конъюгатом НРМА сополимердауномицин может быть отнесена за счет пролонгированной циркуляции лекарства в кровотоке: действительно, некоторые опухоли, включая саркому Уолкера, как известно, обладают высокими скоростями пиноцитоза in vivo и предполагается, что увеличение времени циркуляции антинеопластических лекарств может увеличить их относительные концентрации в клетках опухолей (см., например, Труе А. c сотр. в Nature New Biol., 239, 110-112, 1972 и Буш Х. с сотр. в Cancer Res. 21, 371-377, 1981).

Теперь мы изучили рецептуру конъюгатов антрациклин-НРМА сополимер. Мы обнаружили, что хотя водное равновесие растворимости конъюгатов сополимера с антрациклиновым гликозидом является достаточно высоким (> 5 мас.%/объем), эти полимеры обладают заметной гидрофобностью, так что скорости их растворения в воде достаточно малы. Итак, мы обнаружили, что при одной лиофилизации конъюгаты антракциклин-НРМА сополимер образуют при сушке вымораживанием осадок, который очень медленно растворяется. Полное растворение требует очень большого времени, а именно, даже больше 30 мин при непрерывном встряхивании. Это является недостатком из-за значительной токсичности семейства антрациклиновых гликозидов.

Кроме того, мы обнаружили, что после реконструкции со стерильной водой или со стерильным физиологическим солевым раствором или с любым другим водным физиологическим разбавителем некоторые нерастворимые фрагменты полимера увлекаются наверх пеной и/или задерживаются на каучуковой пробке и стенках флакона. Эта проблема является особенно серьезной из-за опасности внутривенного введения некоторых нерастворимых частиц. Однако мы обнаружили, что наличие конкретного сосолюбилизирующего агента в высушенном вымораживанием препарате, содержащем конъюгат полимерантрациклиновый гликозид, повышает растворимость лекарства в большой степени, так что при восстановлении можно достигнуть полного растворения конъюгата менее чем за одну минуту без каких-либо трудностей.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает лиофилизованную композицию, состоящую из (а) конъюгата, состоящего из сополимера на основе N-алкилметакриламида и антрациклинового гликозида, связанного через пептидный спейсер с сополимером, и (б) сосолюбилизирующего агента. Необязательно целевой фрагмент связан через пептидный спейсер с полимером. Также необязательно композиция дополнительно содержит (в) наполнитель.

Следовательно, можно обеспечить лиофилизованную фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат полимерантрациклиновый гликозид и имеющую пониженное время растворения при восстановлении с водным фармацевтически приемлемым разбавителем, чтобы таким образом получить практическое и безопасное применение конъюгатов полимерантрациклин в терапии. В настоящем описании термины "фармацевтический", "фармацевтически" и подобные означают ссылку на применение как для лечения людей, так и для ветеринарии. Термин "леофилизованный" и "высушенный замораживанием" используют без различия.

Сополимер, к которому присоединен антрациклиновый гликозид, состоит по существу из звеньев, происходящих из N-алкилметакриламида. Предпочтительно алкильной группой является C₁ - C₆-алкил. Алкил может содержать одну или более гидроксильных групп. Следовательно, подходящая алкильная группа может быть C₁ - C₄-алкилом, замещенным гидроксилом. Предпочтительной алкильной группой является 2-оксипропил. Предпочтительным сополимером является сополимер N-( оксипропил)-метакриламид (НРМА).

Сополимер также состоит из других звеньев, происходящих из метакрилоильного мономера. Антрациклиновый гликозид соединен с этими звеньями через пептидный спейсер. Следовательно, звенья можно рассматривать как происходящие из N-метакрилоилированного пептида. Звенья могут быть представлены формулой I в которой P означает пептидный спейсер и A означает антрациклиновый к гликозид.

Сополимер может также содержать еще другие звенья, которые происходят из метакрилоильного мономера и к которому целевой фрагмент присоединен через пептидный спейсер. Эти звенья, следовательно, могут рассматриваться как происходящие из N-метакрилоилированного пептида, целевой фрагмент присоединен к пептиду. Звенья могут быть представлены формулой II в которой P означает пептидный спейсер и T означает целевой фрагмент.

Сополимер обычно содержит звенья, происходящие из N-алкилметакриламида в количестве 60 мол. % или более, например, по крайней мере 80 мол.% или по крайней мере 85 мол.%. Эти звенья могут находиться в количестве до 97 или 98 мол. %. Звенья формулы III могут находиться в количестве от 1 до 20 мол.%, например, 1-10 мол.%. Звенья формулы могут находиться в количестве от 0 до 20 мол.%, например, 0-18 мол.% или 0-14 мол.%.

Предпочтительным сополимером является сополимер 1-(метакрилоил)амино-2-оксипропана и N-метакрилоилпептидилантрациклина и необязательно 1-(метакрилоилпептидил)амино-2-оксипропана и N-метакрилоилпептидилцелевого фрагмента. Более конкретно м сополимер может быть сополимером из x мол.%. [1-(метакрилоил)амино] -2-оксипропановых звеньев, y мол.% {-N-[метакрилоил-(P)] (A)} звеньев; необязательно z мол.% {1-[метакрилоил-(P)]амино-2-оксипропановых} звеньев; и w мол.%. {-N-[метакрилоил-(P)](T) звеньев, где P является пептидным спейсером, A является антрациклиновым гликозидом, T является целевым фрагментом и x, y, z и w означают молярные проценты компонентов. Эти проценты могут варьировать в широких пределах, таких как от 80 до 98% для x; от 1 до 10% для y; от 0 до 18% для z и от 1 до 18% для w.

Антрациклиновый гликозид, ковалентно связанный с полимерами с помощью пептидных спейсеров, может быть любым антрациклиновым гликозидом, например, одним из тех, что описаны в GB-A-1161278, GB-A-1217133, GB-A-1457632, GB-A-1467383, GB-A-1500421 и GB-A-1511559. В частности, антрациклиновый гликозид представляет собой, например, доксорубицин, 4'-эпидоксорубицин (а именно, эпирубицин), даунорубицин и 4'-диметокси-даунорубицин (а именно, идарубицин).

Пептидный спейсер может содержать от 1 до 10, например 2 - 4 аминокислотных остатка, в длину. Спейсер должен быть чувствительным к внутриклеточному лизосомальному гидролизу. Спейсер может быть устойчивым к внеклеточному гидролизу. Подходящие спейсеры описаны в EP-A-187547. В частности, спейсер может быть Gly-Leu-Gly, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly или Gly-Phe-Phe-Gly. Предпочтительным спейсером является Gly-Phe-Leu-Gly. Обычно только один тип пептидного спейсера несет сополимер на основе N-алкилметакриамида, так что антрациклиновый гликозид и, если имеется, целевой фрагмент, связаны с сополимером одним и тем же типом спейсера.

Целевой фрагмент обычно является сахаридом, особенно моносахаридом или дисахаридом. Предпочтительно целевой фрагмент является галактозой, галактозамином, глюкозамином, маннозамином, фукозиламином или лактозамином. Альтернативно целевой фрагмент может быть моноклональным антителом, например, моноклональным антителом, специфическим к человеческим новообразованиям, таким как новообразование груди, толстой кишки, легкого, простаты, яичников или тимуса.

Полимерантрациклиновые конъюгаты, применяемые в композициях настоящего изобретения, могут быть например, теми, что описаны в US-A-4097470 и US-A-187547 или подобными конъюгатами. Они могут быть получены по известным методикам, например, по методикам, подобным тем, что приведены в этих документах.

Сосолюбилизирующий агент, использованный для улучшения растворимости лиофилизованного препарата изобретения, обычно представляет собой поверхностно- активный агент, выбранный, например, среди сложных эфиров полиэтиленсорбитан жирных кислот (обычно известными как полисорбаты), полиэтилен-полипропиленгликолевых полимеров (обычно известных как полоксамеры), полиэтиленгликолевых эфиров жирных кислот, и фосфатидов. Поверхностно-активное вещество должно быть нетоксичным и приемлемым для внутривенного введения.

Полезные полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот включают частичные сложные сорбитовые эфиры C₁₂-С₂₀ насыщенных или ненасыщенных кислот и его моно- и диангидридов, сополимеризованные с этиленоксидом. Обычно от 10 до 40, например, примерно 20 моль этиленоксида на каждый моль сорбита и его ангидридов имеется.

Предпочтительно полисорбат является полисорбатом 20/полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат, Chemical Abstract ref. N 9005-64-5, который является смесью частичных сложных эфиров лауриловой кислоты и сорбита и его моно- и ди-ангидридов, сополимеризованной с приблизительно 20 моль этиленоксида на каждый моль сорбита и его ангидридов (или полисорбат 80) полиоксиэтилен 20 сорбатан моноолеат, Chemical Abstract ref. N 9005-65-6. Другие подходящие полисорбаты являются полисорбатом 40 (полиоксиэтилен 20 сорбитан монопальмитат, CAS N 9005-66-7) полисорбатом 60 (полиоксиэтилен 20 сорбитан моностеарат CAS N 9005-67-8), полисорбатом 65 (полиоксиэтилен 20 сорбитан тристеарат CAS N 9005-71-3) и полисорбатом 85 (полиоксиэтилен 20 сорбитан триолеат CAS N 9005-70-3).

Полоксамеры включают неионные поверхностно- активные вещества со структурой HO(CH₂-CH₂-O)_a - [CH(CH₃)CH₂O]_b - (CH₂-CH₂-O)_aH, где b является целым числом от 15 до 67 и a является целым числом от 20 до 98. Предпочтительно полоксамер является полоксамером 188. Полоксамер 188 является одним из серии блок-сополимеров поли[оксиэтилен(поли)оксипропилен]_a, которые могут быть использованы в качестве сосолюбилизирующих агентов. В приведенной выше формуле a равно 75 и b равно 30 для полоксамера 188, который, следовательно, имеет молекулярную массу 8350.

Полиоксиэтиленгликолевые сложные эфиры жирных кислот являются предпочтительно полиоксиэтиленстеаратами. Фосфатид предпочтительно является лецитином, например, яичным или соевым лецитином.

Все поверхностно-активные вещества, требующиеся для солиофилизации лекарства, изменяют его активность как усилители растворения. Если они действуют, просто снижая поверхностное натяжение раствора, содержащего лекарство, или за счет эффекта смачивания, лекарство сохранит свою активность, если они солиофилизируются с лекарством или добавляются для восстановления раствора. Солиофилизация требуется, это объясняется некоторым неожиданным взаимодействием с лекарством, которое имеет место в твердом состоянии.

Относительные пропорции конъюгата и сосолюбилизирующего агента в препаратах изобретения обычно являются такими, что на 10 мас. ч. конъюгата имеется около 0,01 - 1,0, предпочтительно от 0,035 до 0,35 мас.ч. сосолюбилизирующего агента. Особенно предпочтительное массовое соотношение между сосолюбилизирующим агентом и конъюгатом находится между 0,1 - 0,2 : 10,0. Это оптимальное соотношение объединяет хорошие показатели сосолюбилизирующего агента как ускорителя растворения с его фармацевтической приемлемостью с токсикологической точки зрения. Применение более высоких количеств поверхностно-активного вещества резко ограничено по токсикологическим причинам и толерантностью.

Лиофилизованные рецептуры могут содержать полимерантрациклиновый гликозидный конъюгат в различных количествах. Типичные рецептуры содержат, например, количества полимерного антрациклингликозидного конъюгата, эквивалентное 5, 10, 20, 25 или 50 мг антрациклинового гликозида.

В дополнение к сосолюбилизатору композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать вспомогательные ингредиенты, наличие которых помогает обеспечить быстрое растворение высушенного замораживанием продукта. Они включают наполнители (или разбавители или расширители) и органический растворитель.

Наполнители обычно используют в лиофилизующей технологии для облегчения процесса и/или обеспечения механической целостности лиофилизованного остатка. Однако не должны присутствовать в случае настоящего изобретения, поскольку конъюгаты полимерантрациклин могут быть легко лиофилизованы без добавок, с образованием прочного и твердого осадка. Как использовано здесь, слово "наполнитель" означает легко растворимые в воде частицы твердого разбавителя, которые при солиофилизации с полимерантрациклингликозидным конъюгатом могут помочь солюбилизации медленно растворяющегося полимера при добавлении растворителя для восстановления раствора, обеспечивая "растягивающий" эффект за счет его высокой гидрофильности.

Водорастворимый наполнитель, пригодный для использования в настоящем изобретении, может быть любым фармацевтически приемлемым инертным твердым материалом, обычно используемым для лиофилизации. Такие наполнители включают, например, сахара, такие как глюкозу, мальтозу, сахарозу и лактозу; многоатомные спирты, такие как сорбит и маннит, аминокислоты, такие как глицин, полимеры, такие как поливинилпирролидон, полисахариды, такие как декстран, некоторые неорганические соли, такие как фосфаты натрия или калия, или хлорид натрия. В предпочтительном варианте наполнителем является лактоза.

Массовое отношение конъюгата полимерантрациклиновый гликозид к наполнителю, использованному в композициях настоящего изобретения, обычно находится в интервале от примерно 0,1 : 1 примерно 20 : 1. В предпочтительном варианте отношение полимерантрациклин гликозидный конъюгат: наполнитель составляет от примерно 1,0 : 1 до примерно 2,5 : 1. Количество наполнителя связано с количеством конъюгата и является критическим для характера растворения лиофилизованного остатка.

При использовании одного наполнителя (т.е. без какого-либо сосолюбилизатора) полное восстановление раствора происходит в течение продолжительного времени, например, не менее 8 - 10 минут до более 20 - 30 минут, в зависимости от относительных количеств как наполнителя, так и полимерного конъюгата. Этот пункт детально проиллюстрирован в эксперименте 1.

Если в композиции присутствуют как наполнитель, так и сосолюбилизатор, время восстановления раствора значительно снижается и находится в интервале от примерно 30 - 90 с до примерно 4 - 5 мин, в зависимости от количеств конъюгата, наполнителя и сосолюбилизатора. Обычно, чем выше соотношение между сосолюбилизатором и конъюгатом, тем меньше время восстановления раствора.

Поэтому совершенно неожиданно было нами обнаружено, что наполнитель и сосолюбилизатор могут действовать синергетически как ускорители растворения. Кроме того, мы неожиданно обнаружили, что наличие наполнителя также помогает растворению конъюгата во время приготовления раствора, который должен быть высушен вымораживанием. Следовательно, наличие наполнителя в рецептурах настоящего изобретения, даже если нет строгого обязательства, является очень предпочтительным. Эксперименты 1 и 2 иллюстрируют эту позицию детально.

Изобретение также обеспечивает способ получения стабильной быстро растворимой лиофилизованной композиции. Согласно изобретению указанный способ заключается в a) смешивании в водном растворе полимерантрациклинового конъюгата, сосолюбилизирующего агента и необязательно наполнителя и/или органического растворителя; б) сушке с вымораживанием водного раствора.

Органические растворители обычно не используют в технологии лиофилизации. С ними не так легко иметь дело, как с водой, и их использование ограничено также тем фактом, что парентеральные высушенные вымораживанием дозированные формы не должны содержать большого количества остатков органических растворителей по соображениям токсичности. Однако обычно считается, что органические растворители могут обладать определенными полезными свойствами, такими как промотирование солюбилизации лекарства во время изготовления раствора, подлежащего сушке вымораживанием (это не является важным в случае настоящего изобретения, так как полимерантрациклингликозидные конъюгаты лучше растворимы в воде, чем в спирте, изопропаноле и т.п.); снижение степени разложения активного материала в воде во время переработки и индукция кристаллизации лекарства в замороженном состоянии.

Неожиданно было обнаружено, что наличие органического растворителя в подлежащем сушке вымораживанием растворе дополнительно повышает скорость растворения лиофилизованного продукта. Небольшая концентрация органического растворителя является эффективной, обычно менее 5% объем/объем и предпочтительно менее 1% объем/объем по отношению к высушиваемому вымораживанием раствору. Следовательно, может быть применено 0,5% объем/объем или более органического растворителя. Эксперимент 2 иллюстрирует этот признак.

Органические растворители, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают этанол, изопропанол, трет.-бутанол и любой другой фармацевтически приемлемый растворитель, который легко удаляется в процессе сушки вымораживанием, так что готовый лиофилизованный продукт содержит только остатки (если они есть) такого растворителя, обеспечивая таким образом возможность парентерального введения без опасности токсичности и/или переносимости. Растворитель обычно является смешивающимся с водой органическим растворителем. Предпочтительные органические растворители для этой цели являются органическими алифатическими спиртами, в частности C₁ - C₄-алканолом, таким как этанол.

Настоящее изобретение также обеспечивает набор, содержащий лиофилизованную композицию согласно изобретению в стерильной ампуле и стерильный раствор для восстановления указанной лиофилизованной композиции.

Настоящее изобретение далее включает способ получения раствора инъекций полимерного антрациклингликозидного конъюгата, отличающийся тем, что растворяют в растворе, пригодном для инъекции, стабильный, быстро растворимый лиофилизованный препарат, состоящий из полимерантрациклинового конъюгата, сосолюбилизатора и необязательно наполнителя.

Лиофилизованные рецептуры, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены традиционным путем с последующей обычной сушкой вымораживанием, однако при этом выполняются все предосторожности, требующиеся при манипуляциях с токсическими веществами, такими как антрациклиновые гликозиды. Так, например, сосолюбилизатор, наполнитель и полимерантрациклингликозидный конъюгат последовательно растворяют при перемешивании в подходящем количестве деаэрированной воды для инъекций, возможно содержащей органический растворитель. Затем добавляют дополнительное количество воды для достижения желаемого конечного объема. Полученный в результате раствор осветляют и стерильно фильтруют, затем асептически распределяют в стерильные контейнеры (ампулы) желаемой емкости. Замораживают раствор, например, при -40^oC-50^oC в течение 4-5 ч, и сушат, например, при конечной температуре 30 - 40^oC в течение примерно 6-8 ч, после чего запаивают ампулы в соответствии с обычными процедурами.

Также обычным образом осуществляют восстановление высушенных замораживанием препаратов, например, стерильной водой, физиологическим солевым раствором или фармацевтически приемлемым изотоническим раствором. Так, например, физиологический солевой раствор (0,9% хлорида натрия в воде) используют в объеме, который может меняться в зависимости от типа и количества активного полимера, содержащегося в лиофилизованном остатке; объемы примерно 5 мл до 25 мл физиологического солевого раствора могут быть, например, использованы для восстановления в растворе количеств полимера, эквивалентных 5 - 50 мг соответственно антрациклинового гликозида. Восстановленные растворы для инъекций изобретения вводят или путем быстрой внутривенной инъекции или (предпочтительно) путем внутривенной инфузии в соответствии с различными возможными перечнями доз.

Восстановленные композиции изобретения являются полезными для лечения опухолей как у людей, так и у животных. Они могут быть применены для улучшения состояния пациента, имеющего опухоль. Примеры опухолей, которые могут быть пролечены, представляют, например, саркомы, включая саркомы мягких тканей и остеогенные саркомы, карциному, например, карциному груди, легкого, мочевого пузыря, щитовидной железы, простаты и яичников, лимфомы, включая лимфомы Ходкинса и не Ходкинса, нейробластому, меланому, миелому, опухоль Вильма и лейкемии, включая острую лимфобластическую лейкемию, и острую миелобластическую лейкемию.

Следующие эксперименты и примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение каким-либо образом. Они четко показывают, что рецептуры настоящего изобретения обеспечивают значительную экономию времени, снижение опасности для работающего и безопасное введение пациенту.

Эксперимент 1. Было исследовано влияние сосолюбилизатора и наполнителя на время растворения высушенных замораживанием препаратов, содержащих полимерный конъюгат доксорубицина (РК1 конъюгат). В табл. 1 приводятся рецептуры, высушенные замораживанием.

Восстановление лиофилизованных препаратов осуществляют или стерильной водой или хлоридом натрия для инъекций.

Время для полного восстановления было следующим: Ампула, N - Время, мин 1 - Oколо 60 (с обоими растворителями)
2 - Oколо 60 (с обоими растворителями)
3 - 15 - 20 (с обоими растворителями)
4 - Mенее 1 (с обоими растворителями)
Эксперимент 2. Влияние одновременного присутствия сосолюбилизатора и наполнителя (с и без органического растворителя в процессе сушки вымораживанием) было исследовано на конъюгате полимердоксорубицин (РК2 конъюгате).

Следующие композиции были высушены вымораживанием (табл.2).

Были получены следующие результаты (восстановление стерильной водой):
Ампула, N - Время полного растворения, мин
1 - 4 - 5
2 - 1,5
3 - 4 - 5
4 - 0,75 - 1,5
5 - 1,0 - 1,5
6 - 1,0 - 1,5
Пример 1. Получают композиции полимерсвязанного доксорубицина по методике, приведенной ниже. Относительные пропорции различных компонентов, использованных в композиции, приведены ниже (количество на ампулу):
РК2 - 700 мг (эквивал. примерно 50 мг доксорубицина)
Лактоза - 600 мг
Полисорбат - 10 мг
Соляная кислота - До pH≠5,0
Этанол - 0,1 мл
Вода для инъекций - До 15,0 мл
Лактозу, полисорбат 80 и РК2 последовательно растворяют при перемешивании в воде для инъекций, деаэрированной пропусканием азота (примерно 90% от окончательно требующегося объема воды). После установления pH 5,0 соляной кислотой добавляют этанол.

Раствор затем доводят до конечного объема деаэрированной водой для инъекций. Затем раствор стерильно фильтруют через микропористую мембрану 0,22 мкм. Объемы 15,0 мл раствора асептически распределяют в стерильные бесцветные ампулы типа 1, имеющие емкость 50 - 56 мл.

Растворы замораживают в ампулах при температуре от -40 до -45^oC в течение 4-5 ч.

Затем проводят лиофилизацию, сушат продукт, на конечной стадии при примерно 40^oC в течение 5-6 ч.

Ампулы закрывают стерильными пробками из хлорбутилового каучука и герметизируют алюминиевыми крышками.

Полное растворение высушенных вымораживанием осадков (восстановление или стерильной водой, или хлоридом натрия для инъекций) происходит приблизительно за 60 с.

Следуя аналогичной процедуре, готовят идентичную рецептуру РК1 полимерсвязанного доксорубицина.

Пример 2. Следуя методике примера 1, готовят следующие лиофилизованные композиции (количество на ампулу) (табл.3).

Полное растворение высушенных замораживанием осадков (восстановление или стерильной водой, или хлоридом натрия для инъекций) происходит приблизительно за 0,75-1,5 мин.

Пример 3. Следуя методике примера 1, готовят следующие лиофилизованные рецептуры (количество на ампулу) (табл.4).

Полное растворение высушенных замораживанием осадков (реконструкция 25 мл стерильной воды) достигается за 3 - 5 мин.

Пример 4. Следуя методике примера 1, готовят следующие лиофилизованные композиции (количество на ампулу - бесцветные стеклянные ампулы типа 1 емкостью 8 - 10 мл были использованы) (табл.5).

Полное растворение высушенного замораживанием осадка (восстановление 2,5 мл или стерильной воды, или хлорида натрия для инъекций) достигается за 0,5 мин.

Пример 5. Стабильность композиций изобретения.

Исследуют на длительную стабильность высушенные замораживанием ампулы, содержащие композиции согласно настоящему изобретению, состоящие из примерно 50 мг связанного доксорубицина, в течение различных периодов времени при различных температурах.

Следующие параметры были исследованы и также получены приемлемые стандарты.

Внешний вид: бесцветные стеклянные ампулы, содержащие пористую красную высушенную замораживанием массу или осадок, определенные визуальным исследованием.

Суммарное содержание доксорубицина: УФ-спектрометрический метод.

Родственные вещества: ВЭЖХ метод.

Вода: не более 3%.

Время восстановления^*: не более 3 мин.

Внешний вид после восстановления^*: чистый и прозрачный красный раствор, по существу не содержащий видимых частиц инородного материала.

pH после восстановления^*: 4,5 - 7,0
* Содержимое ампул растворено в 25 мл воды для инъекций, ВР.

Применяют следующий УФ-спектрофотометрический метод:
Материалы:
Доксорубицин HCl, рабочий стандарт.

Метанол, УФ-чистый.

Вода для инъекций, ВР.

2H соляная кислота, AСS сорт.

50 мг (доксорубициновый эквивалент) PK1 высушенных замораживанием в ампулах.

50 мг (доксорубициновый эквивалент) PK2 высушенных замораживанием в ампулах.

Высокоточная стеклянная лабораторная посуда.

Оборудование. УФ-видимый спектрофотометр, ФИЛИПС мод. PU 3740 или эквивалент Графический принтер, ФИЛИПС мод. 357820 или эквивалент.

Растворы.

Растворитель для спектрометрических измерений:
Переносят 5 мл 2H HCl в мерную колбу на 1000 мл и заполняют до метки метанолом (Растворитель 5).

Стандартный раствор.

Переносят примерно 10,7 мг точно взвешенного доксорубицина HCl рабочего стандарта, соответствующего примерно 10 мг доксорубицина в виде свободного основания, в мерную колбу на 50 мл и растворяют в объеме растворители S (Раствор A).

Разбавляют 10,0 мл точно отмеренного раствора A в 50 мл растворителя в мерной колбе.

Раствор образца.

Растворяют содержимое высушенных вымораживанием ампул 50 мг (доксорубициновый эквивалент) PK1 или PK2 в 25 мл воды для инъекций.

Переносят 2,0 мл точно отмеренных в мерную колбу на 100 мл и разбавляют до объема растворителем S.

Аналитическая процедура. Спектры снимают в кюветах длиной 1 см, снимают спектр стандартного раствора и раствора образца в интервале 350 - 550 нм и смотрят поглощение при максимуме длины волны (478 нм), используя растворитель в качестве пустого измерения.

ВЭЖХ методика было следующей:
Материалы:
Доксорубицин HCl, рабочий стандарт.

PK1 лекарственное вещество, рабочий стандарт.

PK2 лекарственное вещество, рабочий стандарт.

Ацетонитрил, чистота для ВЭЖХ.

Вода, чистота для ВЭЖХ.

Трифторуксусная кислота, чистота для ВЭЖХ.

2H гидроксид натрия, чистый для анализа.

85% фосфорная кислота, чистота для анализа.

50 мг (доксорубициновый эквивалент) высушенного вымораживанием в ампулах PK1.

50 мг (доксорубициновый эквивалент) высушенного вымораживанием в ампулах P2K.

Оборудование.

Жидкостная хроматография Милтон Рой СМ 4000 или эквивалент, оборудованная.

Хроматографическая колонка: Видак С18 (длина 250 мм, внутренний диаметр 4,6 мм), поставленная Сепарейшнс Груп, Хеспeриа, Калифорния (США).

Клапан впуска: Реодин модель 7125 или эквивалент, снабженный петлей образца 50 мкл.

Детектор: Милтон Рой модель 3100 или эквивалент.

Мембранный фильтр, пористость 0,22 мкм, Миллипор Дурапор G P или эквивалент.

Высокоточная лабораторная стеклянная посуда.

Приготовление растворов.

Подвижная фаза A, состоящая из воды, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты (объем/объем), профильтрованной через мембранный фильтр и диаэрированнoй.

Подвижная фаза B, состоящая из ацетонитрила, содержащего 0,07% трифторуксусной кислоты (объем/объем), профильтрованной через мембранный фильтр и диаэрированного.

Стандартный раствор доксорубицина HCl.

Переносят примерно 5 мг точно взвешенного доксорубицина HCl, рабочего стандарта, в мерную колбу 100 мл и растворяют до объема в воде, чистоты для ВЭЖХ. Разбавляют 5 мл, точно отмеренных, этого раствора в 50 мл мерной колбе водой/ацетонитрилом 70/30, чистоты для ВЭЖХ.

Стандартные растворы РК1 или РК2.

Переносят точно взвешенное количество PK1 или PK2 полимера, рабочего стандарта, соответствующее примерно 10 мг доксорубицина HCl в 50 мл мерную колбу и растворяют в объеме вода/ацетонитрил 70/30, чистоты для ВЭЖХ.

Раствор образца.

Растворяют содержимое из 50 мг (доксорубицин эквивалент) высушенных замораживанием ампул в 25 мл точно отмеренных воды чистоты для ВЭЖХ. Разбавляют 1 мл, точно отмеренный, в мерной колбе на 10 мл водой/ацетонитрилом 70/30, чистоты для ВЭЖХ.

Разрешающий раствор.

Переносят примерно 10 мг доксорубицина HCl в 100 мл мерную колбу, растворяют в 5 мл воды, чистоты для ВЭЖХ, добавляют 5 мл фосфорной кислоты и оставляют стоять на примерно 30 мин. Устанавливают с помощью 2 H гидроксида натрия (примерно 37 мл) pH 2,6 ± 0,1 и доводят до метки водой, чистоты для ВЭЖХ.

Примечание: порции этого раствора могут быть заморожены до тех пор, пока не возникнет потребность, затем оттаивают и смешивают перед использованием.

Условия хроматографии.

Раствор образца, стандартный раствор доксорубицина HCl и стандартные растворы PK1/PK2 альтернативно впрыскивают в жидкостной хроматограф при следующих экспериментальных условиях:
Температура колонки: комнатная температура (22 - 24^oC).

Скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин.

Аналитическая длина волны: 254 ± 1 нм.

Градиентные условия приведены в табл.6.

Инжектируемый объем: 50 мкл.

Интегрирующая регистрация затухания: 0 - 10 мин, 64; >10 мин, 512.

Скоростная диаграмма: 0,5 см/мин.

В этих условиях доксорубицин HCl имеет время удерживания около 5 минут, PK1 и PK2 полимеры, конъюгированные с доксорубицином, имеют время удерживания около 16 - 17 мин.

Результаты, полученные при изучении стабильности рецептур, приведенных в примере 1, даны в табл. 7 - 11 для рецептуры PK1 и в табл. 12 - 16 для рецептуры PK2 в отношении одной партии как PK1, так и PK2 высушенных замораживанием ампул.

Формула изобретения

\\\1 1. Лиофилизованная противоопухолевая композиция, включающая конъюгат на основе антрациклинового гликозида, соединенного с пептидным спейсером, и сосолюбилизирующий агент, отличающаяся тем, что конъюгат содержит звенья сополимера на основе N-алкилметакриламида в количестве 60 - 98 мол.%, 1 - 20 мол. % звеньев формулы I \\\6 \\\1 где P - пептидный спейсер; \\\4 A - антрациклиновый гликозид; \\\4 0 - 20 мол.% звеньев формулы II \\\6 \\\1 где P - пептидный спейсер; \\\4 T - целевой фрагмент. \\\2 2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанным сополимером на основе N-алкилметакриламида является сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида. \\\2 3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанным антрациклиновым гликозидом является даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин. \\\2 4. Композиция по любому из пп.1 - 3, отличающаяся тем, что указанным пептидным спейсером является спейсер Gly-Phe-Leu-Gly. \\\2 5. Композиция по любому из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что указанным сосолюбилизирующим агентом является полисорбат, полоксамер, полиэтиленгликолевый эфир жирной кислоты или фосфатид. \\\2 6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что указанный сосолюбилизирующий агент выбран из полисорбата 20, полисорбата 80, полоксамера формулы \\\6 HO(CH₂CH₂O)_a · (CH(CH₃)CH₂O)_b · (CH₂CH₂O)_aH, \ \ \1 где a = 75; \\\4 b = 30, \\\1 полиоксиэтиленстеарата и лецитина. \\\2 7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанным целевым фрагментом T в формуле II является галактоза, галактозамин, глюкозамин, маннозамин, фукозиламин или лактозамин. \\\2 8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанным конъюгатом является конъюгат, содержащий x мол.% звеньев формулы A, y мол.% звеньев формулы B и z мол.% звеньев формулы C \\\6 \\\1 где x = 85 - 98 мол.%; \\\4 y = 1 - 10 мол.%; \\\4 z = 0 - 14 мол.%, \\\1 или конъюгат, содержащий x мол.% звеньев формулы A, y мол.% звеньев формулы B, z мол.% звеньев формулы D и w мол.% звеньев формулы C, указанных выше, \\ \ 6 \\\1 где w = 1 - 18 мол.%; \\\4 x = 80 - 97 мол.%; \\\4 y = 1 - 10 мол. %; \\\4 z = 0 - 18 мол.%. \\\2 9. Композиция по пп.1 - 8, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит наполнитель. \\\2 10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что указанным наполнителем является сахар, полиатомный спирт, аминокислота, полимер, полисахарид или неорганическая соль, выбранная из фосфата натрия, фосфата калия и хлорида натрия. \\\2 11. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что указанным сахаром является глюкоза, мальтоза, сахароза или смесь сахарозы и лактозы. \\\2 12. Стерильная водная композиция для инъекций, включающая лиофилизованную противоопухолевую композицию, содержащую конъюгат на основе антрациклинового гликозида, соединенный с пептидным спейсером, и сосолюбилизирующий агент, отличающаяся тем, что конъюгат содержит звенья сополимера на основе N-алкилметакриламида в количестве 60 - 98 мол. %, 1 - 20 мол.% звеньев формулы I \\\6 \\\1 где P - пептидный спейсер; \\\4 A - антрациклиновый гликозид, \\\1 и 0 - 20 мол.% звеньев формулы II \\\6 \\\1 где P - пептидный спейсер; \\\4 T - целевой фрагмент.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10