Производные полипептидов, способ блокирования кальциевых каналов в клетке

 

Использование: в медицине для лечения заболеваний и состояний у млекопитающих в которых посредничает кальциевый канал. Сущность изобретения : производные полипептидов общей формулы I [A₁-A₅] - [B₆-B₁₀] - [C₁₁ - C₁₅] - [D₁₆ - D₂₀] - [E₂₁ - E₂₅] - [F₂₆ - F₃₀] - [G₃₁ - G₃₅] Z, где A: A₁-A₄ = Leu-Phe-Glu-Cys, Cys-Leu-Gly-Glu-, Cys-Ala-Glu-Phe-, Ser-Cys-Gly-His-, Leu-Ile-Glu-Cys-, A₅= Ala, Val, Gln, Asn; B: B₆- B₉= - Leu-Ser-Cys-Asp-, Ser-Lys-Cys-Lys-, Gly-Thr-Pro-Cys-, -Val-Pro-Cys-Asp-, -Phe-Ser-Cys-Asp-, B₁₀= Ile, Lys, Glu; C: C₁₁-C₁₄= -Lys-Lys-Asn-Gly-, Asp-Ser-Gly-Cys, -Lys-Asn-Trp-Asp-, Thr-Lys-Asn-Gly-; C₁₅= Lys, Cys; Asp-Arg-Pro-Asn-,D: D₁₆-D₁₉=-Pro-Cys-Lys-Pro-, -Gly-Thr-Leu-Glu-, -Cys-Lys-Gly-Lys-, -Cys-Ser-Lys-Thr, D₂₀= Cys, Val, Gly, Lys; E: E₂₁-E₂₄= -Gly-Glu-Lys-Lys-, -Ser-Pro-Thr-Trp-, -Cus-Leu-Glu-Pro-, E₂₅ = Cys, Lys, Trp, Thr; F: F₂₆-F₃₀=-Ser-Gly-Gly-Trp-, -Trp-Cys-Val-Tyr-, -Lys-Leu-Cys-Ala-, -Gly-Tyr-Gly-Arg-, F₃₀= Arg, Cys, Pro, Tyr; G: G₃₁-G₃₄=-Cys-Lys-Ile-Asn-, -Ser-Pro-Phe-, -Glu-Ser-Pro-Phe-, -Tyr-Ala-Ser-Tyr- -Cys-Leu-Lys-Val-, G₃₅=Phe, Tyr, простая связь; Z =OH, -Cys-Leu-Lys-ValOH, -Cys-Leu-Lys-IleOH, -Ser-Tyr-Lys-Thr-LeuOH, причем шесть цистеиновых остатков остатков в соединении I соединенных дисульфидными связями. Способ блокирования кальциевых каналов в клетке путем введения в клетку эффективного количества полипептида по п.1. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 9 табл.

Настоящее изобретение относится к полипептидам, обнаруженным в ядре паука Theraphosidae aphonopelma, и к полипептидам, имеющим, по существу, такую же аминокислотную последовательность, и, по существу, такую же активность, как и упомянутые полипептиды. Полипептиды и их фармацевтически приемлемые соли блокируют кальциевые каналы в клетках, включая клетки нервные и мышечные, различных организмов, в том числе беспозвоночных и позвоночных. Настоящее изобретение также относится к применению упомянутых полипептидов и их солей для блокирования, самого по себе, кальциевых каналов в клетках, таких как клетки и мышечной систем организма, и для лечения заболеваний и состояний у млекопитающего, в которых посредничает кальциевый канал. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим упомянутые полипептиды и их соли.

Соединения, которые являются антагонистами кальция, имеют разнообразное применение. Антагонисты кальция могут находить применение в клиниках для лечения таких состояний, среди прочих, как стенокардия, гипертензия, кардиомиопатия, наджелудочковая экстрасистолия, пищеводная ахалазия, преждевременные роды и болезнь Рейно. См., например, работу W.G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishers, New Jork, NY 1988, которая включена в настоящее в качестве ссылки. Кроме того, такие соединения полезны при исследовании физиологии таких клеток, как нервные и мышечные клетки.

Полипептид, выделенный из ядра тарантула, с теми же свойствами, что и последовательность SEQ ID NO: 1, раскрывается в Biol. Chem. Hoppe-Seyler, vol. 370(5), 484-98 (1989). Этот пилипептид показывает 79,5%-ную гомологию (31/39 аминокислот) с SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение касается полипептидов, обнаруженных в яде паука Theraphosidae aphonopelma. Полипептиды настоящего изобретения и фракции, в которых они присутствуют, в соответствии с настоящим изобретением, перечислены далее.

Пептид Aphonopelma 6-6 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Пептид Aphonohelma 6-8 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

Пептид Aphonopelma 7-6,1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

Пептид Aphonohelma 7-13,1, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Пептид Aphonopelma 7-13,2, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

Пептид Aphonopelma 7-15,2, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

Пептид Aphonopelma 7-17,1, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

Пептид Aphonopelma 7-17,3, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

Пептид Aphonopelma 7-17,4, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.

Полипептиды настоящего изобретения блокируют кальциевые каналы в клетках. Соответственно, такие полипептиды пригодны для блокирования кальциевых каналов в клетках, самого по себе. Такие полипептиды также пригодны для борьбы с беспозвоночными паразитами (вредителями), и для лечения заболеваний или состояний у млекопитающих, передаваемых через функционирование кальциевых каналов в клетках.

Также в объем настоящего изобретения входят полипептиды, которые, по существу, имеют такую же аминокислотную последовательность, и, по существу, такую же активность при блокировании кальциевого канала, как и описанные выше полипептиды.

Подробное описание изобретения.

Яд паука Theraphosidae aphonopelma получают извлечением при электростимуляции в соответствии со стандартными методами, хорошо известными специалистам в этой области техники. Предлагается, что используемый метод является таким методом, который гарантирует от загрязнения яда абдоминальным извержением или гемолимфой. Такие способы также хорошо известны специалистам в этой области техники. Полученный таким образом цельный яд хранят в замороженном состоянии при -78^oC до тех пор, пока не используют его для очистки, как описано ниже. Очистку составляющих от цельного яда осуществляют жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной фазой на различных препаративных и полупрепаративных колонках, таких как колонки C-4 и C-18 Vydac Vydac® (Rainin Instrument Co. Inc, Mack Rodd, Woburn Massachusetts 01801). Определяют монохроматический пик при 220-230 нм. Дальнейший анализ фракций может быть осуществлен, например, по данным немонохроматического УФ, полученным с помощью диодного матричного детектора (diode array detector /Waters 9901 Millipore Corporation, Waters Chromatographe Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Фракции из колонок собирают известными способами, такими как с применением коллектора фракций ISCO/"FOXY" и детектора пика ISCO 2159 (IS CO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Фракции собирают в емкости соответствующего размера, такие как лабораторная полиэтиленовая посуда. Концентрирование фракций затем осуществляют лиофилизацией из элюента с последующей диофилизацией из воды. Чистота полученных в результате составляющих фракций затем может быть определена хроматографическим анализом с использованием аналитической колонки с градиентной системой, которая является более изократной, чем система, используемая на конечной очистке фракций.

Полипептиды изобретения могут быть секвенированы в соответствии с известными способами. Общая стратегия определения первичной структуры включает, например, перечисленные далее стадии. 1) Восстановление и S-пиридилэтилирование связанных дисульфидным мостиком остатков цистеина для усиления чувствительности субстрата к ферментной атаке. 2) Контролируемое отщепление пептида через одно- или многостадийное ферментативное переваривание. 3) Выделение и очистка пептидных фрагментов через жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной фазой. 4) Исследование пептидных фрагментов посредством N-концевого секвенирования и масс-спектрометрией с распылением ионов.

В ходе исследований S - пиридилэтилирование цистеиновых остатков полипептидов может быть осуществлено, например, в растворе, с последующим определением амино-кислотной последовательности в полипептидах. Одна из таких процедур S-пиридилэтилирования может быть осуществлена так, как описано ниже.

От 1 до 10 мкг полипептида растворяют, или разбавляют, в объеме до 50 мкл буфера, приготовленного путем смещения 1 части 1М трис-HCl, pH 8,5, содержащего 4 мМ ЭДТА, и 3 частей 8М гидрохлорида гуанидина (гуанидин.HCl). Добавляют 2,5 мкл 10% водного 2-меркаптоэтанола, и смесь инкубируют при комнатной температуре в темноте и в атмосфере аргона в течение двух часов. После инкубации добавляют 2 мкл 4-винилпиридина (свежий реагент, хранящийся в атмосфере аргона при -20^oC) и смесь инкубируют еще в течение двух часов при комнатной температуре в темноте и в атмосфере аргона. Смесь затем обессоливают, предпочтительно, путем хроматографии на короткой колонке для обращенно-фазовой хроматографии. Извлеченный алкилированный полипептид затем секвенируют известными способами.

Преимущество, которое создает настоящее раскрытие в отношении пептидов, присутствующих во фракциях 6-6, 7-6.1, 7-13.1, 7-13.2, 7-15.2, 7-17.1, 7-17.3, 7-17.4 яда Therapho·Sidae aphonopelma, состоит в том, что теперь существует возможность получать упомянутые пептиды способами, иными, чем выделение и очистка из цельного яда. Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием методов рекомбинантных ДНК через клонирование кодирующей последовательности для упомянутых полипептидов или их частей (участков). Например, пробы по гибридизации на основании информации об известной теперь аминокислотной последовательности упомянутых полипептидов могут быть использованы, в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в этой области техники, чтобы клонировать кодирующую последовательность для целого полипептида. Сочетание методов рекомбинантной ДНК и синтез белка in vitro также может быть использовано для получения полипептидов настоящего изобретения. Такие методы синтеза белка in vitro включают, но не ограничиваются этим, применение синтезатора пептидов для синтеза в твердой фазе ABL 4304 (Applied Biosystems, Inc., 850 Linclon Center Drive Foster City, California 94404), использующего стандартные химические процессы по Мерифилду или другие химические процессы в твердой фазе, хорошо известные специалистам в этой области техники.

В технике хорошо известно, что в полипептидах могут быть произведены некоторые замены аминокислот, которые не влияют, или по существе не влияют, на функции упомянутых полипептидов. Точные замены, которые возможны, изменяются от полипептидов к полипептиду. Определение допустимых замен осуществляют в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в этой области техники. Таким образом, все полипептиды, имеющие, по существу, одну и ту же аминокислотную последовательность, и по существу, одну и ту же активность блокирования кальциевого канала, входят в объем настоящего изобретения.

Полипептиды настоящего изобретения блокируют кальциевые каналы в различных клетках, таких как клетки нервной и мышечной системы у беспозвоночных и позвоночных.

Способность полипептидов настоящего изобретения блокировать кальциевые каналы демонстрируется следующим способом. Мозжечковые тучные клетки получают из мозжечка 8-дневных крыс (Wilkin etal, Brain Res, 115, 181-199, 1976). Квадратики (1 см²) аклара (Aclar) (Proplastic Inc., 5033, Industrial Ave., Wall, NJ 07719) покрывают поли-L-лизином и помещают в 12-ячеичные планшеты, которые содержат 1 мл базальной среды Игла. Клетки разобщают, и аликвоты, содержащие 6,25·10⁶ клеток, добавляют в каждую ячейку, содержащую квадраты Aclar. Через 24 часа после посева добавляют ситозин-бета-D-арабинофуранозид (конечная концентрация 10 мкМ). Клетки используют для анализа фура 2 (fura 2) на 6, 7 и 8 день выращивания. Клетки (связанные с квадратиками Aclar) переносят в 12-ячеичные планшеты, содержащие 1 мл 2 мкМ фура2/АМ (Molecular Probes. Inc. , Eugene, OR 97402) в HEPES-буфере (содержащем 001% альбумина коровьей сыворотки, 0,01% декстрозы, pH 7,4, свободный от магния). Клетки инкубируют в течение 40 минут при 37^oC, буфер, содержащий фура2/АМ удаляют, и замещают 1 мл такого же буфера без фура2/АМ. В кварцевую кювету добавляют 2,0 мл предварительно нагретого буфера (37^oC). Клетки на Aclar помещают в кювету, и кювету погружают в термостатированную (37^oC) камеру, снабженную магнитной мешалкой, и замеряют флуоресценцию флуоресцентным спектрофотометром (Biomedical Instrument Group, University of Penn sylvania). Допускается стабилизация флуоресцентного сигнала в течение 2 минут. Затем в кювету добавляют 5-20 мкл исходного раствора исследуемого соединения в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР, pH 7,4) при соответствующей концентрации. Калибровку флуоресцентных сигналов и коррекцию на потери из-за фура2/АМ осуществляют, используя методики, разработанные Nemeth et al., J. Biol. Chem. , 262, 5188 (1987), по окончании каждого испытания. Определяют величину максимальной флуоресценции (F_max), добавляя иономицин (35 мкМ), и величину минимальной флуоресценции (F_min) определяют при последующем добавлении EGTA (12 мМ) для образования хелатного соединения кальция. При использовании описанной выше методики блокирование кальциевого канала исследуемым полипептидом демонстрируется уменьшением флуоресценции при добавлении исследуемого полипептида. При таком испытании полипептиды изобретения показывают низкие значения IC₅₀ для блокирования кальциевого канала при 200 нм. Для сравнения, два известных коммерческих антагониста кальциевого канала - нифедипин и верапамил - имеют значения IC₅₀ при 33 нм и 4800 нм, соответственно.

Полипептиды настоящего изобретения полезны в качестве блокаторов кальциевого канала в клетках per se. Как таковые, такие полипептиды также полезны при борьбе с беспозвоночными паразитами и при лечении заболеваний и состояний у млекопитающих, в которых посредничает кальциевый канал клеток, таких как стенокардия, гипертензия, кардиомиопатия, наджелудочковая экстрасистолия, пищеводная ахалазия, преждевременные роды и болезнь Рейно. Кроме того, эти полипептиды пригодны при исследовании физиологии клеток, включая, но не ограничиваясь, клетки нервной, мышечной и сердечнососудистой систем.

В сферу настоящего изобретения входят также фармацевтически приемлемые соли полипептидов настоящего изобретения. Такие соли образуются способами, хорошо известными специалистам в этой области техники. Например, соли присоединения кислот полипетидов могут быть получены традиционными способами.

Когда полипептид настоящего изобретения должен вводиться млекопитающему, он может быть введен один или в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, в фармацевтической композиции, в соответствии со стандартной фармацевтической практикой. Полипептиды могут вводиться перорально или парентерально, причем парентеральный путь введения является предпочтительным для полипептидов. К парентеральному введению относятся внутривенное, внутримышечное, интраперитонеальное, подкожное и местное введение.

При пероральном применении полипептида настоящего изобретения соединения может вводиться, например, в форме таблеток или капсул, или в виде водного раствора или суспензии. В случае таблеток для перорального применения обычно используют носители, которые включают лактозу и кукурузный крахмал, и обычно добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального применения в форме капсул пригодными разбавителями являются лактоза и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент сочетают с эмульгаторами и суспендирующими агентами. Если желательно, могут быть добавлены подслащиватели и/или придающие вкус вещества.

Для внутримышечного, интрперитонеального, подкожного и внутривенного применения готовят обычным образом стерильные растворы активного ингредиента, и pH раствора должен быть отрегулирован и сбуферирован. При внутривенном применении общая концентрация растворяемых должна быть отрегулирована, чтобы препарат был изотоническим.

Когда полипептид настоящего изобретения или его соль применяют для человека, дневная доза определяется, естественно, предписаниями врача. Кроме того, дозировка будет изменяться в соответствии с возрастом, весом и откликом отдельного пациента, так же, как и тяжесть симптомов пациента и эффективностью конкретного соединения, которое назначается.

Когда полипептид или его соль, по настоящему изобретению, используют для борьбы с беспозвоночными паразитами, упомянутый полипептид вводят непосредственно упомянутому беспозвоночному, или обрабатывают среду, окружающую упомянутое беспозвоночное. Например, соединение настоящего изобретения может быть распрыскано в виде раствора на упомянутое беспозвоночное. Количество соединения, необходимое для борьбы с упомянутым беспозвоночным, будет изменяться в соответствии с природой беспозвоночного и условиями окружающей среды, и будет определяться тем, кто применяет соединение.

Когда полипептид или его соль, по настоящему изобретению, применяют для физиологического исследования клеток, упомянутый полипептид вводят в клетки способами, хорошо известными специалистам в этой области. Например, упомянутый полипептид может быть введен в клетки в подходящем физиологическом буфере. Подходящая концентрация полипептида настоящего изобретения для применения в таких исследованиях составляет 200 мкМ. Однако концентрация упомянутого полипептида при таких исследованиях может быть больше или значительно меньше 200 мкМ. Количество вводимого полипептида будет определяться специалистом в соответствии с хорошо известными способами.

Примеры.

Стадия I. Фракционирование сырого яда Aphonopelma.

Сырой яд Theraphosidae aphonopelma (≈ 40 мкл) вносят в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 22 х 250 мм), и работают, используя программу двухфазного линейного градиента от 95% A и 5% B до 80% A и 20%B в течение 30 мин, и затем от 80% A и 20% B до 30% A и 70% B в течение 25 мин (A = 0,1% трифторуксусная кислота, (TFA). B = ацетонитрил) с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 15 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 1.

Фракция 6 - 35,9 - 37,3 мин Фракция 7 - 37,3 - 39,5 мин Фракция 8 - 39,5 - 40,1 мин Фракция 9 - 40,1 - 40,9 мин Фракция 10 - 40,9 - 41,8 мин Каждую из упомянутых выше фракций, из серии опытов, концентрируют лиофилизацией. Дальнейшее фракционирование выполняют так, как описано ниже.

Стадия II. Субфракционирование (разделение на более мелкие фракции) фракций стадии I.

A) Субфракционирование фракции 6.

Вещество фракции 6 со стадии I, описанной выше, полученное из ≈ 60 мкл сырого яда, вносят в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Baker WP C-18, 4,6 х 250 мм), и работают, используя программу линейного градиента от 85% A и 15% B до 65% A и 35% B в течение 45 мин (A = 0,1 TFA, B = ацетонитрил) с детекцией при 220 нм и при скорости потока 1,0 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 2.

Фракция 6 - 6 - 24,0 - 24,8 мин Фракция 6 - 7 - 25,0 - 25,4 мин Фракция 6 - 8 - 25,6 - 26,5 мин Фракция 6 - 9 - 27,0 - 28,7 мин Фракция 6 - 13 - 33,5 - 34,3 мин
Фракция 6 - 14 - 34,4 - 35,4 мин
Каждую из упомянутых фракций, из серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

B) Субфракционирование фракции 7.

Вещество фракции 7 со стадии 1, описанной выше, полученное из ≈ 60 мкл сырого яда, вносят в колонку с сильным катионитом (сульфоэтиласпартамид (The Nest Group, 45 Vabley Rd., Southborough, MA 01772), 5 мкм, 4,6 х 200 мм), и работают по программе с линейным градиентом от 100% A и 0% B до 0% A и 100% B в течение 45 мин (A = 5 мМ H₃PO₄) 20% ацетонитрила, B = 5 мМ H₃PO₄, 1,0 N NaCl (20% ацетонитрила) с детекцией при 230 нм и скорости потока 1,0 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 3.

Фракция 7 - 6 - 21,9 - 22,3 мин
Фракция 7 - 9 - 24,8 - 25,5 мин
Фракция 7 - 11 - 26,1 - 26,7 мин
Фракция 7 - 12 - 27,1 - 27,6 мин
Фракция 7 - 13 - 27,6 - 28,9 мин
Фракция 7 - 14 - 29,7 - 30,8 мин
Фракция 7 - 15 - 31,0 - 32,3 мин
Фракция 7 - 16 - 32,5 - 33,1 мин
Фракция 7 - 17 - 34,2 - 36,0 мин
Каждую из упомянутых выше фракций, из серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

C) Субфракционирование фракции 8.

Вещество фракции 8 со стадии I, описанной выше, полученное из ≈ 100 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают по программе линейного градиента от 80% A и 20% B до 71% A и 29% B в течение 35 мин, и затем, в течение 10 минут, с 71% A и 29% B (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и при скорости потока 0,6 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 4.

Фракция 8 - 5 - 19,2 - 21,2 мин
Фракция 8 - 6 - 21,3 - 22,5 мин
Фракция 8 - 7 - 25,9 - 26,5 мин
Фракция 8 - 8 - 27,4 - 28,3 мин
Каждую из упомянутых выше фракций, из серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

Стадия III. Субфракционирование фракций стадии II.

A) Субфракционирование фракции 7 - 6.

Вещество фракции 7 - 6 со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 70 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают по программе с линейным градиентом - 90% A и 10% B в течение 10 мин, затем - от 90% A и 10% B до 60% A и 40% B в течение 40 мин (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока, 3,5 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 5.

Фракция 7 - 6,1 - 32,2 - 34,3 мин
Фракция 7 - 6,2 - 35,5 - 36,2 мин
Каждую из упомянутых выше фракций, из серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

B) Субфракционирование фракции 7 - 9,
Вещество фракции 7 - 9 со стадии II-B, описанной выше, полученное ≈ 300 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают по программе линейного градиента в течение 10 мин - с 90% A и 10% B, и затем - от 90% A и 10% B до 65% A и 35% B в течение 40 мин (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 3,5 мл/мин. Собирают фракцию 7 - 9,1 и объединяют из разных опытов, при времени элюирования от 33 до 35 мин.

C) Субфракционирование фракции 7 - 11.

Вещество фракции 7 - 11 со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 600 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают по программе с линейным градиентом - в течение 10 минут - с 90% A и 10% B, затем - от 90% A и 10% B до 65% A и 35% B в течение 60 мин (A = 0,1%, TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 3,5 мл/мин. Собирают и объединяют фракции 7 - 11, 1 из многих опытов при времени элюирования от 34,2 до 35,5 мин.

D) Субфракционирование фракции 7 - 12.

Вещество фракции 7 - 12 со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 600 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают в течение 10 мин с 90% A и 10% B, и затем - по программе линейного градиента от 90% A и 10% B до 65% A и 35% B в течение 60 мин (A = 0,1%, TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 3,5 мл/мин. Собирают указанные ниже фракции.

Таблица 6.

Фракция 7 - 12,1 - 28,0 - 29,1 мин
Фракция 7 - 12,2 - 38,4 - 39,6 мин
E) Субфракционирование фракции 7 - 13.

Вещество фракции 7 - 13 со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 200 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают с 90% A и 10% B в течение 10 мин, затем - по программе с линейным градиентом от 90% A и 10% B до 60% A и 40% B в течение 40 мин (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 3,5 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 7.

Фракция 7 - 13,1 - 33,0 - 34,5 мин
Фракция 7 - 13,2 - 35,1 - 36,5 мин.

Каждую из перечисленных выше фракций, из серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

F) Субфракционирование фракции 7 - 15.

Вещество фракции 7 - 15 со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 200 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают с 90% A и 10% B в течение 10 мин, затем - по программе с линейным градиентом от 90% A и 10% B до 60% A и 40% B в течение 40 мин (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 3,5 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 8.

Фракция 7 - 15,1 - 33,1 - 33,6 мин
Фракция 7 - 15,2 - 34,5 - 36,2 мин
Фракция 7 - 15,3 - 37,7 - 39,1 мин.

Каждую из перечисленных выше фракций, объединенную из серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

G) Субфракционирование фракции 7 - 16.

Вещество фракции 7 - 16 со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 600 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают с 90% A и 10% B в течение 10 мин, затем - по программе с линейным градиентом от 90% A и 10% B до 65% A и 35% B в течение 60 мин (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и со скоростью потока 3,5 мл/мин. Собирают фракцию 7 - 16,1 при времени элюирования от 31,8 до 33,0 мин, и объединяют такие фракции, полученные во многих опытах.

H) Субфракционирование фракции 7 - 17.

Вещество фракции 7 - 17, со стадии II-B, описанной выше, полученное из ≈ 25 мкл сырого яда, помещают в колонку для ЖХВР с обращенной фазой (Vydac®, C-18, 300 10 х 250 мм), и работают с 90% A и 10% B в течение 10 мин, и затем - по программе с линейным градиентом от 90% A до 10% B до 60% A и 40% B в течение 40 мин (A = 0,1% TFA, B = ацетонитрил), с детекцией при 220 нм и при скорости потока 3,5 мл/мин. Собирают фракции, как указано ниже.

Таблица 9.

Фракция 7 - 17,1 - 15,6 - 18,4 мин
Фракция 7 - 17,2 - 18,5 - 19,4 мин
Фракция 7 - 17,3 - 27,1 - 28,6 мин
Фракция 7 - 17,4 - 28,6 - 30,1 мин
Фракция 7 - 17,5 - 30,1 - 31,9 мин
Фракция 7 - 17,6 - 31,9 - 33,5 мин.

Каждую из упомянутых выше фракций, полученную в серии опытов, концентрируют лиофилизацией.

Пример 1. Пептид Aphonopelma 6-6.

Структуру пептида 6-6, полученного на стадии II-A, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1 - 10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. N-концевое секвенирование осуществляют на импульсном жидкостном (pulse - liquid) секвенаторе (ABI) как в случае природного так и в случае восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масспектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 6-6 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID NO:1, 39 остатков, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 4382.3.

Наблюдаемая масса = 4382,16 ± 0,54 (м.-с. с ион. расп.).

Пример 2. Пептид Aphonopelma 6-8.

Строение пептида 6-8, полученного на стадии II-A, описанной выше, определяют и подтверждают следующими способами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1 - 10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, три трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном жидкостном секвенторе (ABI) как природного, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III>
Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 6 - 8 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID NO:2, 39 остатков, 6 цистеинов,3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 4369,2.

Наблюдаемая масса = 4368,26 ± 0,27 (м.-с. с ион. распыл.)
Пример 3. Пептид Aphonopelma 7-6.1.

Строение пептида 7-6,1, полученного на стадии III-A, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1 - 10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном жидкостном секвенаторе (ABI) как природного, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III>
Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 7-6,1 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID NO:3, 33 остатка, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 3786,2.

Наблюдаемая масса = 3784,54 (м.-с. с ион. распыл.)
Пример 4. Пептид Aphonopelma 7-13.1.

Строение пептида 7-13,1, полученного на стадии III-E, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1-10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование как природного пептида, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида на импульсном жидкостном секвенаторе (ABI). Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают что пептид 7-13,1 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ IDNO: 4,34 остатка, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 3814,32
Наблюдаемая масса = 3813,67 ± 0,27 (м.-с. с ион. распыл.)
Пример 5. Пептид Aphonopelma 7-13.2.

Строение пептида 7-13.2, полученного на стадии III-E, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1-10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном жидкостном секвенаторе (ABI) как природного пептида, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 7-13,2 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID NO:5,42 остатка, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 4844,45.

Наблюдаемая масса = 4844,66 (м.с.-с., с ион. распыл.).

Пример 6. Пептид Aphonopelma 7-15.2.

Строение пептида 7-15.2, полученного на стадии III-F, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ 1-10 нмоль, используя систему Waterrs Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном жидкостном секвенаторе (ABI) как природного, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 7-15.2 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID NO:6,39 остатков, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 4342,19.

Наблюдаемая масса = 4341,84±0,33 (м.-с., с ион. распыл.)
Пример 7. Пептид Ahhonopelma 7-17.1.

Строение пептида 7-17.1, полученного на стадии III-H, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1-10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном секвенаторе (ABI) как природного, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 7-17.1 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID N0:7,39 остатков, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 4383,28.

Наблюдаемая масса = 4382,33±0,52 (м.-с. с ион. распыл.)
Пример 8. Пептид Aphonopelma 7-17.3.

Строение пептида 7-17.3, полученного на стадии III-H, описанный выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ на 1-10 нмоль, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном жидкостном секвенаторе (ABI) как природного, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 7-17.3 имеет строение, показанное ниже.

Последовательность SEQ ID N0:8.

Наблюдаемая масса = 4368,23±0,47 (м.-с. с ион. распыл.).

Пример 9. Пептид Aphonopelma 7-17.4.

Строение пептида 7-17.4, полученного на стадии III-H, описанной выше, определяют и подтверждают следующими методами. Проводят РТС аминокислотный анализ, используя систему Waters Pico-Tag, при трехкратном повторе. Осуществляют N-концевое секвенирование на импульсном жидкостном секвенаторе (ABI) как природного, так и восстановленного и пиридилэтилированного пептида. Данные масс-спектрального анализа получают на масс-спектрометре с ионным распылением SCI-EX API III.

Полученные данные, все вместе, подтверждают, что пептид 7-17,4, имеет показанное ниже строение.

Последовательность SEQ ID N 0:9, 39 остатков, 6 цистеинов, 3 дисульфидных связи.

Вычисленная масса = 4383,23.

Наблюдаемая масса = 4382,19±0,38 (м.-с. с ион. распыл.)
Список последовательностей
(I) Общая информация
(i) Заявитель:
(A) NAME: Pfizer Inc
(B) STREET: 235 East 42nd Street
(C) CITY: New York
(D) STATE: New York
(E) COUNTRY: U.S.A.

(F) POSTAL CODE(ZIP) : 10017
(G) TELEPHONE: [phone]
(H) TELEFAX: [phone]
(A) NAME" NPS Pharmaceuticals, Inc.

(B) STREET: 420 Chipeta Way
(C) CITY: Salt Lake City
(D) STATE: Utah
(E) CUNTRY: U.S.A.

(F) POSTAL CODE(ZIP) : 84108
(G) TELEPHONE: [phone]
(H) TELEFAX: [phone]
(ii) Название изобретения: Блокирующие кальциевый канал полипептиды
(iii) Число последовательностей: 9
(iv) Форма компьютерного считывания
(A) Тип среды: дискета
(B) Компьютер: совместимый с IBM PC
(C) Операционная система: PC-DOS/MS-DOS
(D) Программное обеспечение: PatentIn Release # 1,0, версия # 1,25 (EPO)
(vi) Сведения о предшествующей заявке:
(A) Номер заявки US 07/973323
(B ) Дата регистрации: 3 ноября 1992
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO : 1 (см. схему 1)
(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 39 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна (однонитевая)
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности:SEQ ID N 0:1
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 2 (см. схему 2).

(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 39 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 2
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 3 (см. схему 3).

(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 33 аминокислоты
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 3.

(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 4 (см. схему 4).

(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 34 аминокислоты
(B) Тип: аминокислотная
(С) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 4
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 5 (см. схему 5).

(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 42 аминокислоты
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 5
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 6 (см. схему 6).

(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 39 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 6
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 7 (см.схему 7).

(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 39 аминокислот
(B): Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iii) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 7
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 8 (см.схему 8).

(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 35 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 8
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 9 (см. схему 9).

(i) Характеристики последовательности
(A) Длина: 39 аминокислот
(B) Тип: аминокислотная
(C) Число нитей: одна
(D) Топология: линейная
(ii) Тип молекулы: пептид
(iii) Гипотетичность: нет
(iv) Античувствительность: нет
(vi) Происхождение исходного материала
(A) Организм: Theraphosidae aphonopelma
(F) Тип ткани: яд
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 9о

Формула изобретения

1. Производные полипептидов общей формулы I
[A₁-A₅] -[B₆-B₁₀]-[C₁₁-C₁₅]- [D₁₆-D₂₀]-[E₂₁-E₂₅]-[F₂₆-F₃₀]- [G₃₁-G₃₅]-Z, в которой
A: A₁-A₄ = Leu-Phe-Glu-Cys-; Cys-Leu-Gly-Glu-, Cys-Ala-Glu-Phe-, Ser-Cys-Gly-His-, Leu-Ile-Glu-Cys-;
A₅ = Ala, Val, Gln, Asn;
B: B₆-B₉ = -Leu-Ser-Cys-Asp-, -Ser-Lys-Cys-Lys-, Gly-Thr-Pro-Cys-, -Val-Pro-Cys-Asp-, -Phe-Ser-Cys-Asp-;
B₁₀ = Ile, Lys, Glu;
C: C₁₁-C₁₄ = -Lys-Lys-Asn-Gly-, -Asp-Ser-Gly-Cys-, -Lys-Asn-Trp-Asp-, -Thr-Lys-Asn-Glu-, -Asp-Arg-Pro-Asn-;
C₁₅ = Lys, Cys;
D: D₁₆-D₁₉ = -Pro-Cys-Lys-Pro-, -Gly-Thr-Leu-Glu-, -Cys-Lys-Gly-Lys-, -Cys-Ser-Lys-Thr-;
D₂₀ = Cys, Val, Gly, Lys;
E: E₂₁-E₂₄ = -Gly-Glu-Lys-Lys-, -Ser-Pro-Thr-Trp-, -Cys-Leu-Glu-Pro-;
E₂₅ = Cys, Lys, Trp, Thr;
F: F₂₆-F₃₀ = -Ser-Gly-Gly-Trp-, -Trp-Cys-Val-Tyr-, -Lys-Leu-Cys-Ala-, -Gly-Tyr-Gly-Arg-;
F₃₀ = Arg, Cys, Pro, Tyr;
G: G₃₁-G₃₄ = -Cys-Lys-Ile-Asn-, -Ser-Pro-Phe-, -Glu-Ser-Pro-Phe, -Tyr-Ala-Ser-Tyr-, -Cys-Leu-Lys-Val-;
G₃₅ = Phe, Tyr, простая связь;
Z = -OH, -Cys-Leu-Lys-ValOH, -Cys-Leu-Lys-IleOH, -Ser-Tyr-Lys-Lys-Thr-LeuOH,
причем шесть цистеиновых остатков в соединении I соединены дисульфидными связями.

2. Способ блокирования кальциевых каналов в клетке, отличающийся тем, что включает введение в клетку эффективного количества полипептида по п.1.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что клетка находится в нервной системе млекопитающего.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6