Способ получения иммуноглобулинов для лечения чумы ("иммуночум"), или парвовирусного энтерита ("иммунопарв"), или аденовирусного гепатита ("иммуногепс") плотоядных

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии и может быть использовано при получении иммуноглобулинов для лечения чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных. Сущность заключается в иммунизации животных-доноров (овец или коз) культуральным вирусным антигеном вначале подкожно с неполным и полным адъювантами Фрейнда, а затем без адъюванта Фрейнда с разовой дозой на всех этапах иммунизации (10:25) мл и титром антигена не ниже 5 lg LD₅₀, заборе крови у доноров периодически после достижения титра антител в крови не менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации для вирусов чумы или аденовирусного гепатита плотоядных и не менее 1:512 в реакции торможения гемагглютинации для парвовирусного энтерита. Далее животных-доноров периодически ревакцинируют с тем же титром и дозой антигена без адъюванта Фрейнда. Иммуноглубулины выделяют осаждением их солями с последующей очисткой препаративной хроматографией. Технический результат заключается в получении в больших объемах высокоочищенных иммуноглобуллинов для лечения чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных, обладающих высокой специфичностью и активностью. 1 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии и может быть использовано при получении лечебно-профилактических иммуноглобулинов против чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных.

Известен способ получения лечебно-профилактических иммуноглобулинов против столбняка, энцефаломиелита и ринопневмонии (пат. США 4911910, МКИ A 61 K 39/395, 39/40, C 07 K 15/06, опубл. 27.03.90) [1]б включающий иммунизацию животных-доноров вирусными антигенами. В качестве животных-доноров используют лошадей. Забор крови у доноров осуществляют периодически с последующим выделением иммуноглобулинов и их очисткой. Препарат вводят жеребятам в лечебно-профилактических целях против гриппа, столбняка, энцефаломиелита и ринопневмонии лошадей.

Однако полученные иммуноглобулины не имеют специфических антител к вирусам чумы, парвовирусного энтерита и вирусного гепатита плотоядных. Кроме того, лошади, используемые в качестве доноров, требуют больших затрат при их содержании, неудобны при вакцинации и заборе крови.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения лечебных иммуноглобулинов против парвовирусного энтерита собак (авт. свид. СССР 1369287, C 12 N 7/00, заявл. 29.05.86) [2] Способ включает иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм внутривенно штамма "Дан" культуральный парвовирусный энтерит собак. В качестве животных-доноров используют кроликов. После истечения двух недель после последнего введения вируса проводят обескровливание кроликов и из этой крови готовят гипериммунную сыворотку, содержащую специфические иммуноглобулины против парвовируса собак. Однако полученный препарат обладает недостаточной активностью и высокой реактогенностью, т. е. не имеет достаточной степени очистки от белков. Кроме того, использование кроликов в качестве доноров для получения большого количества иммуноглобулинов экономически не целесообразно вследствие одноразового использования, т.е. полного обескровливания после первой же иммунизации, приводящей к умерщвлению этих животных.

Задачей предлагаемого технического решения является получение в больших объемах высокоочищенных иммуноглобулинов для лечения чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных, обладающих высокой специфичностью и активностью.

Поставленная задача решается тем, что способ включает иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм культурального вирусного антигена. В качестве животных-доноров используют овец или коз. Иммунизацию вирусным антигеном проводят вначале подкожно с неполным и полным адъювантом Фрейнда, а затем без адъюванта Фрейнда. Разовая доза на всех этапах иммунизации составляет (10 - 20) мл с титром антигена не ниже 5 lg LD₅₀. Забор крови у животных осуществляют периодически после достижения титра антител в крови не менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации для вирусов чумы или аденовирусного гепатита плотоядных и не менее 1 : 512 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для парвовирусного энтерита плотоядных. Животных периодически ревакцинируют с тем же титром и дозой антигена без адъюванта Фрейнда. Иммуноглобулины выделяют осаждением их солями с последующей очисткой препаративной хроматографией.

Использование в качестве животных-доноров овец или коз позволяет получать сыворотки с высоким содержанием лечебных иммуноглобулинов, т.к. указанные животные обладают повышенной реактивностью к антигенам чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Кроме того овцы и козы более удобны в содержании и при заборе крови по сравнению с волами или лошадьми [1] и позволяют по сравнению с кроликами-донорами [2] многократный забор крови в больших количествах. Предлагаемая схема иммунизации с подкожным введением доз антигена с неполным и полным адъювантами Фрейнда позволяет повысить разовую дозу вводимого антигена с одновременным снижением его токсичности и реактогенности. При снижении разовой дозы менее 10 мл и титра антигена ниже 5 lg LD₅₀ значительно снижается эффективность иммунизации и выход иммуноглобулинов. Увеличение дозы вводимого антигена более 25 мл приводит к ухудшению состояния организма донора при незначительном увеличении титра антител. Доза антигена 20 мл является оптимальной. Забор крови у животных экономически не целесообразен, если титр антител в этой крови менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации для вирусов чумы и аденовирусного гепатита плотоядных и титр антител менее 1 : 512 в РТГА для парвовирусного энтерита плотоядных.

Способ получения лечебных иммуноглобулинов осуществляют следующим образом.

Пример 1. Животных-доноров, которыми являются здоровые овцы или козы, иммунизируют вирусным антигеном чумы плотоядных, приготовленным из крови или слизистых выделений больных животных. Схема иммунизации следующая. Первую вакцинацию проводят подкожно дозой антигена объемом 20 мл и титром антигена 5 lg LD₅₀ с неполным адъювантом Фрейнда (1 : 1). Вторую вакцинацию проводят через 2 недели при подкожном введении антигена с полным адъювантом Фрейнда (1 : 1). Объем дозы и титр антигена те же. Третью вакцинацию проводят через 2 недели с внутримышечным введением антигена без адъюванта Фрейнда. Через две недели после третьей прививки у животных-доноров формируется грундиммунитет, который характеризуется наличием специфических антител. Для вируса чумы плотоядных титр антител в крови проверяется на чувствительных животных-хорьках. Если титр антител в крови животных-доноров равен или более 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации, то приступают к забору крови у животных объемом от 0,5 до 1 литра. Забор крови осуществляют периодически, как правило, через 1 месяц. Через 2 недели после забора крови проводят ревакцинацию животных-доноров с дозой антигена 20 мл и титром антигена 5 lg LD₅₀ без адъюванта Фрейнда. Ревакцинацию осуществляют также периодически через 1 месяц. Далее кровь центрифугируют и получают гипериммунную сыворотку. Иммуноглобулины осаждают 20%-ным сульфатом аммония с последующей их очисткой препаративной хроматографией на сефадексе G-100. За счет разбавления при хроматографической очистке объем препарата увеличивается в 1,5 раза. Чистота выхода продукта 97%, что позволяет его использовать не только для внутримышечного, но и для внутривенного введения, что ускоряет процесс лечения заболевших животных.

Пример 2. Для получения лечебных иммуноглобулинов против аденовирусного гепатита плотоядных животных-доноров иммунизируют также, как в примере 1. Титр антител в крови доноров (овец или коз) проверяют на чувствительных животных-щенках собак (до 5 мес.) или песцов. Периодический забор крови проводят после достижения титра антител в крови животных-доноров не менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации, очистку иммуноглобулинов осуществляют так же, как в примере 1.

Пример 3. Для получения лечебных иммуноглобулинов против парвовирусного энтерита плотоядных схему иммунизации проводят так же, как в примере 1. Титр антител в крови животных-доноров (овец или коз) проверяют по РТГА с эритроцитами свиньи. Периодический забор крови после достижения титра антител в крови животных-доноров не менее 1 : 512 в реакции торможения гемагглютинации. Очистку иммуноглобулинов осуществляют так же, как в примере 1.

Пример 4. Свойства полученных иммуноглобулинов против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита излучались на мышах. Препараты вводились мышам объемом 1 - 3 мл. Результаты исследований приведены в таблице. Из таблицы видно, что препараты нетоксичны, обладают высокой активностью и низкой реактогенностью, что соответствует ТУ-10.07.04.92 и ТУ-10.07.03.92. В процессе препаративной хроматографии объем препарата увеличивается в 1,5 раза с сохранением его активности. По сравнению с прототипом предлагаемые лечебные препараты обладают пониженной реактогенностью. В прототипе одновременно с гипериммунной сывороткой вводят антигистаминные препараты, чтобы уменьшить реакцию организма на неочищенный препарат.

Пример 5. Предлагаемые препараты против чумы ("Иммуночум"), или парвовирусного энтерита ("Иммунопарв"), или аденовирусного гепатита ("Иммуногепс") являются моноспецифическими очищенными иммуноглобулинами, которые наиболее выгодно применять при точно диагностированном заболевании.

Препарат "Иммуночум" успешно применяется при ликвидации чумы плотоядных на песцовой звероферме МП "Прогресс" г. Армавира Краснодарского края в сентябре - октябре 1993 г. Серологически (методами РГА и РТГА) был исключен парвовирусный энтерит плотоядных. На основании клинических и патоморфологических признаков был поставлен диагноз - чума плотоядных. С таким диагнозом пало 5 песцов. Для предотвращения дальнейшего развития эпизоотии на ферме было проведено однократное внутримышечное введение всему поголовью песцов лечебной дозы препарата "Иммуночум" с титром в реакции нейтрализации 3 lg. После однократного введения "Иммуночума" наблюдалось прекращение падежа животных, хотя непродолжительное время отмечались пониженный аппетит и вялость у некоторых песцов. Это позволяет рекомендовать использование данного препарата в качестве лечебного для борьбы с чумой плотоядных при промышленном и индивидуальном содержании ценных пушных зверей.

В течение трех месяцев 1993 г. в Новосибирском опытном охотничьем хозяйстве, занимающемся разведением Западно-Сибирской лайки (пос. Кубовая, Новосибирская обл. ), наблюдалась эпизоотия парвовирусного энтерита, диагноз которого был поставлен на основании клинической картины и патологоанатомически при вскрытии. Позднее диагноз был подтвержден серологическими методами. Щенкам всех лаек в питомнике внутримышечно, двукратно с интервалом 12 часов были введены лечебные иммуноглобулины "Иммунопарв" с титром в РТГА 1 : 512. Параллельно проводилась ревакцинация всего взрослого поголовья лаек в питомнике против парвовирусного энтерита. Такое использование препарата "Иммунопарв" дало положительный результат: в течение месяца смертность щенков-отъемышей снизилась с 95% до 5 - 7%. Последующее наблюдение в течение 8 месяцев показало, что в некоторых пометах встречались спорадические случаи парвовирусного энтерита, но своевременным использованием предлагаемого препарата их удавалось быстро локализовать и лечить. Данные результаты позволяют рекомендовать аналогичную схему лечения в питомниках собак, на лисьих, песцовых и норочьих фермах.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и иммунологии.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинов для лечения чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных, включающий иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм культурального вирусного антигена с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител, после чего осуществляют забор крови с последующим выделением из нее специфических иммуноглобулинов, отличающийся тем, что в качестве животных-доноров используют овец или коз, иммунизацию вирусным антигеном проводят вначале подкожно с неполным и полным адъювантом Фрейнда, а затем без адъюванта Фрейнда с разовой дозой на всех этапах иммунизации (10 - 25) мл и титром антигена не ниже 5 lg LD₅₀, забор крови у животных осуществляют периодически после достижения титра антител в крови не менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации для вирусов чумы или аденовирусного гепатита плотоядных и не менее 1:512 в реакции торможения гемагглютинации для парвовирусного энтерита с последующей периодической ревакцинацией животных с тем же титром и дозой антигена без адъюванта Фрейнда, причем иммуноглобулины выделяют осаждением их солями с последующей очисткой препаративной хроматографией.

РИСУНКИ

Рисунок 1