Способ утилизации жидких отходов производства пальмового масла

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается утилизации жидких отходов производства пальмового масла. Способ заключается в том, что на жидких отходах производства пальмового масла выращивают целлюлозоразрушающие грибы рода Mucor и/или дрожжи рода Candida и/или бактерии рода Bacillus. Из грибов рода Mucor могут быть использованы штаммы Mucor sp. MF-I и/или Mucor sp. MF-2, из дрожжей рода Condida штаммы Condida foliarum М-07 и/или Condida utilis M-08 или М-09, а из бактерий рода Bacillus штаммы Bacillus pumilis 7а или Bacillus cereus KP-4. Наряду с грибами Mucor целесообразно выращивать лигнинразрушающие грибы Phanerochaete chrysosporum F-66. Одновременно или последовательно с грибами следует выращивать дрожжи Candida. Перед выращиванием микроорганизмов в жидкие отходы производства пальмового масла могут быть внесены твердые отходы данного производства или отходы производства сельского хозяйства. После выращивания дрожжей или грибов на остаточном субстрате могут быть дополнительно выращены штаммы бактерий Bacillus pumilis 7а, Bacillus cereus КР-4, Pseudomonas putida DВ, Tiodictyon elegans HP или Sulfobacillus thermotolerans M. Жидкие отходы производства масла могут быть разбавлены или сконцентрированы. 8 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается утилизации жидких отходов производства пальмового масла путем переработки последних в полезные продукты микробиологическим методом.

В странах Юго-Восточной Азии с развитым сельским хозяйством сосредоточена значительная часть мирового производства пальмового масла, а сопутствующие этой отрасли производства промышленные отходы являются одним из главных загрязнителей окружающей среды.

С другой стороны, эти отходы представляют собой богатый природный источник углерода и могут быть использованы как субстрат для выращивания микроорганизмов, синтезирующих полезные продукты.

Такой характер утилизации отходов производства пальмового масла представляется наиболее перспективным и, начиная с 70-х годов, была опубликована серия работ по использованию микроорганизмов для очистки жидких отходов и сточных вод производства пальмового масла.

В частности, при аэробной и анаэробной ферментации жидких отходов производства пальмового масла природными ассоциациями в прудах очистки процесс осуществляется в течение 20 - 100 дней (A.N. Ma, S.C. Cheah and M.C. Chow - Current status of palm oil processing wasters management, In book: Waste Management in Malaysia - Current Status and Prospects for Bioremediation. B. G. Yeoh et al. (Eds.), 1993, pp. 111 - 136). В ходе очистки образуется биогаз, а полученная биомасса используется в качестве органического удобрения.

Стоки после прудов могут быть использованы в качестве субстрата для выращивания Trichoderma viride ATEC 32086 с получением после 10 - 14 дней ферментации 1,37 - 1,42 г/л биомассы, содержащей 37,6 - 40,7% сырого протеина (M.I.A. Karim and A.Q.A. Kamil- Biological Treatment of Palm Oil Mill Effluent using Trichoderma vivide, Biological Wastes, 27 (1989), pp. 143 - 152). Полученный продукт мог служить источником белка для корма животных.

Достаточно интересными были попытки использовать предварительно обработанные в течение 4 дней жидкие отходы производства пальмового масла в качестве субстрата для выращивания фотосинтезирующих бактерий Rhodotonacter sphaeroides (IFO 12203) для получения биоразлагаемых полимеров типа полигидроксиалконатов. После 5 дней ферментации получали 0,37 г/л биополимера. (Hassan M.A., Salam M., Ismail F., Abdul Karim M.A. and Shirai Y. - Bioplastics from palm oil mill effleuenr by photosynthetic bacteria, Challenges in Microbiology for the 21 s Century. Proceedings of the 17th. Malaysian Microbiology Symposium, Penang Malaysia, 29 - 30 Nov., 1994).

Было показано, что жидкие отходы производства пальмового масла с дополнительными источниками азота и фосфора могут служить субстратом для выращивания грибов Aspergillus oryzae IMI 44242. После 72 часов выращивания грибов в колбах при температуре 30^oC была получена биомассы, содержащая 22 - 35% сырого протеина, с выходом биомассы 52 - 59% от органического субстрата. При периодическом выращивании в ферментере после 48 - 72 часов было получено 4 г/л сырого протеина с выходом биомассы 50% от органического субстрата. (T. W. Barker and J.T. Worgan- The Utilisation of Palm Oil Processing Effieuents as Substrates for Microbial Protein Production by the Fungus Aspergilus oryzae, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 1981, 11, 234 - 240).

На одном из видов жидких отходов производства пальмового масла - на стерильном конденсате, содержащем 0,75% целлюлозы, после выращивания различных штаммов гриба Trichoderma reesei при температуре 28^oC была получена биомасса с содержанием сырого протеина 27%, а в результате выращивания термофилных микроорганизмов CF-27 при температуре 45^oC после 4 дней был получен также целлюлазный комплекс ферментов и биомасса с содержанием 30% сырого протеина (S. C. Cheah, A.N. Ma, L.C.L Ooi and A.S.H. Ong- Biotechnological Applications for the Utilisation of Wastes from Palm Oil Mills, Fat Sci. Technol., 90, Jahrgang, Mai, 1988, 536 - 540).

Упомянутые способы несомненно представляют практический интерес, поскольку позволяют перерабатывать загрязняющие окружающую среду промышленные отходы в ценные и полезные продукты. Однако эти технологии, использующие природные микробные ассоциации и монокультуры, весьма длительны во времени и не адаптированы к промышленному производству. По этой причине их использование пока не позволяет радикально решить проблему защиты окружающей среды от загрязнения промышленными отходами, в первую очередь, отходами производства пальмового масла.

Настоящее изобретение позволяет решить несколько задач, направленных на утилизации отходов производства пальмового масла: значительно интенсифицировать процесс переработки жидких отходов производства пальмового масла, сократить длительность производственного цикла до 10-36 часов; вовлечь в процесс утилизации жидких отходов производства пальмового масла твердые отходы этого производства, а также другие сельскохозяйственные и промышленные отходы, загрязняющие окружающую среду, такие как шелуха плодов какао или кофе, древесные опилки и подобное; изыскать высокопроизводительные штаммы микроорганизмов, энергично деградирующие отходы производства пальмового масла и отходы других производств; подобрать комбинации грибов, дрожжей и бактерий, способных комплексно и более энергично утилизировать сельскохозяйственные и производственные отходы, чем отдельные представители такой ассоциации; разработать применимую в промышленных масштабах технологию освобождения окружающей среды от отходов производства пальмового масла и отходов других сельскохозяйственных производств, которые являются загрязнителями окружающей среды; получить биопродукты, которые могут быть использованы в качестве исходного сырья для выделения биологически ценных веществ, высокобелковой добавки в корм животных, птиц и рыб или органического удобрения.

Поставленные задачи были решены за счет изыскания высокоактивных культур грибов, дрожжей и бактерий, активно разрушающих отходы производства пальмового масла и отходы других сельскохозяйственных производств и превращающих эти отходы в ценные биопродукты.

Такими культурами являются штаммы грибов Mucor sp. MF-1, Mocor sp. MF-2 и Phanerochaete chrysosporum F-66, штаммы дрожжей Candida foliarum M-07, Candida utilis M-08 и Candida utilis M-09, штаммы бактерии Bacillus pumilis 7a, Bacillus cereus KP-4, Pseudomonas putida DB, Thiodictyon elegans HB и Sulfobacillus thermotolerans M.

Отдельные культуры, а предпочтительно их комбинации, при выращивании в оптимальных условиях на жидких отходах производства пальмового масла, как на единственном источнике углерода, образуют до 40 г/л биомассы, содержащей 30-40% белка.

В ферментационную среду дополнительно могут быть внесены целлюлозосодержащие отходы других производств, например шелуха плодов какао.

Ферментационная среда при этом должна быть обогащена источниками азота и фосфора, в качестве которых могут быть использованы аммиак, соли аммония, мочевина, нитраты и фосфаты.

Накопленная таким образом микробная биомасса может быть использована как удобрение, кормовая добавка, а также в других утилитарных целях.

Сущность настоящего изобретения состоит в том, что жидкие отходы производства пальмового масла используют в качестве питательного субстрата для выращивания микроорганизмов, превращая загрязняющие окружающую среду производственные отходы в биопродукты, представляющие самостоятельную ценность.

В частности, получаемая микробная биомасса может использоваться как белковая добавка в корму сельскохозяйственных животных и птиц, как исходный материал для получения белковых гидролизатов и питательных сред, а также как органическое удобрение.

Жидкие отходы производства пальмового масла, остающиеся после извлечения из исходного сырья пальмового масла, довольно богаты питательными веществами, которые могут утилизироваться микроорганизмами, что видно из таблицы 1.

Жидкие отходы производства пальмового масла (ОППМ) служат основой питательной среды для культивирования соответствующих микроорганизмов.

Органические вещества, содержащиеся в этих отходах, могут служить единственным и достаточным источником углерода для развивающихся микроорганизмов. Жидкие отходы производства пальмового масла могут быть разбавлены водой или сконцентрированы в зависимости от условия технологии выращивания.

Кроме того, они могут быть дополнены другими углеродными субстратами, в частности твердыми отходами производства пальмового масла - внутренней частью масличного ореха (ВЧМО), пустыми плодами пальмы (ППП) и другими, а также отходами сельскохозяйственного производства и пищевой промышленности, например древесными опилками (ДО) или шелухой плодов какао (ШПК). В этом случае оказывается возможным одновременно утилизировать отходы одного или нескольких производств.

Питательная среда для микроорганизмов, основу которой составляет ОППМ, должна быть обогащена источниками азота и фосфора, например сульфатом аммония и фосфатом аммония. Содержание в среде источника азота должна составлять 1-5 г азота/л, а содержание фосфора - 0,3 - 2,0 г фосфора/л.

Подготовленную таким образом питательную среду засевают соответствующим микроорганизмом или ассоциацией микроорганизмов.

Биологическими объектами, частично разрушающими и утилизирующими жидкие отходы производства пальмового масла, являются целлюлозоразрушающие грибы рода Mucor, в частности Mucor sp. MF-1 и MF-2; дрожжи Candida utilis и Candida foliarum; и бактерии рола Bacilus, в частности Bacillus pumilis, Bacillus cereus. Они способны самостоятельно и энергично перерабатывать растительные отходы пищевой промышленности и сельскохозяйственного производства.

Процесс биодеградации жидких отходов производства пальмового масла и аналогичных продуктов может быть интенсифицирован в результате совместной ферментации целлюлозоразрушающих грибов и дрожжей рода Candida. В частности, для совместного использования с указанными грибами оказались пригодны штаммы Candida foliarum M-07, Candida utilis M-08, Candida utilis M-09.

В случае совместного использования, культуры грибов и дрожжей могут быть внесены в ферментационную среду одновременно или последовательно, например дрожжи могут быть внесены через 10-12 часов после начала ферментации. Кроме того, процесс может быть многостадийный - на первой стадии выращивают грибы, затем после удаления полученной биомассы, засевают дрожжи. После удаления дрожжевой биомассы среда может быть засеяна бактериями, в частности Bacillus pumilis, Bacillus cereus, Pseudomonas putida, Thiodictyon elegans или Sulfobacillus thermotolerans. В этом случае получается наиболее полная утилизация субстрата.

Некоторые результаты утилизации ОППМ или его смеси с твердыми отходами сельскохозяйственного производства индивидуальными или смешанными культурами микроорганизмов приведены в таблицы 2.

Из представленных данных видно, что во всех случаях, т.е. при использовании всех субстратов, наблюдается активный рост микробных культур и утилизации субстратов, но применение смешанных культур дает более высокие результаты - ускоряет процесс и повышает выход белка.

Еще более высокий результат может быть достигнут в том случае, когда, кроме указанных выше культур в ассоциации микроорганизмов входит гриб Phanerochaete chrysosporum F-66, разлагающий лигнин, особенно в тех случаях, когда утилизируемый субстрат содержит древесные опилки, что следует из данных таблицы 3.

Кроме того, было показано, что участие в деградации отходов производства пальмового масла и сельскохозяйственного производства бактериальных культур на завершающих стадиях весьма полезно.

Последовательная обработка смеси ОППМ и шелухи плодов какао сначала ассоциацией грибов Mucor sp. MF-2 и Phanerochaete chrysosporum FF-66, затем дрожжами Candida utilis M-08, а в завершении бактериальной культурой Bacillus pumilis 7a дало наивысший результат - выход биомассы составил 68% от веса исходного субстрата, а содержание белка в биомассе - 42%.

Аналогичная обработка этого же субстрата, но без участия бактериальной культуры привела к выходу биомассы 60%, а содержание белка в биомассе было 38%.

Конкретные, упоминаемые выше, представители тех родов и видов микроорганизмов, которые рекомендованы для использования в границах настоящего изобретения, депонированы в коллекции института ГосНИИ"синтезбелок" (Россия).

Более подробно сущность изобретения поясняется следующими примерами, не ограничивающими, однако, существа предложения.

Пример 1. В 3,5 л жидких отходов производства пальмового масла (ОППМ), содержащих 5% сухих веществ и 1,6% т азота, внесли 45,0 г сульфата аммония и 16,0 г двузамещенного фосфата аммония, как источника азота, приготовив тем самым питательную среду, в которой единственным источником углерода служили ОППМ.

Эту среду засеяли нативным мицелием целлюлозоразрушающего грибка Mucor sp. MF-1 из расчета посевной дозы 0,1 г/л.

Выращивание проводили в ферментере Биостат-E с механической мешалкой при парциальном давлении кислорода 20, pH 5,0 и температуре 42^o в течение 34 часов.

После завершения ферментации было получено 84,0 г биомассы, что составило 58,7% от исходного субстрата, с относительным содержанием белка (сырого протеина) 33,2%.

Всего было получено 31,2 г белка с выходом 17,8%.

Пример 2. В 5 л ОППМ, содержащего 6% сухих веществ вносили 50 г двузамещенного фосфата аммония.

Засевали дрожжами Candida foliarum M-07 из расчета 0,2 г/л.

Выращивали на ферментере Биостат E с механической мешалкой при температуре 43^oC, pH 5,0 в течение 24 часов.

После завершения ферментации было получено 220 г биомассы, содержащей 31,5% сырого протеина.

Пример 3. В 3,5 л ОППМ внесли 45,0 г сульфата аммония и 15,0 г двузамещенного фосфата аммония и довели водой до 7,0 л. Содержание в полученной питательной среде сухих веществ составило 165 г, а содержание азота - 2,97 г.

Среду засеяли нативным мицелием гриба Mucor sp. MF-1 из расчета посевной дозы 0,14 г/л.

Выращивание проводили в условиях, описанных в примере 1, в течение 11 часов, а затем в среду внесли посевной материал культуры дрожжей Candida utilis M-08 из расчета посевной дозы 0,25 г/л и продолжали культивирование еще 14 часов.

После завершения ферментации было получено 116,0 г биомассы, содержащей 40,4% белка.

Выход биомассы составил 70,3% от исходного субстрата, а выход белка 28,4%.

Пример 4. В 6,0 л ОППМ внесли 45,0 г сульфата аммония и 15,0 г двузамещенного фосфата аммония. Содержание в полученной питательной среде углеродного субстрата составило 300 г, а азота - 18 г.

Среду засевали одновременно нативным мицелием целлюлозоразрушающего гриба Mucor sp. MF-1, нативным мицелием лигнинразрушающего гриба Phanerochaete chrysosporum F-66 и нативной суспензией дрожжей Candida utilis M-08.

Выращивание проводили в описанных выше условиях в течение 24 часов.

После завершения ферментации было получено 165,0 г биомассы, содержащей 40,0% белка.

Выход биомассы составил 55% от исходного субстрата, а выход белка - соответственно, - 22,0%.

Пример 5. ОППМ был сконцентрирован в два раза, т.е. содержание сухих веществ составляло 100 г/л. В 3,5 л концентрата было внесено 45 г сульфата аммония и 15 г двузамещенного фосфата аммония.

Засеяли грибами Mucor sp. MF-1, и Phanerochaete chrysosporum F-66 и дрожжами Candida utilis M-08 и Candida fuliarum M-07 одновременно.

Выращивание проводили в течение 24 часов.

После завершения ферментации было получено 245 г биомассы, содержащей 38,2% белка.

Выход биомассы составил 70%, а выход белка - 26,7%.

Пример 6. Питательная среда была приготовлена смешением ОППМ и шелухи плодов какао в соотношении 1:1 по сухим веществам. Содержание в полученной питательной среде органического субстрата составило 420,0 г, а неорганического азота - 28,8 г. Общий объем питательной среды равнялся 5 л.

Среду засеяли ассоциацией грибов Mucor sp. MF-2, Phanerochaete chrysosporum F-66 и дрожжей Candida utilis M-09.

Выращивание проводили в ферментере Биостат-E при парциальном давлении кислорода 10,0, pH 5,0 и температуре 42 градуса в течение 42 часов.

После завершения ферментации было получено 245 г биомассы, содержащей 40,8% белка.

Выход биомассы составил 58%, а выход белка - 23,8%.

Пример 7. Питательная среда была приготовлена путем суспендирования в жидких отходах шелухи плодов какао при соотношении 1:1 (по сухому весу). Суммарное содержание субстрата равнялось 421 г.

Среду засеяли в ферментере Биостат E с рабочим объемом 5 л ассоциацией целлюлозоразрушающего гриба Mucoor sp. MF-2 и лигнинразрушающего гриба Phanerochaete chrysosporum F-66 и проводили культивирование в течение 18 часов. Затем в ферментационную среду вносили дрожжевую культуру Candida utilis M-08 и продолжали ферментацию еще 12 часов.

На завершающем этапе среду инокулировали бактериальной культурой Bacillus pumilis 7a и культивировали ее в течение 6 часов.

После завершения процесса выращивания было получено 295 г биомассы с содержанием белка 40%.

Выход биомассы составил 70%, а выход белка 28%. В жидкой среде осталось 4% исходного органического субстрата.

Пример 8. Питательной средой служила культуральная жидкость, полученная после выращивания ассоциации грибов Mucor sp. MF-1, Mucor sp. MF-2, Phanerochaete chrysosporum F-66 и дрожжей Candida utilis M-08 на смеси ОППМ и шелухи плодов какао, содержащей 20 г/л остаточных органических веществ.

Колбы, содержащие 100 мл указанной выше среды без других добавок, засеяли различными штаммами бактерий. Концентрация инокулята была одинакова. Выращивание проводили на термостатированной качалке при температуре 42^oC и pH 7,0 в течение 10 часов. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Пример 9. Питательная среда была приготовлена путем суспендирования в 50 мл ОППМ 2,0 г древесных опилок. В среду было внесено 0,15 г двузамещенного фосфата аммония.

Среду засеяли ассоциацией целлюлозоразрушающего гриба Mucor sp. MF-2 и лигнинразрушающего гриба Phanerochaete chrysosporum F-66.

Выращивание проводили в колбах на термостатированной качалке при температуре 42 градуса в течение 48 часов.

После завершения процесса ферментации было получено 3 г биомассы с содержанием органического азота 4,5%.

Выход биомассы составил 67%.

Пример 10. Питательная среда была приготовлена путем суспендирования в 50 мл ОППМ 2,0 г пустых плодов пальмы. В среду было внесено 0,15 г двузамещенного фосфата аммония.

Среду засеяли ассоциацией целлюлозоразрушающего гриба Mucor sp. MF-2 и лигнинразрушающего гриба Phanerochaete chrysosporum F-66 и дрожжей Candida utilis M-09.

Выращивание проводили в колбах на термостатированной качалке при температуре 42^o в течение 38 часов.

После завершения процесса ферментации было получено 3,1 г биомассы с содержанием органического азота 3,3%.

Выход биомассы составил 69%.

Пример 11. Бактерии Bacillus pumilis 7a и Bacillus cereus KP-4 выращивали в колбах, содержащих 100 мл жидких отходов производства пальмового масла (ОППМ), полученных путем центрифугирования в течение 20 минут при 8000 G, с добавкой 2 г однозамещенного фосфата аммония. Температура выращивания 42 градуса, PH-6,8, время выращивания - 16 часов. Биомассу выделяли путем центрифугирования. Лиофильно высушенная биомасса Bacillus pumilis 7a содержала 52% сырого протеина при концентрации 12 г/л, а Bacillus cereus KP-4 - 58% белка при концентрации 10 г/л.

Биомасса, накапливающаяся в результате выращивания грибов Mucor sp. и Phaenrochaete chrysosporum, дрожжей Candida utilis и Candida foliarum, бактерии Bacillus pumilis, Bacillus cereus и Pseudomonas putida на жидких отходах производства пальмового масла представляет собой сухую, сыпучую, гетерогенную массу от светлого до темно-коричневого цвета. Величина частиц до 400 меш, влажность 5-6%. Содержание золы не более 8%, углерода - 42-45%, сырого протеина - не менее 35%, липидов - до 6%, нитратов - не более 200 мг/кг. Содержание тяжелых металлов не более (мг/кг продукта): свинца - 5, мышьяка - 2, ртути - 0,1, фтора - 100, кадмия - 0,3.

Эта биомасса не обладает токсичностью на тест - объектах инфузории Тетрахимена пириформис и белых мышах. Не содержит санитарно-показательных микроорганизмов.

Может храниться в сухом помещении в полиэтиленовых мешках, не допускающих изменения влажности продукта, при температуре от 20 до 40 градусов в течение 2 лет.

Этот продукт может использоваться в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных.

Обогащенная органическим азотом биомасса, получаемая при выращивании ассоциации грибов и дрожжей на смеси жидких отходов с древесными опилками или пустых плодов пальмы, может быть использована в качестве органического удобрения.

Штамм гриба Mucor sp. MF-1 выделен из стоков производства пальмового масла, а штамм MF-2 выделен из почвы Малайзии. Аэробы. Хорошо растут в жидких аэрируемых средах, а также на поверхности твердых сред. На твердых питательных средах образуют обильный хорошо ветвящийся, несепарированный субстратный и воздушный мицелий. Размножаются половым и вегетативным путем. Образуют крупные многоспоровые спорангии шаровидной формы, сидящие на толстых, вертикальных спорангиеносцах. Зрелые спорангии темно-серые, почти черные. Споры круглые с оболочкой, неподвижные, появляются в среде при разрыве созревшего спорангия. При половом процессе образуются зиготы путем слияния двух концов гиф, которые отделяют перегородкой от остального мицелия. В жидкой хорошо аэрируемой среде образуют множество глобул. Ассимилируют различные сахара, органические кислоты, крахмал и целлюлозу. В качестве источника азота могут использовать соли аммония, нитраты и мочевину. Растут при pH от 3 до 8 (оптимум 5,0-5,5). Обладают широким диапазоном температуры роста от 20 до 50^o. Температурный оптимум 40-43^o. В лабораторных условиях штаммы поддерживаются в пробирках на скошенном сусло-агаре. Частота пересевов один раз в 2-3 месяца. Штаммы не токсичны, не патогенны, а также не фитопатогенны и не фитотоксичны.

Штамм гриба Phanerochaete chrysosporum F-66 получен из коллекции института ГосНИИсиннтезбелок, Россия. Аэроб. Хорошо растет как на поверхности твердых тел, так и в жидких синтетических аэрируемых средах. Образует обильный ветвящийся субстратный мицелий белого цвета. При длительном культивировании мицелий исчезает и микроскопирование показывает, что остаются только споры (или конидии) яйцеобразной формы белого цвета. Размножается половым и вегетативным путем. В жидких культурах при аэрации может образовывать глобулы. Ассимилирует сахара, органические кислоты и лигнин. Не обладает целлюлозной активностью. Оптимум pH 5,0-5,5. Температура роста до 45 градусов, оптимум 34-40^o. В лабораторных условиях штамм поддерживается в пробирках на скошенном сусло-агаре. Частота пересевов один раз в 2-3 месяца. Штамм не токсичен, не патогенен, а также не фитопатогенен и не фитотоксичен.

Штамм дрожжей Candida foliarum M-07 выделен из стоков производства пальмового масла в Малайзии. Клетки в глюкозо-пептонной среде одиночные элипсоидной формы с почками, расположенными сбоку, не по осевой линии. На одной клетке могут быть 2-3 почки. Аскоспоры не образует. Псевдомицелий не образует. На солодовом сусле образует округлые светлокремовые почти белые колонии, гладкие со слабым блеском, равномерно возвышающиеся с ровным краем. Штрих на сусло-агаре плоский, матовый, светло-кремовый, слегка фестончатый. Ассимилирует глюкозу, D-ксилозу, D-маннозу, D(-)фруктозу, глицерин, адонит, янтарную кислоту, лимонную кислоту. Неассимилирует сахарозу, лактозу, D-мальтозу, D(-)рибозу, D(+)трегалозу, D-галактозу, D-целлобиозу, D-арабинозу, D-мелибиозу, L-рамнозу, D-маннит, крахмал, декстран, инулин, целлюлозу, гексадекан, инозит. Не сбраживает глюкозу. Усваивает нитратный азот. Нуждается в витаминах группы B, особенно в тиамине. Потребность в тиамине частично снимается биотином и никотиновой кислотой. Оптимальная температура роста 440C. Растет в широком диапазоне pH от 4 до 8 с одинаковой скоростью. Необходимые микроэлементы: Zn, Fe, Mn. Cu подавляет рост штамма. Штамм не патогенен и не токсичен, а также не фитопатогенен и не фитотоксичен.

Штамм Candida utilis M-08 выделен из почвы Малайзии. Культура дрожжей на жидкой среде представлена одиночными или собранными в короткие разветвленные цепочки клетками. Форма клеток от овальной до цилиндрической. Размеры 3,5 - 4,5 х 7,0 - 12,0 микрон. Может образовывать примитивный псевдомицелий. Колонии на сусло-агаре округлые, гладкие, серовато-кремовые со слабым блеском. Аскоспоры не образует. Факультативный аэроб. Ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, этанол, маннит, адонит, лимонную кислоту, ряд жирных кислот, включая высокомолекулярные. Сбраживает глюкозу и сахарозу. Использует аммонийный и нитратный азот, а также мочевину. Биотинзависимый. Расчет в широком диапазоне pH от 3 до 7 и температуры 20 - 47^o. В лабораторных условиях штамм поддерживают в пробирках на скошенном сусло-агаре. Можно также поддерживать на синтетических средах с сахарами и дополнительными факторами роста или мелассы. Штамм не токсичен, не патогенен, а также не фитопатогенен и не фитотоксичен.

Штамм Candida utilis M-09 выделен из стоков производства пальмового масла. Культура дрожжей на жидкой среде представлена одиночными или собранными в короткие разветвленные цепочки клетками. Форма клеток более округлая, чем у штамма M-08, а штрих старой культуры на скошенном сусло-агаре менее жесткий. Размеры клеток 3,5 - 4,5 · 7,0 - 12,0 микрон. Может образовывать примитивный псевдомицелий. Колонии на сусло-агаре округлые, гладкие, серовато-кремовые, со слабым блеском. Аскоспоры не образует. Факультативный аэроб. Ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, этанол, маннит, адонит, лимонную кислоту, ряд жирных кислот, включая высокомолекулярные. Сбраживает глюкозу и сахарозу. Использует аммонийный и нитратный азот, а также мочевину. Биотинзависимый. Растет в широком диапазоне pH от 3 до 7 и температуры 20 - 47^o. В лабораторных условиях штамм поддерживают в пробирках на скошенном сусле-агаре. Можно также поддерживать на синтетических средах с сахарами и дополнительными факторами роста или мелассы. Штамм не токсичен, не патогенен, а также не фитопатогенен и не фитотоксичен.

Штамм бактерии Bacillus pumilis 7a выделен из почв, загрязненных нефтью. Аэроб. Тонкие прямые палочки 0,6 - 0,8 микрон в ширину, образуют нити и скопления нитей. Образуют округло-овальные эндоспоры. Грамположительны или грамвариабельны. Колонии на МПА - плоские кремовые с чуть приподнятой более темной серединой и фестончатыми краями. На бульоне образует серо-белую пленку, влезающую на края пробирки. Желатину разжижает, молоко пептонизирует. Высокая каталазная активность. Хорошо растет в интервале температур 30 - 50^oC и pH 6,5 - 8,5. Использует органические и неорганические формы азота, включая нитраты и мочевину. Использует широкий спектр органических соединений, включая гетероциклические и ароматические. Устойчивы к 7% NaCl. Штамм не токсичен, не патогенен, а также не фитопатогенен и не фитотоксичен.

Штамм Thiodictyon elegans HB - выделен из донных отложений ферм по разведению креветок в Малайзии. Длинные тонкие палочки 1-2 х 10-12 микрон. Грамположительные, содержат крупные газовые вакуоли. Клетки могут образовывать цепочки и скопления. Фотогетеротроф, способен к активному аэробному гетеротрофному росту на сложных органических и неорганических субстратах, как на свету, так и в темноте. Выросшая в темноте в аэробных условиях на жидких средах культура имеет слабый пурпурный оттенок, который значительно усиливается при выдерживании культуры на свету. Растет в широком диапазоне температур от 28 до 43^oC. Оптимум pH 6-7. Выход от субстрата 50 - 60%.

Штамм Sulaobacillus thermoaceticum M - выделен из стоков производства пальмового масла в Малайзии. Палочки размером 1-2 х 8-10 микрон образуют нити скопления. Способен расти на сложных органических средах. Характеризуется кислотоустойчивостью и галофильностью. Может расти в пределах pH 4,0 - 7,0 и в диапазоне температур 30 - 45^oC.

Штамм Bacillus cereus KP-4 - выделен из растительных сельскохозяйственных отходов. Палочки размером 1-2 х 5-7 микрон, образуют нити. Растет на различных органических средах - моно-, ди-, полисахаридах, в том числе на глюканах и фруктанах. Отличается способностью разлагать широкий спектр азотосодержащих соединений, включая растительные белки. Термотолерантные. На агаризованных средах вырастает в виде складчатых колоний, сходных с колониями грибов. Грамположительные и спорообразующие. Диапазон температур 25 - 43^oC, pH 6,0 - 7,0.

Штамм Pseudomonas putida DB - выделен из почвы Малайзии. Короткие палочки 2-3 х 4-5 микрон. Аэробные, грамотрицательные, неспорообразующие палочки. Способны окислять большое число органических соединений, таких как моносахариды, органические кислоты, углеводороды - октодекан, гексадекан, бензол, полисахариды, декстран, ксантан, различные белки и продукты их распада. Отличается кислотоустойчивостью и термотолерантностью. Диапазон температур роста 30 - 43^oC и pH 4,0 - 7,0.

Таким образом, что подтверждается конкретными примерами осуществления изобретения, предложенный способ позволяет резко повысить производительность процесса утилизации отходов производства пальмового масла и осуществлять этот процесс в промышленных масштабах.

Предложенный способ отличается от существующих известных способов утилизации отходов производства пальмового масла использованием ранее не применявшихся для этих целей культур микроорганизмов и использованием смешанных микробных культур, что также не применялось ранее для решения данной поставленной задачи.

Используемые заявителем микроорганизмы Mucor sp., Phanerochaete chrysosporum, Candida foliarum, Candida utilis, Bacillus pumilis, Bacillus cereus и Pseudoomonas putida не являются общеупотребительными и распространенными продуцентами целлюлитических ферментов и даже не упомянуты в последнем учебном пособии по биоконверсии растительных материалов (А.Б. Синицын, А.В.Гусаков, В.М. Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. - М.: Издательство Московского университета, 1995, с. 220). Следовательно их использование для решения поставленных заявителем задач, не является очевидным.

Нижеприведенные ссылки дают информацию об определителях, на основании которых могут быть идентифицированы штаммы: 1) Определитель низших растений (грибы). /Под редакцией Л.И.Курсанова, М.: Советская наука, 1954.

2) Микрология. Э. Мюллер и др. М.: Мир, 1995.

3) Краткий определитель бактерий Берги. Перевод под редакцией Г.А.Заварзина. - М.: Мир, 1980.

Формула изобретения

1. Способ утилизации жидких отходов производства пальмового масла путем выращивания на них микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов используют целлюлозоразрушающие грибы рода Mucor, дрожжи рода Candida и/или бактерии рода Bacillus.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из целлюлозоразрушающих грибов рода Mucor используют штаммы Mucor sp. MF-1 и/или Mucor.sp.MF-2.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из дрожжей рода Candida используют штаммы Candida foliarum M-07 и/или Candida utilis M-08 или Candida utilis M-09.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что из бактерий рода Bacillus используют штаммы Bacillus pumilis 7a или Bacillus cereus КР-4.

5. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что на жидких отходах производства пальмового масла одновременно или последовательно с грибами рода Mucor выращивают лигнинразрушающие грибы, в частности Phanerochaete chrysosporum F-66.

6. Способ по пп.1, 2 и 5, отличающийся тем, что на жидких отходах производства пальмового масла одновременно или последовательно с грибами выращивают дрожжи рода Candida, в частности Candida foliarum M-07 и/или Candida utilis M-08 или Candida utilis M-09.

7. Способ по пп.1, 2, 3, 5 и 6, отличающийся тем, что после выращивания на жидких отходах производства пальмового масла грибов и дрожжей на остаточном субстрате выращивают бактерии Bacillus pumilis 7a, Bacillus cereus KP-4, Pseudomonas putida ДВ, Thiodictyon elegans НВ или Sulfobacillus thermotolerans M.

8. Способ по пп. 1 - 7, отличающийся тем, что в жидкие отходы производства пальмового масла дополнительно вносят твердые отходы производства пальмового масла или других сельскохозяйственных производств.

9. Способ по пп.1 - 7, отличающийся тем, что перед выращиванием микроорганизмов жидкие отходы производства пальмового масла разбавляют или концентрируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 26-2000

(73) Патентообладатель:Потребительский кооператив Общество взаимного страхования "РЕСУРС" (RU)

Договор № 9864 зарегистрирован 10.02.2000

Извещение опубликовано: 20.09.2000        

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.01.2003

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2004

Извещение опубликовано: 10.04.2004        

---