Способ моделирования иммунодефицитного состояния по системе нейтрофильных гранулоцитов

 

Способ может быть использован в иммунологии для подбора оптимальных иммунокорректоров иммунодефицитных состояний при нарушении в системе нейтрофильных гранулоцитов. Экспериментальным мышам внутрибрюшинно вводят циклофосфамид в дозе 0,5 мг/кг веса животных. Через 15 мин развивается максимальное угнетение количества циркулирующих в периферической крови нейтрофильных гранулоцитов и их рецепторной и фагоцитарной функций, а через 60 мин - полное подавление микробицидных систем нейтрофильных гранулоцитов. Способ позволит создать адекватную экспериметальную модель иммунодефицитного состояния по системе нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте in vivo. 2 табл., 1 ил.

Предполагаемое изобретение относится к иммунологии и медицине и может быть использовано как средство для поиска адекватных корректоров функций клеток гранулоцитарного ряда.

Недостаточность функционирования нейтрофильных гранулоцитов (НГ) рассматривается как фактор риска для развития многих патологических процессов. Дисфункции НГ могут сочетаться и с количественными изменениями, когда имеет место либо нейтропения, либо нейтрофилия.

Очевидная роль НГ в поддержании иммунного гомеостаза в норме и при различных заболеваниях является основанием для поиска средств, корригирующих уровень их функционирования. В связи с этим для правильного подбора адекватных иммунокорректоров НГ необходимо иметь экспериментальную модель иммунодефицитного состояния (ИДС) ин виво по системе НГ, которая отражала бы состояние больного с выраженной депрессией гранулоцитарного звена как в количественном, так и в качественном отношении.

Известен способ получения количественной депрессии НГ у экспериментальных животных, получаемой в результате удаления хирургическим способом вилочковой железы (тимэктомия) (Петров Р.В., Хаитов Р.М. и соавт. Влияние тимэктомии на гранулоцитопоэз.//Радиобиология, 1976, N4, с.560). Однако следует учитывать, что этот метод значительно трудоемок и требует специальных навыков и аппаратуры, является достаточно длительным.

В связи с этим за прототип предлагаемого способа нами был избран метод с использованием раствора гепарина (Колесникова Н.В., Нестерова И.В., Чудилова Г.А. и соавт. Создание экспериментальной модели ИДС по системе нейтрофильных гранулоцитов с помощью гепарина.//Иммунология, N2, 1994, с. 47-49). К недостаткам указанного способа можно отнести недостаточно глубокий, хотя и достоверный, эффект иммунодепрессии, а также побочное влияние гепарина как антикоаугулянта на клетки крови животных.

В работе над созданием новой экспериментальной модели ИДС по системе НГ нами были использованы литературные данные о химических соединениях, обладающих антипролиферативными свойствами, - циклофосфамида - на клетки иммунной системы. Известно, например, что циклофосфамид (ЦД) обладает иммунодепрессивной активностью по отношению к первичному и вторичному иммунному ответу на антигены (Певницкий Л.А., Телегин Л.Ю., Большев В.Н., 1977; Писарев В.М. и соавт. , 1977; Cowry е.a., 1977) Приведены данные (Кузин В.В. и соавт., 1979) о влиянии высоких доз ЦФ на некоторые иммуноморфологические показатели в регионарных лимфоузлах, о влиянии его на возникновение иммунологической толерантности (Роталин Л.Н., Певницкий Л.А., 1978). Имеются сведения об избирательности супрессирующего действия ЦФ по отношению к хелперным и супрессорным Т-лимфоцитам (Schwartz e.a., 1980).

Учитывая изложенные данные, для осуществления цели - создания экспериментальной модели ИДС по системе НГ - были поставлены следующие задачи: - излучить влияние ЦФ в концентрации 0,5 мг/кг и 150 мг/кг веса мышей на количество циркулирующих НГ и их основные функции (рецепторную, фагоцитарную, функции микробицидных систем); - определить временной интервал, после которого развивается максимальный депрессирующий эффект по отношению к НГ.

Сущностью предполагаемого изобретения является внутрибрюшинное введение ЦФ в дозе 0,5 мг/кг, в результате чего через 15 минут развивается максимальная депрессия количества циркулирующих в периферической крови НГ и рецепторной и фагоцитарной функции, а через 1 час - максимальная депрессия функций микробицидных систем, оцениваемая по NBT-тесту (спонтанному и стимулированному).

Для технического решения поставленных задач были использованы линейные мыши F₁(CBAxC57B1), циклофосфан в концентрации 0,5 мг/кг и 150 мг/кг веса животных; шприцы и иглы инъекционные, а также все необходимое оборудование для тестирования состояния системы НГ по ранее описанным методам (Нестерова И.В. и соавт., 1989).

Новизна предлагаемого способа заключается в использовании препарата циклофосфамида путем введения его в организм животного с целью моделирования иммунодефицита по системе НГ.

Изобретательский уровень предложения обосновывается его неочевидностью. Авторам изобретения неизвестно использование предлагаемого способа для моделирования ИДС по системе НГ как средства для проверки иммунокорригирующих свойств лекарственных препаратов, а также новых иммунокорректоров.

Воспроизводимость способа не вызывает сомнения и не требует дополнительных доказательств.

Создание ИДС по системе НГ в эксперименте осуществляется следующим способом: ЦФ в дозе 0,5 мг/кг и 150 мг/кг веса мыши вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл/мышь. Мышей разделяли на следующие группы: 1 - фоновая группа мышей, 2 - введение ЦФ в дозе 0,5 мг/кг (оценка системы НГ через 15 минут), 3 - введение ЦФ в дозе 0,5 мг/кг (оценка системы НГ через 1 час), 4 - введение ЦФ в дозе 150 мг/кг (оценка системы НГ через 15 минут), 5 - введение ЦФ в дозе 150 мг/кг (оценка система НГ через 1 час).

НГ выделяли из крови мышей, забитых декапитацией на градиенте плотности фиколл-верографина. Иммунотропное действие ЦФ оценивали по уровню содержания НГ в периферической крови (процентному и абсолютному), количеству спонтанных розеткообразующих клеток с эритроцитами барана (E-POH ранние, E-POH поздние), с EAC-комплексом (EAC-POH). О состоянии микробицидных систем НГ судили по показателям NBT-теста (спонтанного и стимулированного), фагоцитарную активность НГ и их переваривающую способность оценивали по отношению к бактериям St. aureus (музейный штамм N 209).

Согласно результатам эксперимента депрессивное действие ЦФ в отношении количества циркулирующих НГ проявлялось в дозе 0,5 мг/кг. Причем максимальное подавление количества НГ отмечалось, спустя 15 минут после введения препарата (в 2 раза в сравнении с контролем). Показано также, что при этом наблюдалось максимальное угнетение экспрессии рецепторов к эритроцитам барана (E-POH ранних - в 5,5 раза и поздних E-POH - в 4,5 раза в сравнении с контролем), а также EAC-розеткообразования - почти в 10 раз по отношению к фоновому контролю (табл.1).

Угнетающая способность НГ в дозе ЦФ 0,5 мг/кг (спустя 15 минут после введения) выявлена также и в оценке фагоцитарной функции НГ (в 2 раза по сравнению с контролем) (табл.2).

Функциональные возможности НГ, оцениваемые в нагрузочных тестах ин витро (NBT-тест спонтанный и стимулированный) были абсолютно угнетены через 1 час после введения ЦФ в дозе 0,5 мг/кг мыши, в то время как в более ранние сроки данные NBT-теста не отличались от контроля (табл.2).

Таким образом, результаты экспериментального моделирования позволяют заключить, что для создания модели депрессии количества НГ и их основных функций необходимо введение ЦФ в дозе 0,5 мг/кг веса мышей с оценкой количества НГ, розеткообразующей и фагоцитарной их функции - через 15 минут после введения, а функций микробицидных систем - через 1 час.

Медико-социальный эффект от применения указанного способа определяется улучшением подбора адекватных иммунокорректоров на 38%.

Пример. Мышам F₁(CBAxC57B1) весом 25 г вводили однократно внутрибрюшинно циклофосфан в концентрации 0,5 мг/кг веса в 0,5 мл физраствора. Через 15 мин (на пике развития депрессии количества НГ, рецепторной и фагоцитарной функции) вводили препарат - галоперидол, известный своей иммуномодулирующей активностью. Через 1 час после введения циклофосфана (на пике депрессии кислородзависимых механизмов микробицидных систем) также вводили галоперидол. Через 1 час животных забивали декапитацией, выделяли НГ, определяли их количество и оценивали их основные функции. Результаты свидетельствовали о том, что галоперидол ликвидировал экспериментальную иммунодепрессию системы НГ, индуцированную циклофосфаном (чертеж).

Формула изобретения

Способ моделирования иммунодефицитного состояния по системе нейтрофильных гранулоцитов на экспериментальных животных, включающий создание депрессии количества нейтрофильных гранулоцитов (НГ) и их основных функций, отличающийся тем, что иммунодефицитное состояние по системе НГ создают путем внутрибрюшинного введения циклофосфамида из расчета 0,5 мг/кг и максимальную депрессию количества циркулирующих в периферической крови НГ, рецепторной и флагоцитарной функции получают через 15 мин, а максимальную депрессию функций микробицидных систем через 1 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2